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Le document présente un projet visant à préparer et caractériser des nanoparticules de chitosane contenant de la berbérine pour le traitement du cancer. Il décrit les étapes nécessaires, l'importance de la biosécurité et les avantages potentiels de cette approche par rapport aux traitements traditionnels tels que la chimiothérapie. Les résultats escomptés et les impacts de ces nanoparticules sur la cellule cancéreuse sont également abordés.

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DÉPARTEMENT DE GÉNIE CHIMIQUE ET DE GÉNIE BIOTECHNOLOGIQUE Faculté de génie Université de Sherbrooke PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DE NANOPARTICULES DE CHITOSANE RENFERMANT DE LA BERBÉRINE POUR LE TRAITEMENT DU CANCER par ANTOINE BRIÈRE NATHANAËL CARBONNEAU SARAH DION JOCELYN MORIN SAMUEL NICOL SHIRAA NOUMBISSIE-NZEFA NICOLAS PERRON ÉLODIE VACHON LACHIVER Équipe 1B travail présenté à NATHALIE FAUCHEUX dans le cadre du cours GBT 415 Projet d’intégration I Sherbrooke NOVEMBRE 2015
  2 TABLE DES MATIÈRES 1. INTRODUCTION ..............................................................................................................................................3 1.1 CONTEXTE DE RÉALISATION DU PROJET .....................................................................................................3 1.2 OBJECTIFS ET DESCRIPTION DU PROJET GLOBAL ............................................................................................4 1.3 OBJECTIFS ET DESCRIPTION DU PROJET 1B.....................................................................................................5 1.4 INTÉRÊTS ÉCONOMIQUES DE LA RÉALISATION D'UN TEL PROJET ...................................................................6 2. MÉTHODOLOGIE ............................................................................................................................................7 2.1 PRÉPARATION DES NANOPARTICULES ............................................................................................................7 2.2 CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES ..................................................................................................10 2.2.1 Pourcentage d'encapsulation................................................................................................................10 2.2.2 Cinétique de libération..........................................................................................................................12 2.2.3 Taille et nombre de nanoparticules.......................................................................................................13 2.2.3.1 La lyophilisation.................................................................................................................................14 3. RÉSULTATS ESCOMPTÉS...........................................................................................................................16 3.1 RÉSULTATS DE LA PRÉPARATION DES NANOPARTICULES ............................................................................16 3.2 RÉSULTATS DE LA CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES ....................................................................16 4. BUDGET............................................................................................................................................................19 5. RISQUES ET MESURES DE SÉCURITÉ ....................................................................................................20 6. PLANIFICATION EXPÉRIMENTALE DE LA PROCHAINE SESSION ...............................................22 7. CONCLUSION .................................................................................................................................................23 ANNEXE................................................................................................................................................................30 A-1. PROTOCOLES DE LA PRÉPARATION DES NANOPARTICULES (IONIC CROSS-LINKING)...................................30 A-2. PROTOCOLE DE LA PRÉPARATION DE LA COURBE ÉTALON DE CHLORURE DE BERBÉRINE.........................35 A-3. PROTOCOLES DE LA CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES................................................................36 LISTE DES FIGURES FIGURE 1: TYPES DE NANOPARTICULE FRÉQUEMMENT UTILISÉS POUR LA LIBÉRATION D'UN PRINCIPE ACTIF.............................5 FIGURE 2: STRUCTURE DU TRIPOLYPHOSPHATE DE SODIUM (SIGMA-ALDRICH, SODIUM TRIPOLYPHOSPHATE)..........................7 FIGURE 3: CHITOSANE SOUS SA FORME PROTONÉE (BAHRKE ET COLL., 2003). ...........................................................................7 FIGURE 4: COMPLEXE STPP/CHITOSANE (CHIH-HUI, 2009)........................................................................................................8 FIGURE 5: STRUCTURE DU CHLORURE DE BERBÉRINE (SIGMA ALDRICH, BERBERINE CHLORIDE).............................................10 FIGURE 6: SCHÉMA DU FONCTIONNEMENT D'UN SPECTROFLUORIMÈTRE (ÉQUIPE 1B, ORAL INTERMÉDIAIRE 3)......................11 FIGURE 7: TAILLE DES NANOPARTICULES SANS BERBÉRINE (CHOU ET COLL., 2013).................................................................16 FIGURE 8: NANOPARTICULES NE FORMANT PAS D'AGRÉGATS (II) FORMANT DES AGRÉGATS (III) (CHOU ET COLL., 2013). .......17 FIGURE 9: PROPRIÉTÉS DES NANOPARTICULES SELON LES QUANTITÉS DE BERBÉRINE AJOUTÉES (CHOU ET COLL., 2013)........17 FIGURE 10: CINÉTIQUE DE LIBÉRATION DES NANOPARTICULES CONTENANT DE LA BERBÉRINE (CHOU ET COLL., 2013)..........18 LISTE DES TABLEAUX TABLEAU 1: VALEURS DES PARAMÈTRES CONSTANTS.................................................................................................................9 TABLEAU 2: LISTE D'ÉPICERIE DE L'ÉQUIPE 1B ET COÛTS AFFÉRENTS. ......................................................................................19 TABLEAU 3: MESURES DE PRÉVENTION SELON LES PRODUITS UTILISÉS. ...................................................................................20 TABLEAU 4: PROTOCOLES À EFFECTUER SELON LES SEMAINES DE LA SESSION. ........................................................................22
  3 1. INTRODUCTION 1.1 Contexte de réalisation du projet La Société canadienne du cancer estime que 196 900 Canadiens auront reçu un diagnostic de cancer d’ici la fin de l’année 2015 (Société canadienne du cancer, 2015) et que ce nombre pourrait augmenter de 40% d’ici 2030 en raison de la croissance de la population et de son vieillissement (Presse canadienne, 2015). Actuellement, trois principales méthodes sont employées afin de traiter les personnes atteintes de cette maladie, soit la chirurgie, la radiothérapie ainsi que la chimiothérapie (Ligue nationale contre le cancer, 2009). La chirurgie consiste à l’ablation de la zone tumorale en retirant partiellement ou complètement les tissus de l'organe atteint. Cette méthode est utilisée pour traiter plus de 50% des personnes atteintes d'un cancer (Société canadienne du cancer, 2015). La radiothérapie, de son côté, vise à soumettre les cellules tumo- rales à des rayonnements électromagnétiques (photons X ou gamma) ou à des rayonnements corpuscu- laires (faisceau de protons ou de neutrons) (Maranninchi et coll., 2005). Lorsqu'ils entrent en interaction avec les cellules malignes, ces rayonnements peuvent provoquer des ruptures simple-brin ou double-brin de leur ADN et, ainsi, causer leur mort (Maranninchi et coll., 2005). On estime qu'au moins deux patients sur trois auront recours à la radiothérapie durant la période de traitement de leur cancer (Maranninchi et coll., 2005). La chirurgie et la radiothérapie sont deux méthodes dites « locorégionales », car elles ciblent les cellules cancéreuses se retrouvant dans une région précise du corps du patient. Inversement, la chimiothérapie, qui implique l'administration par voie orale ou intraveineuse de substances chimiques, n'est pas une mé- thode locorégionale. Elle est utilisée pour traiter approximativement 22% des patients atteints d'un cancer (Milliman, 2013) et les principales substances qu'elle implique sont les agents alkylants, les antimétabo- lites ainsi que les vinca-alcaloïdes (Ligue nationale contre le cancer, 2009). Les agents alkylants forment des radicaux alkyles qui effectuent des liaisons covalentes avec certains des atomes des acides nucléiques (ADN et ARN). Lors de la transcription de l'ADN, la liaison avec le radical empêche la séparation adéquate des brins, ce qui entraîne une incapacité de la cellule à se diviser et, par le fait même, sa mort (Poletto, 2009). Les antimétabolites, de leur côté, se divisent en deux sous-catégo- ries ayant chacune leur propre mode d'action. Les antimétabolites « antifoliques » inhibent l'activité des enzymes essentielles à la synthèse des acides nucléiques, tandis que les antimétabolites « leurres » vont mimer une base azotée et être intégrés à l'ADN lors de sa synthèse. Pour la cellule, l'un ou l'autre de ces deux médicaments perturbe la phase S du cycle cellulaire et, ainsi, empêche sa division (Poletto, 2009). Enfin, les vinca-alcaloïdes qui sont des composés organiques provenant de différentes pervenches tropi- cales empêchent la mitose en contrant la formation du fuseau mitotique (Poletto, 2009). Il est possible que les cellules cancéreuses migrent par rapport à leur zone tumorale initiale et envahissent d’autres tissus de l’organisme. Les cellules qui agissent de la sorte se nomment « métastases » et rendent parfois nécessaire le couplage de deux ou de trois méthodes de traitement différentes (Société canadienne du cancer, 2015). De fait, pour un cancer métastatique (cancer s’étant propagé), la radiothérapie peut être employée pour éliminer la source des cellules cancéreuses, soit la tumeur d’origine, alors que la chimio- thérapie peut être utilisée avantageusement afin d’éliminer les cellules cancéreuses répandues non spé- cifiquement dans d’autres parties du corps (Ligue nationale contre le cancer, 2009). Cependant, le recours à la chimiothérapie entraîne également son lot d’inconvénients. En effet, les agents chimiques se diffu- sent dans les différents tissus de l’organisme et perturbent toutes les cellules dont la division cellulaire est rapide (Société de recherche sur le cancer, 2015). Les cellules cancéreuses, dont la division s'effectue
  4 rapidement, sont alors détruites, mais les cellules saines qui ont naturellement un rythme de multiplica- tion élevé le sont également (Société de recherche sur le cancer, 2015). Cela explique pourquoi les pa- tients traités par chimiothérapie perdent habituellement leurs cheveux. En effet, les cellules responsables de la croissance des cheveux ont une division rapide (Société de recherche sur le cancer, 2015). Outre la perte de chevelure, la chimiothérapie peut provoquer plusieurs autres effets secondaires indésirables chez le patient tel que des dommages permanents aux organes (cœur, foie, reins, organes reproducteurs, etc.) (Société canadienne du cancer, 2015). 1.2 Objectifs et description du projet global Pour contourner les inconvénients de la chimiothérapie, de nombreux chercheurs des domaines pharma- ceutiques et de la nanomédecine tentent de développer un système de libération contrôlé de médicaments (Centre national de la recherche scientifique, 2015). En d'autres mots, ceux-ci cherchent à concevoir des méthodes par lesquelles les agents chimiothérapiques sont délivrés directement aux tissus cancéreux sans toutefois atteindre et affecter les tissus sains. Le présent rapport s’inscrit dans un projet de plus grande portée dont l’objectif est similaire. De fait, ce projet vise l’élaboration d’un système de libération d’alca- loïde afin de l’utiliser dans un contexte biomédical, soit pour le traitement du cancer (Faucheux, 2015). Pour parvenir à atteindre cet objectif, trois principales phases doivent être réalisées : la préparation et la caractérisation du polymère formant la structure du système de libération du médicament, la préparation et la caractérisation du système lui-même ainsi que l’étude des effets du médicament délivré sur la survie, la prolifération et la migration des cellules cancéreuses (Faucheux, 2015). La première phase implique d’extraire de la chitine (un biopolymère de N-acétylglucosamine très abon- dant dans la nature) des carapaces de crustacés et de procéder à sa désacétylation (élimination de grou- pement acétyle sur la chaîne polysaccharidique). Lorsque le degré de désacétylation de la chitine atteint une valeur supérieure ou égale à 60 %, il est question de chitosane (Ifremer, 2010). Contrairement à la chitine, le chitosane est soluble en milieu acide et son activité antimicrobienne, sa biocompatibilité ainsi que sa biodégradabilité en font un polymère structural de choix pour le développement d'un système de libération contrôlé de médicaments (Ifremer, 2010). La deuxième phase du projet consiste à préparer des nanoparticules (c’est-à-dire un système de libération dont les dimensions sont comprises entre 1 et 100 nm) (De Jong, 2008) à partir du chitosane préalablement produit puis à y introduire de la berbérine. La berbérine est un alcaloïde hétérocyclique activant l’enzyme adénosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), ce qui lui confère un effet inhibiteur sur la migration des cellules cancéreuses. En effet, le rôle de l'AMPK est d'assurer que la cellule a des ressources d'énergie suffisantes pour se diviser (Jones et coll., 2005). Dans le cas d'un stress métabolique (déficience en glucose, par exemple), l'AMPK s'active et elle phosphoryle la protéine p53. Cette phosphorylation active la p53 et fait en sorte que le cycle de la division cellulaire est désormais régulé par la présence de cette protéine (Jones et coll., 2005). Or, il se trouve que la p53 permet la multiplication des cellules saines, mais bloque la multiplication de toutes les cellules anormales (les cellules cancéreuses, entre autres) (Katiyar et coll., 2009). Par cette chute d'acti- vation, la berbérine peut donc inhiber la prolifération des cellules cancéreuses. La berbérine a également un rôle sur la cyclo-oxygénase 2 (COX-2) qui est une enzyme qui catalyse la conversion de l'acide ara- chidonique en prostaglandine E2 (PGE2) (Xuan et coll., 2015). De son côté, PGE2 est une protéine qui peut contribuer à l'augmentation de la production de la protéine Bcl-2 qui est anti-apoptotique (elle em- pêche les cellules de se « suicider » en cas d'anormalité) (Sobolewski et coll., 2010). Ainsi, par l'inhibition de cette voie enzymatique, la berbérine contribue à limiter la prolifération et l'invasion des cellules can- céreuses. Ces effets de la berbérine seront d'ailleurs l'objet d'études lors de la troisième phase du projet, alors que les impacts de la mise en contact de cellules de mélanome murin B16F10 et des nanoparticules contenant cet alcaloïde seront analysés.
  5 1.3 Objectifs et description du projet 1B Le présent rapport traite plus profondément de la deuxième phase du projet, c’est-à-dire de la préparation, mais aussi de la caractérisation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine. La prépara- tion et l’utilisation de nanoparticules sont non seulement utiles pour contourner les revers de la chimio- thérapie, mais également pour empêcher le médicament d’être dégradé avant d’arriver à sa cible, soit les cellules cancéreuses. De fait, la berbérine est dégradée à un plus faible taux lorsqu’elle se retrouve en- capsulée dans une nanoparticule, ce qui contribue à accroître sa biodisponibilité (la vitesse et l'étendue avec lesquelles elle devient disponible à sa cible (Toutain et Bousquet-Melou, N/D)) et, par le fait même, à accroître ses effets sur les cellules cancéreuses (Xue et coll., 2013). Pour observer une inhibition de l'activité des cellules cancéreuses ou une élimination de celles-ci, l'équipe de recherche de Man Tsang et de ses collaborateurs ont effectué des essais in vivo sur des rats atteints d'un carcinome du nasopharynx en les soumettant à des doses de 5 mg/kg et de 10 mg/kg de berbérine. Leurs résultats montrent qu'à ces deux doses, la taille de la tumeur est réduite de plus de trois fois par rapport à la tumeur témoin, et ce, après 43 jours de traitement (Man Tsang et coll., 2013). De leur côté, l'équipe de recherche de Xuan et de ses collaborateurs indiquent qu'une concentration in vivo de 50, 100 et de 200 mg/kg peut significativement réduire le taux de croissance des tumeurs provenant des cellules de cancer colorectal (SW260 et LoVo) et que des concentrations in vitro de berbérine de 10, 20 et de 40 µM peut considérablement altérer la capacité de migration de ces cellules (Xuan et coll., 2015). L'équipe a également établit que les CI50 de la berbérine pour les cellules SW260 et LoVo, soit les concentrations qui réduisent de 50% leur croissance sont respectivement 54,41 µM et 78,66 µM (Xuan et coll., 2015). En ce qui concerne les cellules B16F10, Jiaolin et coll. ont rapporté qu'à des doses comprises entre 1,25 et 5 µM, la berbérine permet une augmentation de la prolifération de 112 à 170% par rapport au contrôle, mais qu'à des doses allant de 10 à 80 µM, elle l'inhibe (Jiaolin et coll., 2015). En considérant ces données, il apparaît important d'assurer qu'une quantité convenable de berbérine pourra être encapsulée dans les nanoparticules préparées. Les substances qui composent les nanoparticules, tant au niveau de leur contenant que de leur contenu, ainsi que les méthodes utilisées pour les préparer ont une influence sur le type de nanoparticule obtenu. En effet, comme le montre la Figure  1, les nanoparticules peuvent notamment se retrouver sous forme de nanocapsule, de nanosphère ou de nanosphère d’adsorption lorsqu’elles sont utilisées dans un contexte biomédical. Figure 1: Types de nanoparticule fréquemment utilisés pour la libération d'un principe actif. (fig. adaptée de Legrand et coll., 2007) Les nanocapsules sont des nanoparticules « réservoir », c’est-à-dire que le principe actif est dissout dans un cœur liquide lipophile ou hydrophile (dépendamment de la solubilité du médicament) et que ce cœur est, à son tour, contenu dans une enveloppe de polymère. Les nanosphères, elles, sont des nanoparticules Nanosphère Nanosphère d’adsorption Nanocapsule
  6 matricielles, ce qui signifie que le principe actif est directement dispersé dans la matrice du polymère qui forme la structure de la nanoparticule. Enfin, les nanosphères d’adsorption sont des nanosphères sur les- quelles le principe actif se retrouve fixé à la surface de la structure polymérique, l’exposant ainsi davan- tage à la dégradation (Legrand et coll., 2007). Dans le cadre de ce rapport, deux objectifs principaux devront être atteints. D'abord, il faudra parvenir à préparer des nanoparticules dont la structure est faite de chitosane et dont le contenu est du chlorure de berbérine. Cet objectif implique donc notamment de connaître la solubilité de ces deux substances, de connaître leurs interactions moléculaires et de connaître le ratio de solvant à utiliser par rapport à leurs quantités. Ensuite, il faudra caractériser les nanoparticules préparées, et ce, à quatre niveaux : •   Le pourcentage de berbérine encapsulée : il correspond au rapport entre la masse de berbérine se retrouvant piégée dans les nanoparticules et la masse totale de berbérine utilisée au départ. •   La cinétique de libération de la berbérine : elle correspond à la vitesse à laquelle le principe actif (berbérine) diffuse hors des nanoparticules. •   La quantité de berbérine contenue dans une nanoparticule : elle implique la division de la quantité de berbérine encapsulée par le nombre approximatif de nanoparticules préparées. •   La taille des nanoparticules : il s'agit de vérifier les dimensions des nanoparticules préparées. 1.4 Intérêts économiques de la réalisation d'un tel projet Outre les intérêts au niveau de la santé qui ont été explicités au début de ce rapport, l'atteinte des objectifs fixés pourrait s'avérer avantageuse d'un point de vue économique. En effet, le coût des agents chimiothé- rapiques est actuellement très élevé. En guise d'exemple, pour traiter un cancer colorectal sur une période de deux ans, les coûts sont de l'ordre de 100 000$ pour les médicaments anti-cancéreux (Pelchat, 2014). De plus, l'augmentation annuelle des coûts des agents chimiothérapiques au Québec est la plus élevée de tous les types de médicaments alors qu'elle se situe autour de 20% (Pelchat, 2014). Cette augmentation est non seulement due à une hausse des coûts de production des médicaments anti-cancéreux eux-mêmes, mais surtout à un constant accroissement du nombre de patients devant être traités (INESSS, 2012). Or, il se trouve que, lors du traitement, les médicaments peuvent être dégradés et, ainsi, arriver aux cellules cancéreuses en concentration si faible qu'ils perdent de leur efficacité (Heimburger, 2010). Pour obtenir des effets satisfaisants, des doses supérieures doivent donc être administrées. En développant un système de libération contrôlé de berbérine avec des nanoparticules dont la structure est faites d'un polymère biodégradable, le principe actif est protégé de la dégradation jusqu'à ce qu'il arrive à sa cible. Cela réduit ainsi les doses de médicament devant être administrées au patient, ce qui abaisse les coûts nécessaires pour se les procurer. Ainsi, en parvenant à mettre au point un système de production de nanoparticules ou un système d'encapsulation efficace, peu énergivore et peu dispendieux, des économies majeures pourraient être réalisées.
  7 2. MÉTHODOLOGIE   2.1 Préparation des nanoparticules La méthode sélectionnée pour la préparation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine est celle de la réticulation ionique (ionic cross-linking). Cette dernière se base sur les interactions molé- culaires entre le chitosane et un liant, soit le tripolyphosphate de sodium (STPP) (Figure  2). Le STPP est le composé inorganique le plus utilisé dans ce genre de procédure (Abdul Ghafoor Raja et coll., 2015) et il est non toxique. En effet, la dose de cette substance qui, administrée en une seule fois, est létale pour 50% des sujets étudiés (DL50) (Centre canadien d'hygiène et de sécurité au travail, 2015), est de plus 3000 mg/kg. (Anachemia). La méthode expérimentale permettant de déterminer la DL50 d’une substance consiste à administrer différentes doses de cette substance à des lots d’organismes, souvent des souris ou des rats. Chacun des lots est mis en contact avec des doses croissantes de substance. Le but est de mettre en évidence la dose non létale (0%) et la dose tuant tous les organismes du lot (100%). La DL50 est celle pour laquelle la moitié des sujets décèdent (Stora, 2013). Figure 2: Structure du tripolyphosphate de sodium (Sigma-Aldrich, Sodium tripolyphosphate). Les forces qui unissent le STPP et le chitosane en solution sont ioniques, d'où le nom donné à la méthode. Dans le présent cas, c'est par une variation de pH que ces forces seront induites et cela permettra ensuite de former des nanoparticules. En effet, les groupements amines du chitosane sont des groupements ba- siques (pKa = 6,5) pouvant se protoner en solution acide (pH < pKa). Ainsi, en solubilisant le chitosane dans une solution d'acide acétique (éq. 1), il est possible de l'obtenir sous une forme chargée positivement (éq. 2) (Rinaudo et coll., 1999). Cependant, pour s'assurer que la forme majoritaire qui est présente dans la solution soit celle qui est protonée (Figure  3), la solution d'acide acétique doit avoir un pH maximal de 5,5 soit une unité de pH sous le pKa du chitosane. CH#COOH +  H'O ⇆ CH#COO) + H#O* (éq. 1) Chitosane − NH' + H#O* ⇄ Chitosane − NH# * + H'O (éq. 2) Figure 3: Chitosane sous sa forme protonée (Bahrke et coll., 2003). Le STPP, de son côté, s'ionise en solution afin de former de l'acide triphosphorique (P3O10 5- ) et des ions sodium (Na+ ). En mélangeant le chitosane solubilisé dans l'acide acétique avec du STPP, les groupements amines protonés (NH3 + ) chargés positivement se lient aux atomes d'oxygène de l'acide triphosphorique chargés négativement, ce qui forme un complexe STPP/chitosane (Figure  4) (Martins et coll., 2012).
  8   Figure 4: Complexe STPP/chitosane (Chih-Hui, 2009). La préparation de nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine s'effectuera donc en solubilisant d'abord le chitosane dans une solution d'acide acétique 1% (v/v) (Annexe A-1.1.1). Ensuite, le chlorure de berbérine, préalablement solubilisé dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) (Annexe A-1.1.3), sera ajouté d'un trait à la solution de chitosane et le tout sera mélangé par agitation magnétique à 200 RPM pendant une heure (Annexe A-1.3.1). La vitesse de l’agitation magnétique sera contrôlée à l’aide de l’affichage numérique de la plaque agitatrice. Il est important de conserver la même plaque agitatrice entre chacune des préparations afin de s’assurer que ce paramètre soit maintenu constant. Puis, le STPP (5 mg/mL) sera ajouté goutte par goutte à la solution, causant ainsi la formation du complexe STPP/chitosane. Lorsqu'il est lié au STPP, le chitosane voit sa solubilité aqueuse être réduite, car l'acide triphosphorique empêche les groupes amines protonés d'être solvatés par les molécules d'eau. Cela cause la précipitation du com- plexe STPP/chitosane, ce qui enferme, par le fait même, les molécules de berbérine (Chou et coll., 2013) (Annexe A-1.3). Puisque la solution résultante des étapes de préparation précédentes contiendra à la fois les nanoparticules en suspension et des excès de réactifs, des étapes de purification devront être effectuées. Dans un premier temps, les nanoparticules seront centrifugées à partir de 2000g pendant 10 minutes et le surnageant sera retiré afin de conserver uniquement le culot (nanoparticules) (Annexe A-1.4). Celui-ci sera alors resus- pendu dans de l'eau distillée et la solution sera centrifugée à nouveau selon les mêmes paramètres. Cette dernière étape devra être effectuée jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 7,0. Ensuite, les nanopar- ticules seront resuspendues dans un tampon physiologique HEPES (pKa = 7,45-7,65 à 20 ºC (Uptima)) concentré à 20 mM. Le tampon HEPES a été sélectionné puisqu’il ne porte pas de groupement phosphate qui pourrait interagir avec les groupements amine du chitosane et qu'il permet de conserver le pH de la solution dans l'intervalle de pH pour lequel les cellules conservent leur homéostasie. D'ailleurs, la con- centration du tampon a été fixée à 20 mM puisqu'il s'agit de la concentration idéale pour effectuer de la culture cellulaire (MP, 2015). Enfin, les nanoparticules seront filtrées afin de les stériliser. Cette étape est primordiale, car les nanoparticules seront éventuellement mises en contact avec les cellules B16F10. La présence de contaminants (bactéries, poussières, réactifs, etc.) pourrait alors altérer la justesse des résultats obtenus pour cette phase du projet. Une unité stérile jetable de filtration permettra donc de dé- barrasser les solutions de nanoparticules de ces possibles contaminants (Annexe A-1.4.3). Les caractéristiques qui sont révélées lors de la caractérisation des nanoparticules dépendent directement des choix effectués pour les préparer. Par exemple, le fait de solubiliser une quantité de berbérine plus ou moins élevée dans la solution d'acide acétique engendrera une variation de la taille des nanoparticules, ainsi qu'une variation du pourcentage de principe actif encapsulé. De même, le ratio de chitosane et de STPP peut influencer la taille ainsi que l'homogénéité des nanoparticules. En effet, si la concentration de
  9 chitosane est élevée par rapport à la concentration de STPP, les nanoparticules n'auront pas une taille homogène à cause d'un manque d'agent liant lors de leur formation. À l'inverse, si la concentration de STPP est trop élevée, des agrégations se formeront, rendant les étapes de caractérisation de la taille et du nombre de nanoparticules plus complexes (Chou et coll., 2013). Selon l'étude de Chou et coll., le ratio chitosane/STPP idéal à utiliser afin de préparer des nanoparticules compactes et homogènes est de 5:1. Dans le cadre du présent rapport, différentes nanoparticules seront préparées en faisant uniquement varier la quantité de chlorure de berbérine en solution (0, 4.2, 8.4, 16.8 et 21.0 mg). Tous les autres paramètres seront donc gardés constants au cours des différents essais. La concentration de la solution de chitosane est l'un des paramètres devant demeurer constant. En effet, puisque les chaînes de chitosane se retrouvent sous forme protonée dans la solution acide, elles ont ten- dance à se repousser les unes les autres. Cependant, elles sont également capables de se lier entre elles par des liaisons hydrogène. Cela fait en sorte que pour un certain intervalle de concentration de chitosane (≈ 2 mg/ml), il existe un équilibre entre la répulsion et l'attirance des chaînes. Au dessus de cet intervalle, l'attirance prédomine sur la répulsion et, lors de l'ajout du STPP, plus de chaînes se lient ensemble avec le STPP, ce qui peut faire augmenter la taille des nanoparticules obtenues (Wen et coll., 2011). La con- centration de la solution d'acide acétique doit également être maintenue constante entre les essais. En effet, plus la concentration en ions CH3COO- est élevée en solution, plus ces ions (contre-ions) vont faire un effet d'écran sur les charges positives du chitosane. Cela diminue les répulsions électrostatiques entre les chaînes, ce qui, pour les mêmes raisons que la concentration de chitosane, peut contribuer à augmenter la taille des nanoparticules (Wen et coll., 2011). D'un autre côté, étant donné que les forces de répulsion sont plus faibles, les chaînes de chitosane se compactent mieux entre elles, ce qui peut également faire diminuer la taille des nanoparticules. Une variation de la concentration de la solution d'acide acétique ferait donc simplement en sorte de diminuer l'homogénéité des nanoparticules préparées (Wen et coll., 2011).Il est également important de conserver la vitesse d'agitation à une valeur constante entre les essais. Une vitesse d'agitation trop élevée (800 RPM) peut contribuer à perturber la répulsion entre les chaînes de chitosane et, ainsi, provoquer l'agrégation des nanoparticules. À l'opposée, une vitesse d'agitation trop faible ne disperse pas convenablement le STPP dans la solution de chitosane et cause une diminution de l'homogénéité des nanoparticules obtenues (Wen et coll., 2011). Pour s'assurer que les caractéristiques des nanoparticules obtenues seront seulement fonction de la concentration de berbérine, il faut donc gar- der ce paramètre constant. Le Tableau  1 présente un sommaire des valeurs de chacun des paramètres qui demeureront inchangés dans les étapes de préparation. Tableau 1: Valeurs des paramètres constants Paramètre Valeur [Solution chitosane] 1% (m/v) [Solution acide acétique] 1% (v/v) [Solution STPP] 5 mg/ml [HEPES] 20 mM Rythme d'ajout du STPP 53 mL/h Vitesse d'agitation magnétique (préparation des solutions) 200 RPM Vitesse d'agitation magnétique (préparation des nanoparticules) 550 RPM Température ambiante Intervalle : 16 à 25 ºC Il existe plusieurs avantages à utiliser la méthode de la réticulation ionique pour effectuer la préparation de nanoparticules. D'abord, cette méthode permet la formation de nanosphères qui contribuent à protéger
  10 le principe actif de la dégradation. Ensuite, elle n'implique pas l'usage de techniques de laboratoire avan- cées et dispendieuses. Enfin, cette méthode peut être transposée à l'échelle industrielle s'il fallait, éven- tuellement, effectuer une production de masse des nanoparticules. (Chou et coll., 2013) En contrepartie, la réticulation ionique comporte également certains inconvénients. D'une part, la forma- tion du complexe STPP/chitosane limite les tampons dans lesquels les nanoparticules peuvent être con- servées. En effet, un tampon anionique, tel le PBS, peut interagir avec les groupes amines protonés du chitosane et, par le fait même, déstabiliser les nanoparticules (López-León et coll., 2005). D'une seconde part, pour obtenir des nanoparticules dont la taille moyenne est similaire entre deux essais, de nombreux paramètres doivent être gardés constants. Non seulement faut-il mettre les mêmes concentrations de chi- tosane et de berbérine dans la solution de départ, mais il faut également ajouter les gouttes de STPP au même rythme et en même quantité (Chou et coll., 2013). Pour assurer le contrôle de ce dernier paramètre, une pompe péristaltique sera employée. Également, il faut noter que, bien que la réticulation ionique ne nécessite pas une grande quantité de solvants organiques, le DMSO est utilisé pour solubiliser la berbé- rine. Or, ce solvant est toxique à plus de 0,1% (v/v) pour les cellules (OECD, 2012). Les nanoparticules doivent donc être convenablement purifiées avant d'être utilisées pour la culture cellulaire. Cependant, il est impossible de garantir qu'aucun DMSO ne restera emprisonné dans les nanoparticules même après les étapes de purification. Dans l'éventuel cas où des problèmes seraient rencontrés en ce qui concerne la préparation des nanopar- ticules à l'aide de la méthode de la réticulation ionique, la micellisation inverse sera utilisée (Hasanzadeh Kafshgari et coll., 2012).  Cette technique se base sur les tensions qui existent entre une phase organique (apolaire) et une phase aqueuse (polaire). En effet, la solution aqueuse d'acide acétique contenant le chi- tosane et le chlorure de berbérine sera ajoutée à un mélange de solvants organiques, ce qui provoquera la formation de micelles aqueuses, soit de petits agrégats de molécules en suspension. Ces micelles seront ensuite précipitées par une augmentation du pH de la solution, ce qui formera les nanoparticules (Hasan- zadeh Kafshgari et coll., 2012). Également, si les étapes de centrifugation perturbent la morphologie des nanoparticules ou provoquent des agrégations, la dyalise ou la filtration sur pores pourra être employée. 2.2 Caractérisation des nanoparticules 2.2.1 Pourcentage d'encapsulation La méthode choisie pour évaluer le pourcentage d’encapsulation et la cinétique de libération du chlorure de berbérine contenu dans les nanoparticules est la spectrofluorimétrie. Cette technique est utilisable de par la structure même de la berbérine (Figure  5). En effet, cette molécule possède une structure composée de nombreux cycles aromatiques et hétérocycliques, ce qui lui confère une activité fluorescente. (Gálvez et coll., 2006) et (Gaulin, 2014).   Figure 5: Structure du chlorure de berbérine (Sigma Aldrich, Berberine chloride).
  11 La fluorescence est la capacité d’une molécule d'émettre de la lumière. Elle se produit lorsqu’une molé- cule ayant été excitée retourne à son état fondamental. Cette dernière libère alors de l’énergie sous forme de photon, ce qui se traduit par une production de lumière. La relation de Beer-Lambert (éq. 3) met en relation le taux de fluorescence produit dans une solution avec la concentration de l’agent fluorescent. A7 = ϵ7×  ℓ𝓁  ×  C   (éq. 3) Où Aλ correspond à l’absorbance ou au taux de fluorescence de la solution, ελ au coefficient d’extinction molaire, ℓ à la longueur du trajet optique dans la solution à traverser et C à la concentration de la molécule fluorescente (Gaulin, 2014). Le taux de fluorescence d'une solution est mesuré par un spectrofluorimètre et le fonctionnement de cet appareil (Figure  6) se résume comme suit. D'abord, de la lumière d'une longueur d'onde précise est émise et passe au travers de la solution contenant la molécule fluorescente afin de l'exciter (longueur d'onde d'excitation). Une fois excitée, la molécule commence à vibrer, ce qui dissipe une partie de son excès d'énergie et abaisse légèrement son niveau énergétique. Elle finit alors par libérer l'ensemble de son sur- plus d'énergie sous forme de photons à 360° (longueur d'onde d'émission). Ces photons sont captés par un détecteur placé à 90° par rapport à l'émetteur afin de limiter les interférences avec les longueurs d'ondes émises non absorbées (transmises) (Gaulin, 2014).   Figure 6: Schéma du fonctionnement d'un spectrofluorimètre (Équipe 1B, Oral intermédiaire 3). Afin de déterminer le pourcentage d'encapsulation de la berbérine dans les nanoparticules, il faut d'abord récupérer le surnageant obtenu après la première centrifugation effectuée dans les étapes de préparation. Ce surnageant, tel que mentionné précédemment, contient les molécules de berbérine qui n'ont pas été piégées dans les nanoparticules. Ensuite, un aliquot d'un volume précis du surnageant est prélevé et est analysé au spectrofluorimètre pour en déterminer le taux de fluorescence (Annexe A-3.1). Cette mesure est comparée à une courbe étalon préalablement établie de solutions de chlorure de berbérine de concen- trations connues et dont la fluorescence a été déterminée (Annexe A-2). En effet, en substituant la valeur de la fluorescence de l'aliquot dans l'équation de cette courbe étalon, il sera possible de trouver la con- centration de berbérine dans l'aliquot et, ensuite, de trouver la masse totale de berbérine n'ayant pas été encapsulée. Enfin, le pourcentage d'encapsulation peut être calculé avec la formule suivante (éq. 4) : % encapsulation berbérine = 100 x (masse ajoutée - masse non encapsulée)/masse ajoutée (éq. 4) Paramètres opératoires de la spectrofluorimétrie (un scan 3D pourrait être nécessaire) : •   Longueur d'onde d'excitation du chlorure de berbérine: 365 nm (évalué dans le méthanol 1mg/100 mL) (Gálvez et coll., 2006). Excitation Transmission Photons/émis Détecteur Échantillon
  12 •   Longueurs d'onde d'émission du chlorure de berbérine: 450-550 nm (évalué dans une solution de méthanol 1mg/100 mL) (Gálvez et coll., 2006). •   Composition du blanc: surnageant d'un essai de préparation pour lequel aucun chlorure de berbé- rine n'aura été ajouté à la solution de chitosane. Une méthode alternative à la spectrofluorimétrie qui pourrait être utilisée en cas de problème est la spec- trophotométrie UV-visible. Cette méthode est semblable à la spectrofluorimétrie, mais elle implique la mesure de l'absorption de rayons lumineux par la berbérine et non la mesure de son activité fluorescente. L'absorption maximale du chlorure de berbérine s'effectue en émettant des longueurs d'onde de 229, 265, 347 et 425 nm (Bashmakova et coll., 2009). Les principaux avantages de la spectrofluorimétrie sont les suivants. D'abord, elle permet normalement une meilleure sensibilité que la spectrophotométrie. En effet, sa limite de détection est de l’ordre de 10-9 M versus 10-4 /10-5 M pour la spectrophotométrie (Gaulin, 2014). De surcroît, cette méthode est non des- tructive puisqu’il est possible de récupérer l’échantillon si nécessaire (Gaulin, 2014). Enfin, étant donné que peu de molécules sont fluorescentes, elle est très spécifique à la molécule d'intérêt (Gaulin, 2014). Toutefois, la spectrofluorimétrie comporte certains désavantages. La fluorescence est influencée par le pH, la température, le taux d'oxygène dissout ainsi que la présence d'ions métalliques en solution. Ces paramètres doivent donc être constants pour chacune des solutions testées (Gaulin, 2014). De plus, il est possible que certains photons émis par la substance fluorescente soient absorbés par d'autres composantes du milieu, ce qui peut fausser l'intensité du signal sur le détecteur et, ainsi, altérer la justesse du taux de fluorescence (Gaulin, 2014). 2.2.2 Cinétique de libération Les étapes nécessaires à l’évaluation de la cinétique de libération ressemblent à celles pour le pourcentage d’encapsulation étant donné qu'elles impliquent également l'utilisation de la spectrofluorimétrie. En fait, il s'agit d'abord de faire plusieurs aliquots de 3 mL de la solution de nanoparticules en suspension dans le tampon HEPES. Ensuite, il faut évaluer la concentration de chlorure de berbérine libérée à différents intervalles de temps, soit directement après la préparation, après 15min, 30min, 1h, 2h, 24h, 48h, puis après 7 jours. La raison pour laquelle la concentration est évaluée plusieurs fois dans les deux heures qui suivent la fin de la préparation est que la majorité des médicaments (dont le chlorure de berbérine) pro- fitent d'un effet « burst », soit une libération rapide dans les quelques heures suivant l'encapsulation (voir la section 3. Résultats escomptés). Pour déterminer la concentration de chlorure de berbérine libérée à un temps donné, les aliquots seront centrifugés et le surnageant sera recueilli afin d'en faire une lecture de la fluorescence. Puis, cette lecture sera substituée dans l'équation de la courbe étalon de chlorure de berbérine. Enfin, une courbe de la quantité de berbérine libérée en fonction du temps permettra alors de déterminer la cinétique de libération de la berbérine. La grande sensibilité de la spectrofluorimétrie est alors très utile, puisqu'il est probable que de très faibles quantités de berbérine se retrouvent en solution pour certains intervalles de temps. D'ailleurs, il est important de noter que la cinétique de libération sera évaluée dans diverses conditions de température, soit à -80°C, à 4°C et à 37°C. Il est intéressant d'évaluer la cinétique de libération à une température de -80°C afin de voir si les nanoparticules particules peuvent être conservées en étant con- gelées (si la congélation ne provoque pas la diffusion de la berbérine à l'extérieur de la nanoparticule). Il est également logique de vérifier la cinétique de libération à 37°C étant donné qu'il s'agit de la tempéra- ture corporelle, soit celle à laquelle les nanoparticules seraient soumises dans un réel contexte biomédi- cal.
  13 Toutefois, l'évaluation de la cinétique à ces conditions de température pose certaines limites méthodolo- giques qui pourraient altérer la représentativité des résultats obtenus. D'abord, une lecture de la fluores- cence est effectuée 15 minutes après avoir terminé les essais de préparation. Or, pour les aliquots gardés à -80°C, il est possible que ce temps ne permette pas une congélation complète et, ainsi, que la lecture ne soit pas représentative de la condition de l'aliquot. Dans un même ordre d'idées, il est probable que la température des échantillons à 4°C et à 37°C n'atteignent pas ces valeurs lorsqu'ils auront seulement été incubés pendant 15 minutes à ces conditions. Encore une fois, cela contribuerait à diminuer la représen- tativité des résultats. De plus, tous les échantillons à -80°C doivent être décongelés dans un bain d'eau avant d'être centrifugés et transférés sur la plaque de lecture du spectrofluorimètre. Or, il est probable que le chlorure de berbérine soit libéré de la matrice de chitosane lors de cette étape, ce qui viendrait fausser la cinétique de libération. Enfin, la centrifugation est effectuée à 4°C, ce qui implique que la température des aliquots sera légère- ment abaissée dans le cas des échantillons conservés à 37°C. 2.2.3 Taille et nombre de nanoparticules La microscopie électronique est utilisée comme alternative à la microscopie photonique (utilisant la lu- mière), puisqu’elle offre une résolution bien supérieure. Un microscope photonique ne peut distinguer un écart plus grand que 0,2 micromètres. En effet, la résolution de ce type de microscope est limitée par la longueur d’onde de la lumière utilisée ainsi que la qualité et le nombre de lentilles dans le microscope. Par conséquent, même si l’on augmente indéfiniment le nombre de lentilles, la résolution sera toujours limitée à cause de la longueur d’onde de la lumière (FEI Corporation, 2010). Toutefois, les électrons ont une longueur d’onde 100 000 fois plus courte que celle de la lumière. Par conséquent, lorsqu’on utilise un microscope électronique muni de lentilles électrostatiques et électromagnétiques pour concentrer le rayon d’électrons (FEI Corporation, 2010), cela permet d’avoir une résolution de 0,1 nanomètre, c’est- à-dire à l’échelle atomique plutôt que cellulaire. Dans le cadre de ce projet, le but est d’utiliser la microscopie électronique à balayage comme méthode de caractérisation afin de déterminer la taille, la forme, et le nombre de nanoparticules présentes dans la solution. En effet, à cause de sa résolution allant de 0,1 nm à 100 000 nm, ce type de microscopie sert d’excellent outil de caractérisation (FEI Corporation, 2010). La microscopie électronique à balayage (MEB) est surtout utilisée lorsqu’on souhaite observer la surface de l’échantillon, plutôt que de le pénétrer afin d’en examiner l’intérieur (Zaluzec, 2009). Cependant, afin d’obtenir une bonne résolution de l’image, il est nécessaire de préparer l’échantillon. Puisque le but de cette caractérisation est simplement d’observer la surface de l’échantillon et de compter les nanoparti- cules, il faudra les assécher avec la méthode de la lyophilisation (voir la section 2.2.3.1), puis les insérer dans la chambre sous vide du microscope (AMMRF, 2012). Puisque la MEB utilise des électrons, il est nécessaire de s’assurer que l’échantillon est assez conducteur pour produire une image de qualité en évitant l’accumulation de charges. Pour ce faire, une des méthodes les plus utilisées dans la littérature est la métallisation (coating) de nanoparticules à l’aide d’une fine couche de carbone, d’or ou de platine ajoutée à la surface de l’échantillon. Le choix de la métallisation dépend de l’image qui doit être obtenue. Si le but est d’obtenir une analyse compositionnelle des nano- particules (c’est-à-dire une analyse des éléments qui les composent), l’utilisation d’une métallisation de carbone est préférée puisque l’or ou le platine risquent de causer une interférence. Dans le cas d’une analyse topographique, l’utilisation d’or et de platine est préférée (AMMRF, 2012).
  14 La pulvérisation cathodique est une méthode utilisée lors de la métallisation utilisant de l’or et du palla- dium. L’échantillon est d’abord déposé sur l’anode de la chambre à vide de l’appareil, alors que la ca- thode contient le métal qui doit être utilisé pour la métallisation. Une fois la chambre purgée avec de l’argon, un courant électrique est appliqué, permettant ainsi aux atomes de métal d’enrober en fine couche l’échantillon. L’échantillon est ensuite prêt à être observé via microscopie électronique (Magny, Gitzho- fer, 2000). Une fois l’image obtenue, il sera possible de dénombrer les nanoparticules présentes dans l’échantillon, puis de déterminer le nombre de nanoparticules total en utilisant le rapport volume de l’échantillon/vo- lume total. En combinant ce nombre avec la masse de berbérine encapsulée (déterminée précédemment), la quantité moyenne de berbérine se trouvant dans une nanoparticule (Q) pourra être trouvée (éq. 5) : Q = masse de berbérine encapsulée/nombre de nanoparticules (éq. 5) Puis, il sera possible de déterminer la taille des nanoparticules et, ainsi, de s’assurer que leurs dimensions soient bel et bien de l’ordre du nanomètre. La forme ainsi que l'homogénéité des nanoparticules pourront également être observées. La microscopie électronique laisse tout de même place à une marge d’erreur. En effet, étant donné que seul un échantillon très limité est évalué, il est probable que cet échantillon ne soit pas représentatif de la totalité de la solution, ce qui pourrait amener à des résultats différents de ceux escomptés. Cependant, il est possible que la taille des nanoparticules soit plus grande que prévue, à cause d'une erreur dans l’exécution du protocole. Si tel est le cas, il est possible qu'un microscope électronique ne soit pas nécessaire et qu'un microscope photonique dont la résolution peut aller jusqu’à 0,2 micron puisse être utilisé (FEI Corporation, 2010). 2.2.3.1 La lyophilisation Même si les nanoparticules ont une grande utilité dans le domaine, leur faible stabilité en milieu aqueux forme un obstacle à leur entreposage à long terme (Abdelwahed, 2006). En effet, des phénomènes comme l’agrégation et/ou la fusion des particules, les réactions d’hydrolyse du polymère qui forme la nanopar- ticule, la perte de la substance active, et autres, nuisent à la stabilité des nanoparticules. Pour pallier à ce problème, il est nécessaire d’enlever l’eau du colloïde (Abdelwahed, 2006). Le produit final est donc un échantillon de nanoparticules lyophilisées, donc sans trace d’eau à 99%. Cela est très utile non seulement pour la conservation à long terme, mais aussi pour la caractérisation au microscope électronique, qui requiert un échantillon lyophilisé (Abdelwahed, 2006). La lyophilisation de nanoparticules se fait en trois étapes. Comme le principe de lyophilisation consiste en la sublimation de l’eau, la première étape consiste donc à congeler le colloïde (Abdelwahed, 2006). Dans la littérature, il est dit que la température du colloïde lors de la phase de congélation peut être au- dessus du point de transition vitreuse sans que cela n’affecte la forme et la stabilité des nanoparticules avec un agent cryoprotecteur (Beirowski, 2011). Pour cette étape, le lyophilisateur sera réglé à -40°C pour 240 minutes (Hirsjärvi, 2009). Dans le cas d’un colloïde de nanoparticules de chitosane, il faut utiliser du tréhalose à une concentration de 15% et un ratio de poids de 1:1 avec les nanoparticules. Le tréhalose est choisi car il est le plus efficace en tant qu’agent cryoprotecteur et agent lyoprotecteur pour les biomolécules (Abdelwahed, 2006). Il est important d’effectuer la congélation à une haute vitesse pour ne pas modifier les caractéristiques du produit pour pouvoir les analyser au microscope électronique. Ainsi, le refroidissement à l’azote liquide peut être la meilleure option (Abdelwahed, 2006). Il peut rester un petit pourcentage d’eau qui n’aura pas gelé, mais elle sera traitée à l'étape du séchage secondaire. (Abdelwahed, 2006)
  15 Par la suite, il faut effectuer un séchage primaire du colloïde gelé. Pour cela, il faut mettre l’échantillon sous vide et régler la température à -35°C. La pression devrait être d’environ 150 mTorr. Il faut ensuite laisser la glace sublimer pour 1020 minutes (Hirsjärvi, 2009). Dans le cas d’une solution de nanoparti- cules, il n’est pas nécessaire de mettre la température sous le point Tc (collapse temperature), donc ce n’est pas un paramètre à vérifier avant d’effectuer les manipulations (Beirowski, 2011). Finalement, la troisième étape est d’effectuer un séchage secondaire du colloïde partiellement lyophilisé. À cette phase, il ne devrait rester que 7-8% d’eau dans la solution de nanoparticules. Il s’agit de l’eau qui n’a pas gelé (Labconco, 2010). Pour cette étape, il faut mettre la température à 20°C et la pression au minimum possible. Dans la littérature, il est dit de la mettre à 50 mTorr. Le temps du séchage secondaire est de 180 minutes (Hirsjärvi 2009). Une fois le colloïde lyophilisé, le produit obtenu est poreux dû au fait des molécules de glace qui se sont évaporés entre les nanoparticules. La concentration en eau du produit final devrait être de 1% et moins (Abdelwahed, 2006). Les nanoparticules lyophilisées peuvent ainsi être conservé à la température pièce. Toutefois, pour maxi- miser la quantité de berbérine au sein de nos nanoparticules après 12 mois, il est préférable de garder les nanoparticules à 4°C (Abdelwahed, 2006). Pour réhydrater les nanoparticules, il faut ajouter la même quantité d’eau qui a été retirée au départ. Il est donc nécessaire de conserver l’eau évaporée au cours du processus pour connaître la quantité d’eau pour réhydrater (Abdelwahed, 2006).            
  16 3. RÉSULTATS ESCOMPTÉS 3.1 Résultats de la préparation des nanoparticules Lors de la préparation des nanoparticules, des « pré-résultats » permettront de déterminer si les protocoles explicités dans ce rapport fonctionnent. D’abord, les nanoparticules de chitosane sont préparées par la méthode de la réticulation ionique. La préparation résultera par l’obtention d’une substance laiteuse. En effet, successivement aux diverses manipulations, des nanoparticules homogènes sont formées au mo- ment où la solution passe de claire à opaque. Les nanoparticules ainsi formées restent en suspension dans la solution (Zhou et coll., 2014). De même, si des agrégations se forment entre les nanoparticules, un amas sera facilement visible dans la solution de préparation. Après centrifugation de cette solution, le surnageant sera composé principalement d’acide acétique, mais aussi de chlorure de berbérine (exceptant lors de la préparation de nanoparticules vides), de STPP, de chitosane et de DMSO. Le culot sera, quant à lui, composé de nanoparticules de chitosane. 3.2 Résultats de la caractérisation des nanoparticules Ensuite, quelques caractéristiques des nanoparticules seront déterminées, soit leur taille, leur pourcentage d’encapsulation et leur cinétique de libération. Premièrement, la taille des nanoparticules est déterminée par la microscopie électronique à balayage (MEB). Tel que mentionné précédemment, plusieurs para- mètres peuvent influencer la taille des nanoparticules préparées, soit, entre autres, le pH, la température, le rythme d’ajout du STPP, la concentration du chitosane, la concentration du STPP et la quantité ajoutée de chlorure de berbérine. Dans ce présent laboratoire, seule la quantité de berbérine ajoutée est modifiée. Le pH, la température et le rythme d’ajout du STPP seront constants d’un essai à l’autre. La concentration de chitosane restera de 1 % m/v et celle de STPP restera de 5 mg/ml. Selon l’étude de Chou et coll., avec ces dernières concentrations, la taille moyenne des nanoparticules sèches de chitosane vides serait d'en- viron 15 nm (Figure 7). Les nanoparticules "témoin" préparées selon le protocole A-1.2 devraient donc avoir une taille similaire à cette valeur. Il est à noter que la colonne DLS de la Figure 7, soit la diffusion dynamique de la lumière (une technique d'analyse spectroscopique), donne la taille des nanoparticules lorsqu'elles se trouvent en solution (Fritsch, 2015). Dans le présent rapport, l'utilisation de cette technique n'est pas prévue. Par contre, comme l'indique la Figure 7, la taille réelle des nanoparticules est sous- estimée lorsqu'elle est déterminée par MEB puisque lorsque les nanoparticules voyagent en solution, une couche de liquide les recouvre et augmente le rayon de ces dernières (rayon hydrodynamique) (Fritsch, 2015). Figure 7: Taille des nanoparticules sans berbérine (Chou et coll., 2013). Dans les protocoles du présent rapport, un ration de chitosane/STPP de 5:1 dans la solution de préparation sera utilisé. Tel que mentionné précédemment, il s'agit du ratio pour lequel les nanoparticules obtenues sont le plus homogène et, surtout, pour lequel les images de la MEB sont les plus faciles à interpréter. La Figure 8 présente le type d'image qui devrait être obtenu si des agrégats sont formés (ii) ou non (iii).
  17 Figure 8: Nanoparticules ne formant pas d'agrégats (ii) formant des agrégats (iii) (Chou et coll., 2013). Des quantités de 4.2, 8.4, 16.8 et 21.0 mg de chlorure de berbérine seront ajoutées à la solution d’acide acétique et de chitosane pour la formation de nanoparticules renfermant l’agent actif. Selon l’étude de Chou et de ses collaborateurs, les nanoparticules obtenues auront une taille moyenne comprise approxi- mativement entre 60 et 110 nm, tel que présenté à la Figure 9. D'ailleurs, une augmentation de la quantité de berbérine ajoutée induit une augmentation de la taille moyenne des nanoparticules.   Deuxièmement, tel que démontré à la colonne EE de la Figure 9 (encapsulation efficiency), pour des quantités de 4.2, 8.4, 16.8 et de 21.0 mg de chlorure de berbérine, les pourcentages d’encapsulation at- tendus sont d'environ 10 à 11%. D'ailleurs, il est possible de constater qu'une relation de variation inverse est présente entre la quantité de berbérine ajoutée et le pourcentage d’encapsulation (Chou et coll., 2013).     Figure 9: Propriétés des nanoparticules selon les quantités de berbérine ajoutées (Chou et coll., 2013).   En ce qui concerne la cinétique de libération de la berbérine, les résultats de la littérature indiquent que les nanoparticules préparées avec 8.4 mg et 16.8 mg de berbérine profitent d'une libération rapide dans les 24h suivant leur préparation (effet « burst »). En effet, dans le PBS à 37°C et à un pH de 7.4, plus de 65% de la berbérine est relâchée dans cet intervalle de temps pour les nanoparticules à 16.8 mg et 52,85% est relâchée pour les nanoparticules à 8.4 mg (Figure  10). La libération s'est ensuite poursuivie de manière pratiquement constante sur trois jours. Les résultats montrent également que la cinétique de libération des nanoparticules contenant 4.2 mg de chlorure de berbérine est significativement plus lente que celle des précédentes.
  18 Figure 10: Cinétique de libération des nanoparticules contenant de la berbérine (Chou et coll., 2013). Les résultats escomptés diffèrent légèrement des résultats présentés à la Figure  10. En effet, les courbes de cinétique de cette figure sont évaluées alors que les nanoparticules ont été resuspendues dans le PBS. Cependant, à cause des groupements phosphate qu'il contient, il est possible que ce tampon ait déstabilisé les nanoparticules et qu'il ait donc provoqué une libération plus rapide de la berbérine. En se basant sur cette hypothèse, les cinétiques de libération observées dans le cadre du présent rapport pourraient être plus lente en raison du fait que le tampon choisi (HEPES) n'est, en théorie, pas censé interagir avec les groupements amine des chaînes de chitosane. D'ailleurs, les données des courbes présentées ont été éva- luées à 37°C. Les protocoles de ce rapport prévoient également de tester les cinétiques de libération dans des conditions de température de -80°C et 4°C. À ces températures, les vitesses de libération du chlorure de berbérine pourraient être moindres (voir nulles pour les échantillons à -80°C) en raison du fait que ces conditions rendent le chitosane plus visqueux et plus rigide (Wen et coll., 2011).
  19 4. BUDGET Le Tableau  2 présente les produits et les équipements consommables nécessaires à la réalisation du pro- jet. Au total, 15 essais de préparation seront réalisés (5 concentrations de chlorure de berbérine réalisées en triplicata) et, pour certains protocoles de la caractérisation, les échantillons seront décuplés à 375 (voir l'annexe A-3.2). Les quantités requises indiquées dans la dernière colonne représentent les quantités né- cessaires à la réalisation de tous les essais, multipliées par un facteur 2 afin d'assurer qu'aucun produit ne soit en manque lors des manipulations. Tableau 2: Liste d'épicerie de l'équipe 1B et coûts afférents.             Produit Compagnie Numéro Prix affiché Quantité requise Acide acétique glacial (≥ 99,7%) Sigma-Aldrich 320099-500ML 59,70$ (500 mL) ≈ 150 ml Chitosane Sigma-Aldrich 448869-250G 217,50$ (250 g) ≈ 120 g Chlorure de berbérine Sigma-Aldrich PHR1502-500MG 112,40$ (500 mg) ≈ 320 mg DMSO Sigma-Aldrich D8418-50ML 42,80$ (50 mL) ≈ 10 ml HEPES (1M) Sigma-Aldrich H0887-100ML 67,60$ (100 mL) ≈ 60 ml STPP Sigma-Aldrich 238503-500G 42,90$ (500 g) ≈ 40 g Équipement Compagnie Numéro Prix affiché Quantité requise Tube Falcon 50 mL Sigma-Aldrich CLS4558-25EA 51,60$ (50) Tube à centrifuger 5 mL Sigma-Aldrich Z688223-200EA 110,60$ (400) Embouts P200 Sigma-Aldrich Z740030-1000EA 32,70$ (1000) Embouts P1000 Sigma-Aldrich Z740031-1000EA 40,20$ (1000) Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956-1PAK 13,30$ (280) Plaque 96 puits Sigma-Aldrich P8991-30EA 350,50$ (30) Nacelle de pesée Sigma-Aldrich Z154849-1PAK 27,10$ (100) Gants nitrile Sigma-Aldrich Z677272-100EA 65,70$ (100) Unité de filtration Sigma-Aldrich Z370541-12EA 115,00$ (12) TOTAL: 1350$
  20 5. RISQUES ET MESURES DE SÉCURITÉ Tableau 3: Mesures de prévention selon les produits utilisés.                             Les manipulations nécessaires à la préparation des nanoparticules s'effectueront sous une hotte chimique, ce qui peut remplacer les équipements de protection respiratoires nécessaires lors de l'utilisation d'acide acétique glacial. Des gants en viton, caoutchouc, nitrile ou néoprène, un sarrau ainsi que des lunettes avec protection latérale sont tout de même de mise (Brenntag Canada Inc) puisque l’acide acétique glacial est un produit très corrosif (Brenntag Canada Inc). D’autre part, il est très important de tenir toute flamme éloignée de ce produit puisqu’il est inflammable. Les vapeurs de l’acide acétique peuvent traverser de grandes distances jusqu’à une source d’ignition et provoquer un retour de flamme qui pourrait par la suite provoquer une explosion. Du fait même, le contact avec un agent oxydant peut provoquer le feu (Brenn- tag Canada Inc). Pour le DMSO, les mêmes mesures pour les cas d’incendie sont nécessaires puisque ce produit est autant inflammable que l’acide acétique (Anechmia Canada Inc). Le port des gants n’est pas seulement pratique puisque le produit est corrosif, mais aussi puisqu’il peut être absorbé de plusieurs façons soit par inhalation par le contact avec les yeux et par la peau (Brenntag Canada Inc). À des con- centrations de 50 ppm dans le corps, il devient dangereux pour la vie (Brenntag Canada Inc). S’il y a contact avec les yeux, le rinçage immédiat à l’aide d’une douche oculaire est de mise et doit durer au moins une minute (Brenntag Canada Inc). S’il y a contact cutané, rincer immédiatement à grande eau pendant 15 minutes tout en retirant les vêtements ou les chaussures contaminés (Brenntag Canada Inc). S’il y a inhalation, apporter la victime à grande air et, si elle respire difficilement, administrer de l’oxy- gène à l’aide d’un respirateur agréé (Brenntag Canada Inc). S’il y a ingestion, il est très important de ne pas faire vomir la victime pour ne pas irriter son œsophage (Brenntag Canada Inc). Dans tous les cas présentés, il est important d’obtenir de l’aide médicale le plus tôt possible (Brenntag Canada Inc). Aux risques de manipulation des produits s'ajoutent les risques de manipulation des nanoparticules. En effet, il a été prouvé que les nanoparticules ayant un diamètre inférieur à 320 nm pénètrent la peau non pas par les pores, mais par les follicules des poils et des cheveux (Lademann and Richter, 2006). Par contre, étant donné que le chitosane et la berbérine sont des molécules non toxiques qui, par le fait même, détiennent une très bonne pharmacocinétique d’excrétion (Lademann and Richter, 2006), il n’y a aucun effet direct sur la santé des chercheurs s’il y a à avoir pénétration par les follicules. Toutefois, il est possible que, lors de la formation des nanoparticules, des solvants (p. ex. l'acide acétique), des polluants atmosphériques ou même des microorganismes se fixent aux nanoparticules. Si tel est le cas et qu'il y a
  21 pénétration, ces agents pourraient atteindre les cellules et mettre en danger la santé du ou des manipula- teurs (Mahérou et coll., 2014). Un équipement de protection individuel (gants, sarrau et lunettes à pro- tection latérale) est donc obligatoire, d'autant plus qu'il a été démontré que le DMSO amplifie l'effet de pénétration des nanoparticules (Ho, 2010). Enfin, lors de l’utilisation du microscope électronique à ba- layage, il est important de laisser tout élément liquide le plus loin possible du microscope. Cette mesure vise à prévenir les cas d'électrocution causés par le voltage très élevé qui est utilisé par cet appareil. Afin d'assurer la sécurité de chacun des manipulateurs dans le laboratoire, une bonne communication est de mise. Les manipulateurs devraient réduire leurs déplacements au stricte minimum dans le laboratoire et avertir leurs coéquipiers lors du déplacement d'un produit dangereux. Chaque membre de l'équipe a d'ailleurs la responsabilité d'identifier convenablement chacune des solutions préparées afin d'éviter les mélanges fautifs et dangereux de solutions. Enfin, il est important de rappeler que le travail de laboratoire à huit manipulateurs demande une organisation rigoureuse. Ainsi, au début de chaque séance de labora- toire, les manipulateurs de l'équipe se regrouperont afin de faire une brève planification du déroulement de la séance. Cela a pour objectif de limiter les pertes de temps et les accidents. En ce qui concerne l’élimination des déchets chimiques, deux cruches seront nécessaires, soit une pour jeter les nanoparticules et le tampon HEPES et l’autre pour jeter les produits restant, soit l’acide acétique, le DMSO, le chlorure de berbérine, le STPP et le chitosane. Le premier contenant sera acheminé vers les produits organiques solides ayant un pH de 7 et le second sera envoyé vers les produits organiques li- quides ayant un pH inférieur à 7.    
  22 6. PLANIFICATION EXPÉRIMENTALE DE LA PROCHAINE SESSION Le Tableau 4 présente les protocoles à effectuer selon les différentes semaines de la session Hiver 2016. Au cours des deux premières semaines, la préparation des nanoparticules sans chlorure de berbérine sera effectuée. Ceci a pour but de vérifier si les protocoles proposés dans le présent rapport permettent ou non la formation de nanoparticules. Dans l'éventuel cas où des nanoparticules sont bel et bien formées, ces deux semaines serviront également à voir si des agrégations se forment lors de la préparation. Si tout se passe comme prévu, alors, dès la troisième semaine, des nanoparticules contenant de la berbérine seront préparées. Étant donné que la libération de la berbérine peut débuter dès la fin des étapes de préparation, il est nécessaire d'évaluer la cinétique de libération à chaque fois que de nouvelles nanoparticules sont préparée (0, 15min, 30min, 1h et 2h). Les autres intervalles de temps de la cinétique de libération seront évalués le lendemain (24h), le surlendemain (48h) et la semaine suivante (7 jours) avant de commencer tout autre protocole. Au cours de la neuvième semaine, aucune manipulation n'a été prévue puisqu'il s'agit de la semaine de relâche et des entrevues pour les stages. Toutefois, si besoin est, certains membres de l'équipe pourraient venir compléter certaines manipulations. Dans un même ordre d'idées, l'échéancier prévoit deux semaines libres avant la fin des cours afin de compiler les résultats obtenus et en faire l'analyse finale. Tableau 4: Protocoles à effectuer selon les semaines de la session.                
  23 7. CONCLUSION Dans ce rapport, la méthodologie nécessaire à la préparation et à la caractérisation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine a été explicitée. En effet, la méthode de la réticulation ionique avec le tripolyphosphate de sodium sera employée pour la formation des nanoparticules. Cinq essais réalisés en triplicata seront alors effectués et seule la concentration de chlorure de berbérine ajoutée diffèrera d'un essai à l'autre. Cela permettra d'obtenir des nanoparticules dont la taille, le pourcentage d'encapsulation et la cinétique de libération varieront. Les nanoparticules qui présentent le meilleur profil de libération de chlorure de berbérine et qui en contiennent une quantité suffisante pour avoir des effets sur les cellules B16F10 (≈ 50 µM) seront reproduites et stérilisées avec une unité de filtration sous vacuum pour ensuite les transmettre à l'équipe 1C. Le pourcentage d'encapsulation ainsi que la cinétique de libération des nanoparticules seront déterminés par spectrofluorimétrie. Les pourcentages d'encapsulation attendus sont de l'ordre de 10 à 11%, alors qu'il est prévu que les cinétiques de libération de chlorure de berbérine varieront significativement d'un essai à l'autre. Les nanoparticules préparées avec une quantité plus élevée de chlorure de berbérine (8.4 mg et 16.8 mg) relâcheraient plus rapidement le principe actif en profitant d'un effet de « burst » dans les 24 premières heures suivant leur préparation. De même, les nanoparticules maintenues à 37°C devraient relâcher le chlorure de berbérine plus rapidement que celles incubées à 4°C et à -80°C. En ce qui a trait à la taille des nanoparticules, elle sera évaluée par la microscopie électronique à balayage. Les échantillons de nanoparticules devront donc préalablement être séchés par la méthode de la lyophi- lisation. Les tailles des nanoparticules sèches attendues sont d'approximativement 60 nm à 110 nm pour celles ayant été préparées avec du chlorure de berbérine et de l'ordre de 15 nm seulement pour celles ne comportant pas de principe actif. Si les étapes de préparation et de caractérisation des nanoparticules se déroulent sans problème majeur, alors le budget nécessaire à la réalisation des expériences est d'environ 1350,00 $. Ce montant considère des quantités de produit deux fois plus élevées que ce qui est réellement requis afin d'assurer qu'aucun produit ne vienne à manquer lors des manipulations. D'ailleurs, dans l'éventuel cas où l'équipement serait déjà disponible au laboratoire de l'Université, alors le montant pourrait être revu à la baisse de 800,00$. Il est important de rappeler que les nanoparticules préparées dans le cadre de ce laboratoire ne pourront être utilisées à des fins biomédicales étant donné qu'elles ne rempliront pas les normes très élevées de ce standard et qu'elles ne comportent pas de ligand pouvant reconnaître directement les cellules cancéreuses par rapport aux cellules saines. Cependant, l'exécution des protocoles du présent rapport permettra aux membres de l'équipe d'évaluer la facilité et l'efficacité de la préparation et de la caractérisation des nano- particules produites. Ainsi, dans un contexte d'ingénierie, ils pourront discuter de la viabilité de la mé- thode afin qu'éventuellement, des nanoparticules puissent être produites à grande échelle et être rendues disponibles dans les établissements de santé comme alternative à la chimiothérapie.  
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  30 ANNEXE A-1. Protocoles de la préparation des nanoparticules (ionic cross-linking) Précision : Les quantités utilisées sont valables pour un seul essai de préparation des nanoparticules. A-1.1. Préparation des solutions A-1.1.1 Solution de chitosane 1% (m/v) dissout dans l'acide acétique 1% (v/v) Matériel : •   Fiole jaugée 500 mL •   Bécher de 250 et de 600 mL •   Cylindre gradué de 500 mL •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Balance analytique •   Spatule •   Nacelle de pesée •   Chitosane (4 g) •   Acide acétique glacial (≥ 99,7%) (5 ml) •   Eau distillée (≈ 500 mL) Procédure : 1.   Sous une hotte chimique, verser environ 400 mL d’eau distillée dans la fiole jaugée de 500 mL. 2.   Pipeter 5 mL d’acide acétique glacial (≥ 99,7%) et l’ajouter dans la fiole. 3.   Compléter le volume à 500 mL avec de l’eau distillée. 4.   Agiter par inversion (10 fois). 5.   Transférer le contenu de la fiole dans le bécher de 600 mL. 6.   Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 250 mL et y verser environ 100 mL de la solu- tion d'acide acétique 1% (v/v). 7.   Peser 4 g de chitosane et l'ajouter dans le bécher de 250 mL. 8.   Rincer les parois du bécher de 250 mL avec 50 mL de solution d'acide acétique. 9.   Mettre le bécher de 250 mL sur une plaque agitatrice et démarrer l'agitation à 200 RPM. Laisser agiter pour 1 minute. 10.  Verser la solution contenue dans le bécher de 250 mL dans le cylindre gradué de 500 mL. 11.  Compléter le volume à 400 mL avec la solution d'acide acétique 1% (v/v). 12.  Laver et rincer la verrerie. A-1.1.2. Solution de tripolyphosphate de sodium (STPP) 5 mg/mL Matériel : •   Fiole jaugée de 250 mL •   Bécher de 250 mL •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Balance analytique •   Spatule •   Nacelle de pesée •   STPP (1,25 g) •   Eau distillée (≈ 250 mL) Procédure : 1.   Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 250 mL et y verser environ 100 mL d'eau distillée. 2.   Peser 1,25 g de STPP et l'ajouter dans le bécher. 3.   Rincer les parois du bécher avec 50 mL d'eau distillée. 4.   Mettre le bécher sur une plaque d'agitation et laisser agiter à 200 RPM pour 1 minute.
  31 5.   Transvider le contenu du bécher dans la fiole jaugée de 250 mL et compléter le volume avec de l'eau distillée. 6.   Agiter par inversion (10 fois). 7.   Laver puis sécher la verrerie. A-1.1.3. Solution mère de chlorure de berbérine (60 mg/ml) Matériel : •   Pipette jaugée de 5 mL •   Tube vortex •   Support pour tubes vortex •   Vortex •   Balance analytique •   Spatule •   Nacelle de pesée •   Diméthylsulfoxyde (DMSO) (≥99,9%) (5 mL) •   Chlorure de berbérine (300 mg) Procédure : 1.   Peser environ précisément 300 mg de chlorure de berbérine. Noter la masse obtenue. 2.   Identifier un tube vortex "SM CBRB (60 mg/mL)" et y transférer le chlorure de berbérine. 3.   Pipeter 5 mL de DMSO et l’ajouter dans le tube en le laissant couler sur la paroi de verre. 4.   Mélanger au vortex sous agitation modérée pendant 15 secondes (5 x 3 secondes). 5.   Mettre le tube dans le support à tubes vortex. Boucher le tube et le conserver à 4 ºC à l'abri de la lumière. A-1.1.4. Tampon HEPES (20 mM) Matériel : •   Fiole jaugée de 100 mL •   Micropipette P1000 •   Embout pour micropipette •   HEPES 1M (2 mL) •   Eau distillée (≈ 100 mL) Procédure : 1.   Verser environ 80 mL d’eau distillée dans la fiole jaugée de 1000 mL. 2.   Pipeter 2 mL de tampon HEPES 1M et l’ajouter dans la fiole. 3.   Compléter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée. 4.   Agiter par inversion (10 fois). A-1.2. Préparation des nanoparticules témoins (sans chlorure de berbérine) Matériel : •   Cylindres gradués de 200 mL, 500 mL et 1 L •   Erlenmeyers de 250 mL et de 1L •   Micropipette P1000 + embout •   Pompe péristaltique + tube •   Support universel •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Bouteille de 1000 mL •   DMSO (210 µL) •   Solution de chitosane 1% (m/v) (400 mL) •   Solution de STPP (5 mg/ml)
  32 Procédure : 1.   Mesurer 400 mL de la solution de chitosane 1% (m/v) avec le cylindre gradué de 500 mL. 2.   Mettre le barreau magnétique dans l'erlenmeyer de 1 L et y verser le contenu du cylindre gradué. 3.   Pipeter 210 µL de DMSO et l'ajouter dans l'erlenmeyer de 1 L. 4.   Mettre l'erlenmeyer sur la plaque agitatrice. Ne pas démarrer l'agitation. 5.   Mesurer 160 mL de la solution de STPP 5 mg/ml avec le cylindre gradué de 200 mL et verser le volume dans l'erlenmeyer de 250 mL. 6.   Placer le tube dans le socle de la pompe péristaltique. Mettre la première extrémité du tube dans l'erlenmeyer de 250 mL et fixer la seconde sur le support universel de sorte que l'embout pointe à la verticale dans l'erlenmeyer de 1 L. 7.   Régler le débit d'écoulement de la pompe à 53 ml/h. 8.   Démarrer l'agitation à 550 RPM et activer la pompe. 9.   Laisser le système réactionnel sous agitation à la température de la pièce jusqu'à ce que la solu- tion de STPP 5mg/ml se soit entièrement écoulée (≈ 3 h). 10.   Transvider la solution contenue dans l'erlenmeyer de 1 L dans le cylindre gradué de 1 L. Mesurer et noter le volume obtenu. 11.   Laver et sécher la verrerie. A-1.3. Préparation des nanoparticules contenant de la berbérine A-1.3.1. Ajout de la solution de chlorure de berbérine à la solution de chitosane Précision : Le protocole suivant considère une masse de chlorure de berbérine ajoutée de 4,2 mg. Les volumes de la solution mère à prélever pour les autres essais se trouvent dans le tableau A-1. Tableau A-1 : Volume de solution mère "SM CBRB (60 mg/ml) à prélever pour chacun des essais. Essai Volume à prélever (µL) Pipette à utiliser 4,2 mg 70 P200 8,4 mg 140 P1000 16,8 mg 280 P1000 21,0 mg 350 P1000 Matériel : •   Cylindre gradué de 500 mL •   Bécher de 600 mL •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Solution de chitosane 1% (m/v) (400 mL) •   Solution de chlorure de berbérine •   Micropipette P200/P1000 + embout Procédure : 1.   Mesurer 400 mL de la solution de chitosane 1% (m/v) avec le cylindre gradué de 500 mL. 2.   Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 600 mL et y verser la solution contenue dans le cylindre gradué. 3.   Pipeter 70 µL du tube "SM CBRB (60 mg/ml)" et l'ajouter dans le bécher de 600 mL. 4.   Mettre le bécher sur la plaque agitatrice et régler la vitesse d'agitation à 200 RPM. 5.   Laisser sous agitation pendant 1 heure à la température de la pièce. 6.   Laver et sécher la verrerie (hormis le bécher de 600 mL).
  33 A-1.3.2. Ajout de la solution de STPP à la solution de chitosane et de chlorure de berbérine Matériel : •   Cylindres gradués de 200 mL et 1 L •   Erlenmeyers de 250 mL et de 1 L •   Bouteille de 1000 mL •   Pompe péristaltique + tube •   Support universel •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Bécher de 600 mL contenant la solution en A-1.3.1. •   Solution de STPP 5 mg/ml (160 mL) Procédure : 1.   Mettre le barreau magnétique dans l'erlenmeyer de 1 L et y transvider la solution de chitosane et de chlorure de berbérine contenue dans le bécher de 600 mL. 2.   Mesurer 160 mL de la solution de STPP 5 mg/ml avec le cylindre gradué de 200 mL et verser le volume dans l'erlenmeyer de 250 mL. 3.   Mettre l'erlenmeyer de 1 L sur la plaque agitatrice. Ne pas démarrer l'agitation. 4.   Placer le tube dans le socle de la pompe péristaltique. Mettre la première extrémité du tube dans l'erlenmeyer de 250 mL et fixer la seconde sur le support universel de sorte que l'embout pointe à la verticale dans l'erlenmeyer de 1 L. 5.   Régler le débit d'écoulement de la pompe à 53 ml/h. 6.   Démarrer l'agitation à 550 RPM et activer la pompe. 7.   Laisser le système réactionnel sous agitation à la température de la pièce jusqu'à ce que la solu- tion de STPP 5mg/ml se soit entièrement écoulée (≈ 3 h). 8.   Transvider la solution contenue dans l'erlenmeyer de 1 L dans le cylindre gradué de 1 L. Mesurer et noter le volume obtenu. 9.   Laver et sécher la verrerie. A-1.4. Purification des nanoparticules A-1.4.1. Séparation des nanoparticules des solvants et des excès de réactifs Matériel : •   Centrifugeuse •   Pipette volumétrique de 50 mL •   Tubes Falcon de 50 mL •   Bouteille d'entreposage de 1000 mL •   Solution contenant les nanoparticules (A-1.2 ou A-1.3) Procédure : 1.   Avec la pipette volumétrique de 50 mL, pipeter approximativement 50 mL de la solution con- tenant les nanoparticules et ajouter le volume dans un tube Falcon. 2.   Répéter l'étape 1 pour 5 autres tubes Falcon. 3.   Placer les tubes Falcon dans le rotor de la centrifugeuse. Disposer les tubes de façon à équilibrer le rotor. 4.   Régler la vitesse de centrifugation à 2000g et laisser centrifuger pendant 10 minutes à 4 ºC. 5.   Vérifier qu'un culot est présent au fond des tubes. Si aucun culot n'est détectable, répéter l'étape 4 en augmentant la vitesse à 3000g, 4000g et ainsi de suite.
  34 6.   Noter la vitesse de centrifugation nécessaire à la formation du culot ainsi que le temps total de centrifugation. 7.   Avec la pipette volumétrique, retirer les surnageants et les conserver dans une bouteille d'entre- posage de 1000 mL identifiée "Surnageants A-1.4 (masse de berbérine) (numéro de l'échantil- lon)". 8.   Répéter les étapes 1 à 7 en disposant les volumes de solution de nanoparticules dans les mêmes tubes Falcon et en utilisant les paramètres de centrifugation définis à l'étape 6. A-1.4.2. Lavage des nanoparticules Matériel : •   Centrifugeuse •   Cylindre gradué de 50 mL •   Bécher de 500 mL •   Bouteille de 500 mL •   Pipette volumétrique de 50 mL •   pH-mètre •   Tubes Falcon (A-1.4.1) •   Eau distillée •   Tampon HEPES 20 mM (48 mL) Procédure : 1.   Resuspendre chacun des culots des 6 tubes Falcon du protocole A-1.4.1 dans 50 mL d'eau dis- tillée. 2.   Placer les tubes Falcon dans le rotor de la centrifugeuse. Disposer les tubes de façon à équilibrer le rotor. 3.   Centrifuger selon les paramètres établis à l'étape 6 du protocole A-1.4.1. 4.   Avec la pipette volumétrique, retirer les surnageants et les transvider dans un bécher de 500 mL. 5.   Tester le pH de la solution et verser le contenu du bécher de 500 mL dans une bouteille d'entre- posage de 500 mL identifiée "Surnageants A-1.4.2 (masse de chlorure de berbérine) (numéro de l'échantillon)". Si le pH n'est pas de 7,0, répéter les étapes 1 à 5 jusqu'à ce que ce soit le cas et passer à l'étape suivante. 6.   Resuspendre chacun des culots dans 8 mL de tampon HEPES 20 mM. 7.   Pipeter les solutions des 6 tubes Falcon et mettre les volumes dans un cylindre gradué de 50 mL. Noter le volume obtenu. 8.   Transvider le contenu du cylindre gradué dans un autre tube Falcon identifié "NPs HEPES (masse de chlorure de berbérine) (numéro de l'échantillon)". 9.   Effectuer le protocole A-1.4.3.Filtration des contaminants. A-1.4.3. Filtration des contaminants Matériel : •   Unité stérile de filtration jetable (pores : 0,2 micron) (filtration avec vacuum) •   Pipette volumétrique de 50 mL •   Tampon HEPES 20 mM (50 mL) •   Nanoparticules lavées (A-1.4.2) •   Procédure : 1.   Filtrer les nanoparticules lavées dans l'unité de filtration. 2.   Rincer le filtre avec 25 mL de solution tampon HEPES 20 mM. 3.   Répéter l'étape 2 avec le volume restant de solution HEPES 20 mM. 4.   Fermer le contenant de façon stérile. NB: Prochains protocoles effectués de façon stérile.
  35 A-2. Protocole de la préparation de la courbe étalon de chlorure de berbérine A-2.1 Échantillons de la courbe étalon Matériel : •   Surnageant du témoin (≈ 200 mL) •   Chlorure de berbérine (4 mg) •   Bécher de 100 mL •   Bécher de 50 mL •   Micropipette P1000 •   Embout à micropipette •   Pipette volumétrique de 50 mL •   Fiole jaugée de 100 mL •   Plaque 96 puits 300 µL •   Spectrofluorimètre Procédure : 1.   Pipeter 300 µL de surnageant et l'ajouter dans un puits de la plaque. 2.   Mettre approximativement 50 mL de surnageant du témoin dans la fiole jaugée de 100 mL. 3.   Mettre un barreau magnétique dans le bécher de 100 mL et y ajouter 25 mL de surnageant. 4.   Peser 4 mg de chlorure de berbérine et l'ajouter dans le bécher de 100 mL. 5.   Mettre le bécher sur la plaque agitatrice et régler la vitesse d'agitation à 200 RPM. Laisser sous agitation pendant 1 minute. 6.   Verser le contenu du bécher de 100 mL dans la fiole jaugée et compléter le volume à 100 mL avec le surnageant. 7.   Prélever 300 µL du contenu de la fiole jaugée et l'ajouter dans un second puits de la plaque. 8.   Pipeter 18,75 mL de la solution contenue dans la fiole jaugée et transférer le volume dans un bécher de 50 mL. 9.   Ajouter 6,25 mL de surnageant au bécher de 50 mL et agiter avec une tige de verre. 10.   Prélever 300 µL de la solution de l'étape précédente et le déposer dans un puits de la plaque. 11.   Répéter les étapes 8 à 10 selon les volumes donnés dans le tableau A-2. 12.   Mettre la plaque 96 puits dans le spectrofluorimètre. 13.   Régler les paramètres de l'appareil afin qu'il reconnaisse le blanc (puits de l'étape 1), qu'il con- figure la longueur d'onde d'excitation à 365 nm et qu'il configure la longueur d'onde d'émission à 550 nm. 14.   Faire la lecture de la fluorescence. 15.   Sur un logiciel d'analyse de données, tracer une courbe de la fluorescence des échantillons en fonction de leur concentration en chlorure de berbérine et demander l'équation. Tableau A-2 : Volumes à prélever pour préparer les échantillons de la courbe étalon. Échantillon Solution 4 mg/100 ml [CBRB] (mL) Surnageant (pur) (mL) Blanc --- 1,00 4 mg/100 ml 1,00 --- 3 mg/100 ml 18,75 6,25 2 mg/100 ml 12,50 12,50 1 mg/100 ml 6,25 18,75 0,5 mg/100 ml 3,13 21,88      
  36 A-3. Protocoles de la caractérisation des nanoparticules A-3.1. Détermination du pourcentage d'encapsulation (effectuer de façon stérile) Matériel : •   Surnageants (A-1.4) •   Micropipette P1000 •   Embouts à micropipette •   Plaque 96 puits 300 µL •   Spectrofluorimètre Procédure : 1.   Allumer le spectrofluorimètre. 2.   Effectuer le réglage des paramètres (λexcitation : 365 nm, λémission : 550 nm). 3.   Déposer 300 µL de blanc dans les puits A1 à A3. 4.   Mettre 300 µL de la solution "Surnageant A-1.4 (masse berbérine)_(#1)" B1 à B3. 5.   Mettre 300 µL de la solution "Surnageant A-1.4 (masse berbérine)_(#2)" C1 à C3. 6.   Mettre 300 µL de la solution "Surnageant A-1.4 (masse berbérine)_(#3)" D1 à D3. 7.   Nettoyer sous la plaque 96 puits avec un kimwipes. 8.   Effectuer la lecture de la fluorescence des puits de la plaque. 9.   Substituer les valeurs obtenues dans l'équation de la courbe étalon pour obtenir la concentration en chlorure de berbérine. A-3.2. Évaluation de la cinétique de libération (effectuer de façon stérile) A-3.2.1. Préparation des échantillons Matériel : •   Nanoparticules (A-1.4.3) •   Micropipette P1000 •   Embouts à micropipette •   Tubes à centrifuger de 5 mL •   Spectrofluorimètre Procédure : 1.   Homogénéiser la solution de HEPES contenant les nanoparticules. 2.   Faire 25 aliquots de 3 mL dans des tubes à centrifuger de 5 mL pour chaque triplicata. 3.   Identifier 25 tubes par triplicata. a.   1 tube pour le temps b.   8 tubes pour congélation à -80°C (15min, 30 min, 1h, 2h, 24h, 48h, 7 jours et surplus) c.   8 tubes pour température 4°C, (15min, 30 min, 1h, 2h, 24h, 48h, 7 jours et surplus) d.   8 tubes pour température 37°C, (15min, 30 min, 1h, 2h, 24h, 48h, 7 jours et surplus) 4.   Mettre les tubes dans des supports (pas en polystyrène) 5.   Placer les aliquots aux différentes conditions. A-3.2.2. Dosage de la berbérine dans les échantillons Matériel : •   Échantillons (A-3.2.1.) •   Solution "Blanc" •   Micropipette P1000 •   Embouts à micropipette •   Spectrofluorimètre + plaque 96 puits •   Centrifugeuse
  37 Procédure : 1.   Allumer le spectrofluorimètre. 2.   Effectuer le réglage des paramètres (λexcitation : 365 nm, λémission : 550 nm). 3.   Centrifuger l’échantillon selon les paramètres déterminés à l'étape 6 du protocole A-1.4.1. 4.   Déposer 300 µL de blanc dans les puits A1 à A3. Échantillon congelé à -80°C (décongeler dans un bain d'eau à 37 °C) 5.   Mettre 300 µL du triplicata #1 dans les puits B1 à B3. 6.   Mettre 300 µL du triplicata #2 dans les puits C1 à C3. 7.   Mettre 300 µL du triplicata #3 dans les puits D1 à D3. Échantillon à 4°C 8.   Mettre 300 µL du triplicata #1 dans les puits B5 à B7. 9.   Mettre 300 µL du triplicata #2 dans les puits C5 à C7. 10.   Mettre 300 µL du triplicata #3 dans les puits D5 à D7. Échantillon à 37°C 11.   Mettre 300 µL du triplicata #1 dans les puits B10 à B12. 12.   Mettre 300 µL du triplicata #2 dans les puits C10 à C12. 13.   Mettre 300 µL du triplicata # dans les puits D10 à D12. 14.   Nettoyer sous la plaque 96 puits avec un kimwipes. 15.   Lire la fluorescence des échantillons de la plaque 96 puits. 16.   Comparer les valeurs obtenues avec la courbe étalon pour obtenir la concentration en berbé- rine. 17.   Réaliser un graphique de la concentration de la berbérine en fonction du temps. A-3.3. Évaluation de la taille par microscopie électronique à balayage 1.   Introduire l’échantillon dans la chambre 2.   Régler la distance de travail à 20 mm. 3.   Régler l’énergie primaire à 15 keV et l’enclencher dès que le vide l’autorise. 4.   Régler le contraste et la brillance sur la valeur habituelle moyenne (réglage automatique). 5.   Mettre le grandissement au minimum, en balayage rapide (valeur : 0,5 à 1 nA pour MEB ana- logique, 50 à 100 pA pour MEB numérisé). 6.   Monter progressivement, sans à-coups, l’intensité de chauffage du filament. Surveiller le cou- rant de chauffage du filament, le courant d’émission du canon et l’apparition d’une image sur l’écran. 7.   Régler le filament sur le deuxième pic d’émission. 8.   Si l’image qui apparait est floue, corriger la mise au point en augmentant le grandissement, en corrigeant l’astigmatisme, en vérifiant l’alignement du canon et le centrage du diaphragme jusqu’à ce que l’image soit nette. 9.   Avant de sortir l’échantillon, éteindre le filament et la haute tension, couper la tension du pho- tomultiplicateur (si ce n’est pas automatique), remettre les mouvements x, y et z et les rota- tions à leur « zéro », mettre le grandissement au minimum et mettre le courant condenseur à une valeur moyenne.

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Rapport_final_1B

  • 1.
    DÉPARTEMENT DE GÉNIECHIMIQUE ET DE GÉNIE BIOTECHNOLOGIQUE Faculté de génie Université de Sherbrooke PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DE NANOPARTICULES DE CHITOSANE RENFERMANT DE LA BERBÉRINE POUR LE TRAITEMENT DU CANCER par ANTOINE BRIÈRE NATHANAËL CARBONNEAU SARAH DION JOCELYN MORIN SAMUEL NICOL SHIRAA NOUMBISSIE-NZEFA NICOLAS PERRON ÉLODIE VACHON LACHIVER Équipe 1B travail présenté à NATHALIE FAUCHEUX dans le cadre du cours GBT 415 Projet d’intégration I Sherbrooke NOVEMBRE 2015
  • 2.
      2 TABLE DESMATIÈRES 1. INTRODUCTION ..............................................................................................................................................3 1.1 CONTEXTE DE RÉALISATION DU PROJET .....................................................................................................3 1.2 OBJECTIFS ET DESCRIPTION DU PROJET GLOBAL ............................................................................................4 1.3 OBJECTIFS ET DESCRIPTION DU PROJET 1B.....................................................................................................5 1.4 INTÉRÊTS ÉCONOMIQUES DE LA RÉALISATION D'UN TEL PROJET ...................................................................6 2. MÉTHODOLOGIE ............................................................................................................................................7 2.1 PRÉPARATION DES NANOPARTICULES ............................................................................................................7 2.2 CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES ..................................................................................................10 2.2.1 Pourcentage d'encapsulation................................................................................................................10 2.2.2 Cinétique de libération..........................................................................................................................12 2.2.3 Taille et nombre de nanoparticules.......................................................................................................13 2.2.3.1 La lyophilisation.................................................................................................................................14 3. RÉSULTATS ESCOMPTÉS...........................................................................................................................16 3.1 RÉSULTATS DE LA PRÉPARATION DES NANOPARTICULES ............................................................................16 3.2 RÉSULTATS DE LA CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES ....................................................................16 4. BUDGET............................................................................................................................................................19 5. RISQUES ET MESURES DE SÉCURITÉ ....................................................................................................20 6. PLANIFICATION EXPÉRIMENTALE DE LA PROCHAINE SESSION ...............................................22 7. CONCLUSION .................................................................................................................................................23 ANNEXE................................................................................................................................................................30 A-1. PROTOCOLES DE LA PRÉPARATION DES NANOPARTICULES (IONIC CROSS-LINKING)...................................30 A-2. PROTOCOLE DE LA PRÉPARATION DE LA COURBE ÉTALON DE CHLORURE DE BERBÉRINE.........................35 A-3. PROTOCOLES DE LA CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES................................................................36 LISTE DES FIGURES FIGURE 1: TYPES DE NANOPARTICULE FRÉQUEMMENT UTILISÉS POUR LA LIBÉRATION D'UN PRINCIPE ACTIF.............................5 FIGURE 2: STRUCTURE DU TRIPOLYPHOSPHATE DE SODIUM (SIGMA-ALDRICH, SODIUM TRIPOLYPHOSPHATE)..........................7 FIGURE 3: CHITOSANE SOUS SA FORME PROTONÉE (BAHRKE ET COLL., 2003). ...........................................................................7 FIGURE 4: COMPLEXE STPP/CHITOSANE (CHIH-HUI, 2009)........................................................................................................8 FIGURE 5: STRUCTURE DU CHLORURE DE BERBÉRINE (SIGMA ALDRICH, BERBERINE CHLORIDE).............................................10 FIGURE 6: SCHÉMA DU FONCTIONNEMENT D'UN SPECTROFLUORIMÈTRE (ÉQUIPE 1B, ORAL INTERMÉDIAIRE 3)......................11 FIGURE 7: TAILLE DES NANOPARTICULES SANS BERBÉRINE (CHOU ET COLL., 2013).................................................................16 FIGURE 8: NANOPARTICULES NE FORMANT PAS D'AGRÉGATS (II) FORMANT DES AGRÉGATS (III) (CHOU ET COLL., 2013). .......17 FIGURE 9: PROPRIÉTÉS DES NANOPARTICULES SELON LES QUANTITÉS DE BERBÉRINE AJOUTÉES (CHOU ET COLL., 2013)........17 FIGURE 10: CINÉTIQUE DE LIBÉRATION DES NANOPARTICULES CONTENANT DE LA BERBÉRINE (CHOU ET COLL., 2013)..........18 LISTE DES TABLEAUX TABLEAU 1: VALEURS DES PARAMÈTRES CONSTANTS.................................................................................................................9 TABLEAU 2: LISTE D'ÉPICERIE DE L'ÉQUIPE 1B ET COÛTS AFFÉRENTS. ......................................................................................19 TABLEAU 3: MESURES DE PRÉVENTION SELON LES PRODUITS UTILISÉS. ...................................................................................20 TABLEAU 4: PROTOCOLES À EFFECTUER SELON LES SEMAINES DE LA SESSION. ........................................................................22
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      3 1. INTRODUCTION 1.1Contexte de réalisation du projet La Société canadienne du cancer estime que 196 900 Canadiens auront reçu un diagnostic de cancer d’ici la fin de l’année 2015 (Société canadienne du cancer, 2015) et que ce nombre pourrait augmenter de 40% d’ici 2030 en raison de la croissance de la population et de son vieillissement (Presse canadienne, 2015). Actuellement, trois principales méthodes sont employées afin de traiter les personnes atteintes de cette maladie, soit la chirurgie, la radiothérapie ainsi que la chimiothérapie (Ligue nationale contre le cancer, 2009). La chirurgie consiste à l’ablation de la zone tumorale en retirant partiellement ou complètement les tissus de l'organe atteint. Cette méthode est utilisée pour traiter plus de 50% des personnes atteintes d'un cancer (Société canadienne du cancer, 2015). La radiothérapie, de son côté, vise à soumettre les cellules tumo- rales à des rayonnements électromagnétiques (photons X ou gamma) ou à des rayonnements corpuscu- laires (faisceau de protons ou de neutrons) (Maranninchi et coll., 2005). Lorsqu'ils entrent en interaction avec les cellules malignes, ces rayonnements peuvent provoquer des ruptures simple-brin ou double-brin de leur ADN et, ainsi, causer leur mort (Maranninchi et coll., 2005). On estime qu'au moins deux patients sur trois auront recours à la radiothérapie durant la période de traitement de leur cancer (Maranninchi et coll., 2005). La chirurgie et la radiothérapie sont deux méthodes dites « locorégionales », car elles ciblent les cellules cancéreuses se retrouvant dans une région précise du corps du patient. Inversement, la chimiothérapie, qui implique l'administration par voie orale ou intraveineuse de substances chimiques, n'est pas une mé- thode locorégionale. Elle est utilisée pour traiter approximativement 22% des patients atteints d'un cancer (Milliman, 2013) et les principales substances qu'elle implique sont les agents alkylants, les antimétabo- lites ainsi que les vinca-alcaloïdes (Ligue nationale contre le cancer, 2009). Les agents alkylants forment des radicaux alkyles qui effectuent des liaisons covalentes avec certains des atomes des acides nucléiques (ADN et ARN). Lors de la transcription de l'ADN, la liaison avec le radical empêche la séparation adéquate des brins, ce qui entraîne une incapacité de la cellule à se diviser et, par le fait même, sa mort (Poletto, 2009). Les antimétabolites, de leur côté, se divisent en deux sous-catégo- ries ayant chacune leur propre mode d'action. Les antimétabolites « antifoliques » inhibent l'activité des enzymes essentielles à la synthèse des acides nucléiques, tandis que les antimétabolites « leurres » vont mimer une base azotée et être intégrés à l'ADN lors de sa synthèse. Pour la cellule, l'un ou l'autre de ces deux médicaments perturbe la phase S du cycle cellulaire et, ainsi, empêche sa division (Poletto, 2009). Enfin, les vinca-alcaloïdes qui sont des composés organiques provenant de différentes pervenches tropi- cales empêchent la mitose en contrant la formation du fuseau mitotique (Poletto, 2009). Il est possible que les cellules cancéreuses migrent par rapport à leur zone tumorale initiale et envahissent d’autres tissus de l’organisme. Les cellules qui agissent de la sorte se nomment « métastases » et rendent parfois nécessaire le couplage de deux ou de trois méthodes de traitement différentes (Société canadienne du cancer, 2015). De fait, pour un cancer métastatique (cancer s’étant propagé), la radiothérapie peut être employée pour éliminer la source des cellules cancéreuses, soit la tumeur d’origine, alors que la chimio- thérapie peut être utilisée avantageusement afin d’éliminer les cellules cancéreuses répandues non spé- cifiquement dans d’autres parties du corps (Ligue nationale contre le cancer, 2009). Cependant, le recours à la chimiothérapie entraîne également son lot d’inconvénients. En effet, les agents chimiques se diffu- sent dans les différents tissus de l’organisme et perturbent toutes les cellules dont la division cellulaire est rapide (Société de recherche sur le cancer, 2015). Les cellules cancéreuses, dont la division s'effectue
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      4 rapidement, sontalors détruites, mais les cellules saines qui ont naturellement un rythme de multiplica- tion élevé le sont également (Société de recherche sur le cancer, 2015). Cela explique pourquoi les pa- tients traités par chimiothérapie perdent habituellement leurs cheveux. En effet, les cellules responsables de la croissance des cheveux ont une division rapide (Société de recherche sur le cancer, 2015). Outre la perte de chevelure, la chimiothérapie peut provoquer plusieurs autres effets secondaires indésirables chez le patient tel que des dommages permanents aux organes (cœur, foie, reins, organes reproducteurs, etc.) (Société canadienne du cancer, 2015). 1.2 Objectifs et description du projet global Pour contourner les inconvénients de la chimiothérapie, de nombreux chercheurs des domaines pharma- ceutiques et de la nanomédecine tentent de développer un système de libération contrôlé de médicaments (Centre national de la recherche scientifique, 2015). En d'autres mots, ceux-ci cherchent à concevoir des méthodes par lesquelles les agents chimiothérapiques sont délivrés directement aux tissus cancéreux sans toutefois atteindre et affecter les tissus sains. Le présent rapport s’inscrit dans un projet de plus grande portée dont l’objectif est similaire. De fait, ce projet vise l’élaboration d’un système de libération d’alca- loïde afin de l’utiliser dans un contexte biomédical, soit pour le traitement du cancer (Faucheux, 2015). Pour parvenir à atteindre cet objectif, trois principales phases doivent être réalisées : la préparation et la caractérisation du polymère formant la structure du système de libération du médicament, la préparation et la caractérisation du système lui-même ainsi que l’étude des effets du médicament délivré sur la survie, la prolifération et la migration des cellules cancéreuses (Faucheux, 2015). La première phase implique d’extraire de la chitine (un biopolymère de N-acétylglucosamine très abon- dant dans la nature) des carapaces de crustacés et de procéder à sa désacétylation (élimination de grou- pement acétyle sur la chaîne polysaccharidique). Lorsque le degré de désacétylation de la chitine atteint une valeur supérieure ou égale à 60 %, il est question de chitosane (Ifremer, 2010). Contrairement à la chitine, le chitosane est soluble en milieu acide et son activité antimicrobienne, sa biocompatibilité ainsi que sa biodégradabilité en font un polymère structural de choix pour le développement d'un système de libération contrôlé de médicaments (Ifremer, 2010). La deuxième phase du projet consiste à préparer des nanoparticules (c’est-à-dire un système de libération dont les dimensions sont comprises entre 1 et 100 nm) (De Jong, 2008) à partir du chitosane préalablement produit puis à y introduire de la berbérine. La berbérine est un alcaloïde hétérocyclique activant l’enzyme adénosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), ce qui lui confère un effet inhibiteur sur la migration des cellules cancéreuses. En effet, le rôle de l'AMPK est d'assurer que la cellule a des ressources d'énergie suffisantes pour se diviser (Jones et coll., 2005). Dans le cas d'un stress métabolique (déficience en glucose, par exemple), l'AMPK s'active et elle phosphoryle la protéine p53. Cette phosphorylation active la p53 et fait en sorte que le cycle de la division cellulaire est désormais régulé par la présence de cette protéine (Jones et coll., 2005). Or, il se trouve que la p53 permet la multiplication des cellules saines, mais bloque la multiplication de toutes les cellules anormales (les cellules cancéreuses, entre autres) (Katiyar et coll., 2009). Par cette chute d'acti- vation, la berbérine peut donc inhiber la prolifération des cellules cancéreuses. La berbérine a également un rôle sur la cyclo-oxygénase 2 (COX-2) qui est une enzyme qui catalyse la conversion de l'acide ara- chidonique en prostaglandine E2 (PGE2) (Xuan et coll., 2015). De son côté, PGE2 est une protéine qui peut contribuer à l'augmentation de la production de la protéine Bcl-2 qui est anti-apoptotique (elle em- pêche les cellules de se « suicider » en cas d'anormalité) (Sobolewski et coll., 2010). Ainsi, par l'inhibition de cette voie enzymatique, la berbérine contribue à limiter la prolifération et l'invasion des cellules can- céreuses. Ces effets de la berbérine seront d'ailleurs l'objet d'études lors de la troisième phase du projet, alors que les impacts de la mise en contact de cellules de mélanome murin B16F10 et des nanoparticules contenant cet alcaloïde seront analysés.
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      5 1.3 Objectifset description du projet 1B Le présent rapport traite plus profondément de la deuxième phase du projet, c’est-à-dire de la préparation, mais aussi de la caractérisation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine. La prépara- tion et l’utilisation de nanoparticules sont non seulement utiles pour contourner les revers de la chimio- thérapie, mais également pour empêcher le médicament d’être dégradé avant d’arriver à sa cible, soit les cellules cancéreuses. De fait, la berbérine est dégradée à un plus faible taux lorsqu’elle se retrouve en- capsulée dans une nanoparticule, ce qui contribue à accroître sa biodisponibilité (la vitesse et l'étendue avec lesquelles elle devient disponible à sa cible (Toutain et Bousquet-Melou, N/D)) et, par le fait même, à accroître ses effets sur les cellules cancéreuses (Xue et coll., 2013). Pour observer une inhibition de l'activité des cellules cancéreuses ou une élimination de celles-ci, l'équipe de recherche de Man Tsang et de ses collaborateurs ont effectué des essais in vivo sur des rats atteints d'un carcinome du nasopharynx en les soumettant à des doses de 5 mg/kg et de 10 mg/kg de berbérine. Leurs résultats montrent qu'à ces deux doses, la taille de la tumeur est réduite de plus de trois fois par rapport à la tumeur témoin, et ce, après 43 jours de traitement (Man Tsang et coll., 2013). De leur côté, l'équipe de recherche de Xuan et de ses collaborateurs indiquent qu'une concentration in vivo de 50, 100 et de 200 mg/kg peut significativement réduire le taux de croissance des tumeurs provenant des cellules de cancer colorectal (SW260 et LoVo) et que des concentrations in vitro de berbérine de 10, 20 et de 40 µM peut considérablement altérer la capacité de migration de ces cellules (Xuan et coll., 2015). L'équipe a également établit que les CI50 de la berbérine pour les cellules SW260 et LoVo, soit les concentrations qui réduisent de 50% leur croissance sont respectivement 54,41 µM et 78,66 µM (Xuan et coll., 2015). En ce qui concerne les cellules B16F10, Jiaolin et coll. ont rapporté qu'à des doses comprises entre 1,25 et 5 µM, la berbérine permet une augmentation de la prolifération de 112 à 170% par rapport au contrôle, mais qu'à des doses allant de 10 à 80 µM, elle l'inhibe (Jiaolin et coll., 2015). En considérant ces données, il apparaît important d'assurer qu'une quantité convenable de berbérine pourra être encapsulée dans les nanoparticules préparées. Les substances qui composent les nanoparticules, tant au niveau de leur contenant que de leur contenu, ainsi que les méthodes utilisées pour les préparer ont une influence sur le type de nanoparticule obtenu. En effet, comme le montre la Figure  1, les nanoparticules peuvent notamment se retrouver sous forme de nanocapsule, de nanosphère ou de nanosphère d’adsorption lorsqu’elles sont utilisées dans un contexte biomédical. Figure 1: Types de nanoparticule fréquemment utilisés pour la libération d'un principe actif. (fig. adaptée de Legrand et coll., 2007) Les nanocapsules sont des nanoparticules « réservoir », c’est-à-dire que le principe actif est dissout dans un cœur liquide lipophile ou hydrophile (dépendamment de la solubilité du médicament) et que ce cœur est, à son tour, contenu dans une enveloppe de polymère. Les nanosphères, elles, sont des nanoparticules Nanosphère Nanosphère d’adsorption Nanocapsule
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      6 matricielles, cequi signifie que le principe actif est directement dispersé dans la matrice du polymère qui forme la structure de la nanoparticule. Enfin, les nanosphères d’adsorption sont des nanosphères sur les- quelles le principe actif se retrouve fixé à la surface de la structure polymérique, l’exposant ainsi davan- tage à la dégradation (Legrand et coll., 2007). Dans le cadre de ce rapport, deux objectifs principaux devront être atteints. D'abord, il faudra parvenir à préparer des nanoparticules dont la structure est faite de chitosane et dont le contenu est du chlorure de berbérine. Cet objectif implique donc notamment de connaître la solubilité de ces deux substances, de connaître leurs interactions moléculaires et de connaître le ratio de solvant à utiliser par rapport à leurs quantités. Ensuite, il faudra caractériser les nanoparticules préparées, et ce, à quatre niveaux : •   Le pourcentage de berbérine encapsulée : il correspond au rapport entre la masse de berbérine se retrouvant piégée dans les nanoparticules et la masse totale de berbérine utilisée au départ. •   La cinétique de libération de la berbérine : elle correspond à la vitesse à laquelle le principe actif (berbérine) diffuse hors des nanoparticules. •   La quantité de berbérine contenue dans une nanoparticule : elle implique la division de la quantité de berbérine encapsulée par le nombre approximatif de nanoparticules préparées. •   La taille des nanoparticules : il s'agit de vérifier les dimensions des nanoparticules préparées. 1.4 Intérêts économiques de la réalisation d'un tel projet Outre les intérêts au niveau de la santé qui ont été explicités au début de ce rapport, l'atteinte des objectifs fixés pourrait s'avérer avantageuse d'un point de vue économique. En effet, le coût des agents chimiothé- rapiques est actuellement très élevé. En guise d'exemple, pour traiter un cancer colorectal sur une période de deux ans, les coûts sont de l'ordre de 100 000$ pour les médicaments anti-cancéreux (Pelchat, 2014). De plus, l'augmentation annuelle des coûts des agents chimiothérapiques au Québec est la plus élevée de tous les types de médicaments alors qu'elle se situe autour de 20% (Pelchat, 2014). Cette augmentation est non seulement due à une hausse des coûts de production des médicaments anti-cancéreux eux-mêmes, mais surtout à un constant accroissement du nombre de patients devant être traités (INESSS, 2012). Or, il se trouve que, lors du traitement, les médicaments peuvent être dégradés et, ainsi, arriver aux cellules cancéreuses en concentration si faible qu'ils perdent de leur efficacité (Heimburger, 2010). Pour obtenir des effets satisfaisants, des doses supérieures doivent donc être administrées. En développant un système de libération contrôlé de berbérine avec des nanoparticules dont la structure est faites d'un polymère biodégradable, le principe actif est protégé de la dégradation jusqu'à ce qu'il arrive à sa cible. Cela réduit ainsi les doses de médicament devant être administrées au patient, ce qui abaisse les coûts nécessaires pour se les procurer. Ainsi, en parvenant à mettre au point un système de production de nanoparticules ou un système d'encapsulation efficace, peu énergivore et peu dispendieux, des économies majeures pourraient être réalisées.
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      7 2. MÉTHODOLOGIE   2.1 Préparation des nanoparticules La méthode sélectionnée pour la préparation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine est celle de la réticulation ionique (ionic cross-linking). Cette dernière se base sur les interactions molé- culaires entre le chitosane et un liant, soit le tripolyphosphate de sodium (STPP) (Figure  2). Le STPP est le composé inorganique le plus utilisé dans ce genre de procédure (Abdul Ghafoor Raja et coll., 2015) et il est non toxique. En effet, la dose de cette substance qui, administrée en une seule fois, est létale pour 50% des sujets étudiés (DL50) (Centre canadien d'hygiène et de sécurité au travail, 2015), est de plus 3000 mg/kg. (Anachemia). La méthode expérimentale permettant de déterminer la DL50 d’une substance consiste à administrer différentes doses de cette substance à des lots d’organismes, souvent des souris ou des rats. Chacun des lots est mis en contact avec des doses croissantes de substance. Le but est de mettre en évidence la dose non létale (0%) et la dose tuant tous les organismes du lot (100%). La DL50 est celle pour laquelle la moitié des sujets décèdent (Stora, 2013). Figure 2: Structure du tripolyphosphate de sodium (Sigma-Aldrich, Sodium tripolyphosphate). Les forces qui unissent le STPP et le chitosane en solution sont ioniques, d'où le nom donné à la méthode. Dans le présent cas, c'est par une variation de pH que ces forces seront induites et cela permettra ensuite de former des nanoparticules. En effet, les groupements amines du chitosane sont des groupements ba- siques (pKa = 6,5) pouvant se protoner en solution acide (pH < pKa). Ainsi, en solubilisant le chitosane dans une solution d'acide acétique (éq. 1), il est possible de l'obtenir sous une forme chargée positivement (éq. 2) (Rinaudo et coll., 1999). Cependant, pour s'assurer que la forme majoritaire qui est présente dans la solution soit celle qui est protonée (Figure  3), la solution d'acide acétique doit avoir un pH maximal de 5,5 soit une unité de pH sous le pKa du chitosane. CH#COOH +  H'O ⇆ CH#COO) + H#O* (éq. 1) Chitosane − NH' + H#O* ⇄ Chitosane − NH# * + H'O (éq. 2) Figure 3: Chitosane sous sa forme protonée (Bahrke et coll., 2003). Le STPP, de son côté, s'ionise en solution afin de former de l'acide triphosphorique (P3O10 5- ) et des ions sodium (Na+ ). En mélangeant le chitosane solubilisé dans l'acide acétique avec du STPP, les groupements amines protonés (NH3 + ) chargés positivement se lient aux atomes d'oxygène de l'acide triphosphorique chargés négativement, ce qui forme un complexe STPP/chitosane (Figure  4) (Martins et coll., 2012).
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      8   Figure4: Complexe STPP/chitosane (Chih-Hui, 2009). La préparation de nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine s'effectuera donc en solubilisant d'abord le chitosane dans une solution d'acide acétique 1% (v/v) (Annexe A-1.1.1). Ensuite, le chlorure de berbérine, préalablement solubilisé dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) (Annexe A-1.1.3), sera ajouté d'un trait à la solution de chitosane et le tout sera mélangé par agitation magnétique à 200 RPM pendant une heure (Annexe A-1.3.1). La vitesse de l’agitation magnétique sera contrôlée à l’aide de l’affichage numérique de la plaque agitatrice. Il est important de conserver la même plaque agitatrice entre chacune des préparations afin de s’assurer que ce paramètre soit maintenu constant. Puis, le STPP (5 mg/mL) sera ajouté goutte par goutte à la solution, causant ainsi la formation du complexe STPP/chitosane. Lorsqu'il est lié au STPP, le chitosane voit sa solubilité aqueuse être réduite, car l'acide triphosphorique empêche les groupes amines protonés d'être solvatés par les molécules d'eau. Cela cause la précipitation du com- plexe STPP/chitosane, ce qui enferme, par le fait même, les molécules de berbérine (Chou et coll., 2013) (Annexe A-1.3). Puisque la solution résultante des étapes de préparation précédentes contiendra à la fois les nanoparticules en suspension et des excès de réactifs, des étapes de purification devront être effectuées. Dans un premier temps, les nanoparticules seront centrifugées à partir de 2000g pendant 10 minutes et le surnageant sera retiré afin de conserver uniquement le culot (nanoparticules) (Annexe A-1.4). Celui-ci sera alors resus- pendu dans de l'eau distillée et la solution sera centrifugée à nouveau selon les mêmes paramètres. Cette dernière étape devra être effectuée jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 7,0. Ensuite, les nanopar- ticules seront resuspendues dans un tampon physiologique HEPES (pKa = 7,45-7,65 à 20 ºC (Uptima)) concentré à 20 mM. Le tampon HEPES a été sélectionné puisqu’il ne porte pas de groupement phosphate qui pourrait interagir avec les groupements amine du chitosane et qu'il permet de conserver le pH de la solution dans l'intervalle de pH pour lequel les cellules conservent leur homéostasie. D'ailleurs, la con- centration du tampon a été fixée à 20 mM puisqu'il s'agit de la concentration idéale pour effectuer de la culture cellulaire (MP, 2015). Enfin, les nanoparticules seront filtrées afin de les stériliser. Cette étape est primordiale, car les nanoparticules seront éventuellement mises en contact avec les cellules B16F10. La présence de contaminants (bactéries, poussières, réactifs, etc.) pourrait alors altérer la justesse des résultats obtenus pour cette phase du projet. Une unité stérile jetable de filtration permettra donc de dé- barrasser les solutions de nanoparticules de ces possibles contaminants (Annexe A-1.4.3). Les caractéristiques qui sont révélées lors de la caractérisation des nanoparticules dépendent directement des choix effectués pour les préparer. Par exemple, le fait de solubiliser une quantité de berbérine plus ou moins élevée dans la solution d'acide acétique engendrera une variation de la taille des nanoparticules, ainsi qu'une variation du pourcentage de principe actif encapsulé. De même, le ratio de chitosane et de STPP peut influencer la taille ainsi que l'homogénéité des nanoparticules. En effet, si la concentration de
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      9 chitosane estélevée par rapport à la concentration de STPP, les nanoparticules n'auront pas une taille homogène à cause d'un manque d'agent liant lors de leur formation. À l'inverse, si la concentration de STPP est trop élevée, des agrégations se formeront, rendant les étapes de caractérisation de la taille et du nombre de nanoparticules plus complexes (Chou et coll., 2013). Selon l'étude de Chou et coll., le ratio chitosane/STPP idéal à utiliser afin de préparer des nanoparticules compactes et homogènes est de 5:1. Dans le cadre du présent rapport, différentes nanoparticules seront préparées en faisant uniquement varier la quantité de chlorure de berbérine en solution (0, 4.2, 8.4, 16.8 et 21.0 mg). Tous les autres paramètres seront donc gardés constants au cours des différents essais. La concentration de la solution de chitosane est l'un des paramètres devant demeurer constant. En effet, puisque les chaînes de chitosane se retrouvent sous forme protonée dans la solution acide, elles ont ten- dance à se repousser les unes les autres. Cependant, elles sont également capables de se lier entre elles par des liaisons hydrogène. Cela fait en sorte que pour un certain intervalle de concentration de chitosane (≈ 2 mg/ml), il existe un équilibre entre la répulsion et l'attirance des chaînes. Au dessus de cet intervalle, l'attirance prédomine sur la répulsion et, lors de l'ajout du STPP, plus de chaînes se lient ensemble avec le STPP, ce qui peut faire augmenter la taille des nanoparticules obtenues (Wen et coll., 2011). La con- centration de la solution d'acide acétique doit également être maintenue constante entre les essais. En effet, plus la concentration en ions CH3COO- est élevée en solution, plus ces ions (contre-ions) vont faire un effet d'écran sur les charges positives du chitosane. Cela diminue les répulsions électrostatiques entre les chaînes, ce qui, pour les mêmes raisons que la concentration de chitosane, peut contribuer à augmenter la taille des nanoparticules (Wen et coll., 2011). D'un autre côté, étant donné que les forces de répulsion sont plus faibles, les chaînes de chitosane se compactent mieux entre elles, ce qui peut également faire diminuer la taille des nanoparticules. Une variation de la concentration de la solution d'acide acétique ferait donc simplement en sorte de diminuer l'homogénéité des nanoparticules préparées (Wen et coll., 2011).Il est également important de conserver la vitesse d'agitation à une valeur constante entre les essais. Une vitesse d'agitation trop élevée (800 RPM) peut contribuer à perturber la répulsion entre les chaînes de chitosane et, ainsi, provoquer l'agrégation des nanoparticules. À l'opposée, une vitesse d'agitation trop faible ne disperse pas convenablement le STPP dans la solution de chitosane et cause une diminution de l'homogénéité des nanoparticules obtenues (Wen et coll., 2011). Pour s'assurer que les caractéristiques des nanoparticules obtenues seront seulement fonction de la concentration de berbérine, il faut donc gar- der ce paramètre constant. Le Tableau  1 présente un sommaire des valeurs de chacun des paramètres qui demeureront inchangés dans les étapes de préparation. Tableau 1: Valeurs des paramètres constants Paramètre Valeur [Solution chitosane] 1% (m/v) [Solution acide acétique] 1% (v/v) [Solution STPP] 5 mg/ml [HEPES] 20 mM Rythme d'ajout du STPP 53 mL/h Vitesse d'agitation magnétique (préparation des solutions) 200 RPM Vitesse d'agitation magnétique (préparation des nanoparticules) 550 RPM Température ambiante Intervalle : 16 à 25 ºC Il existe plusieurs avantages à utiliser la méthode de la réticulation ionique pour effectuer la préparation de nanoparticules. D'abord, cette méthode permet la formation de nanosphères qui contribuent à protéger
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      10 le principeactif de la dégradation. Ensuite, elle n'implique pas l'usage de techniques de laboratoire avan- cées et dispendieuses. Enfin, cette méthode peut être transposée à l'échelle industrielle s'il fallait, éven- tuellement, effectuer une production de masse des nanoparticules. (Chou et coll., 2013) En contrepartie, la réticulation ionique comporte également certains inconvénients. D'une part, la forma- tion du complexe STPP/chitosane limite les tampons dans lesquels les nanoparticules peuvent être con- servées. En effet, un tampon anionique, tel le PBS, peut interagir avec les groupes amines protonés du chitosane et, par le fait même, déstabiliser les nanoparticules (López-León et coll., 2005). D'une seconde part, pour obtenir des nanoparticules dont la taille moyenne est similaire entre deux essais, de nombreux paramètres doivent être gardés constants. Non seulement faut-il mettre les mêmes concentrations de chi- tosane et de berbérine dans la solution de départ, mais il faut également ajouter les gouttes de STPP au même rythme et en même quantité (Chou et coll., 2013). Pour assurer le contrôle de ce dernier paramètre, une pompe péristaltique sera employée. Également, il faut noter que, bien que la réticulation ionique ne nécessite pas une grande quantité de solvants organiques, le DMSO est utilisé pour solubiliser la berbé- rine. Or, ce solvant est toxique à plus de 0,1% (v/v) pour les cellules (OECD, 2012). Les nanoparticules doivent donc être convenablement purifiées avant d'être utilisées pour la culture cellulaire. Cependant, il est impossible de garantir qu'aucun DMSO ne restera emprisonné dans les nanoparticules même après les étapes de purification. Dans l'éventuel cas où des problèmes seraient rencontrés en ce qui concerne la préparation des nanopar- ticules à l'aide de la méthode de la réticulation ionique, la micellisation inverse sera utilisée (Hasanzadeh Kafshgari et coll., 2012).  Cette technique se base sur les tensions qui existent entre une phase organique (apolaire) et une phase aqueuse (polaire). En effet, la solution aqueuse d'acide acétique contenant le chi- tosane et le chlorure de berbérine sera ajoutée à un mélange de solvants organiques, ce qui provoquera la formation de micelles aqueuses, soit de petits agrégats de molécules en suspension. Ces micelles seront ensuite précipitées par une augmentation du pH de la solution, ce qui formera les nanoparticules (Hasan- zadeh Kafshgari et coll., 2012). Également, si les étapes de centrifugation perturbent la morphologie des nanoparticules ou provoquent des agrégations, la dyalise ou la filtration sur pores pourra être employée. 2.2 Caractérisation des nanoparticules 2.2.1 Pourcentage d'encapsulation La méthode choisie pour évaluer le pourcentage d’encapsulation et la cinétique de libération du chlorure de berbérine contenu dans les nanoparticules est la spectrofluorimétrie. Cette technique est utilisable de par la structure même de la berbérine (Figure  5). En effet, cette molécule possède une structure composée de nombreux cycles aromatiques et hétérocycliques, ce qui lui confère une activité fluorescente. (Gálvez et coll., 2006) et (Gaulin, 2014).   Figure 5: Structure du chlorure de berbérine (Sigma Aldrich, Berberine chloride).
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      11 La fluorescenceest la capacité d’une molécule d'émettre de la lumière. Elle se produit lorsqu’une molé- cule ayant été excitée retourne à son état fondamental. Cette dernière libère alors de l’énergie sous forme de photon, ce qui se traduit par une production de lumière. La relation de Beer-Lambert (éq. 3) met en relation le taux de fluorescence produit dans une solution avec la concentration de l’agent fluorescent. A7 = ϵ7×  ℓ𝓁  ×  C   (éq. 3) Où Aλ correspond à l’absorbance ou au taux de fluorescence de la solution, ελ au coefficient d’extinction molaire, ℓ à la longueur du trajet optique dans la solution à traverser et C à la concentration de la molécule fluorescente (Gaulin, 2014). Le taux de fluorescence d'une solution est mesuré par un spectrofluorimètre et le fonctionnement de cet appareil (Figure  6) se résume comme suit. D'abord, de la lumière d'une longueur d'onde précise est émise et passe au travers de la solution contenant la molécule fluorescente afin de l'exciter (longueur d'onde d'excitation). Une fois excitée, la molécule commence à vibrer, ce qui dissipe une partie de son excès d'énergie et abaisse légèrement son niveau énergétique. Elle finit alors par libérer l'ensemble de son sur- plus d'énergie sous forme de photons à 360° (longueur d'onde d'émission). Ces photons sont captés par un détecteur placé à 90° par rapport à l'émetteur afin de limiter les interférences avec les longueurs d'ondes émises non absorbées (transmises) (Gaulin, 2014).   Figure 6: Schéma du fonctionnement d'un spectrofluorimètre (Équipe 1B, Oral intermédiaire 3). Afin de déterminer le pourcentage d'encapsulation de la berbérine dans les nanoparticules, il faut d'abord récupérer le surnageant obtenu après la première centrifugation effectuée dans les étapes de préparation. Ce surnageant, tel que mentionné précédemment, contient les molécules de berbérine qui n'ont pas été piégées dans les nanoparticules. Ensuite, un aliquot d'un volume précis du surnageant est prélevé et est analysé au spectrofluorimètre pour en déterminer le taux de fluorescence (Annexe A-3.1). Cette mesure est comparée à une courbe étalon préalablement établie de solutions de chlorure de berbérine de concen- trations connues et dont la fluorescence a été déterminée (Annexe A-2). En effet, en substituant la valeur de la fluorescence de l'aliquot dans l'équation de cette courbe étalon, il sera possible de trouver la con- centration de berbérine dans l'aliquot et, ensuite, de trouver la masse totale de berbérine n'ayant pas été encapsulée. Enfin, le pourcentage d'encapsulation peut être calculé avec la formule suivante (éq. 4) : % encapsulation berbérine = 100 x (masse ajoutée - masse non encapsulée)/masse ajoutée (éq. 4) Paramètres opératoires de la spectrofluorimétrie (un scan 3D pourrait être nécessaire) : •   Longueur d'onde d'excitation du chlorure de berbérine: 365 nm (évalué dans le méthanol 1mg/100 mL) (Gálvez et coll., 2006). Excitation Transmission Photons/émis Détecteur Échantillon
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      12 •  Longueurs d'onde d'émission du chlorure de berbérine: 450-550 nm (évalué dans une solution de méthanol 1mg/100 mL) (Gálvez et coll., 2006). •   Composition du blanc: surnageant d'un essai de préparation pour lequel aucun chlorure de berbé- rine n'aura été ajouté à la solution de chitosane. Une méthode alternative à la spectrofluorimétrie qui pourrait être utilisée en cas de problème est la spec- trophotométrie UV-visible. Cette méthode est semblable à la spectrofluorimétrie, mais elle implique la mesure de l'absorption de rayons lumineux par la berbérine et non la mesure de son activité fluorescente. L'absorption maximale du chlorure de berbérine s'effectue en émettant des longueurs d'onde de 229, 265, 347 et 425 nm (Bashmakova et coll., 2009). Les principaux avantages de la spectrofluorimétrie sont les suivants. D'abord, elle permet normalement une meilleure sensibilité que la spectrophotométrie. En effet, sa limite de détection est de l’ordre de 10-9 M versus 10-4 /10-5 M pour la spectrophotométrie (Gaulin, 2014). De surcroît, cette méthode est non des- tructive puisqu’il est possible de récupérer l’échantillon si nécessaire (Gaulin, 2014). Enfin, étant donné que peu de molécules sont fluorescentes, elle est très spécifique à la molécule d'intérêt (Gaulin, 2014). Toutefois, la spectrofluorimétrie comporte certains désavantages. La fluorescence est influencée par le pH, la température, le taux d'oxygène dissout ainsi que la présence d'ions métalliques en solution. Ces paramètres doivent donc être constants pour chacune des solutions testées (Gaulin, 2014). De plus, il est possible que certains photons émis par la substance fluorescente soient absorbés par d'autres composantes du milieu, ce qui peut fausser l'intensité du signal sur le détecteur et, ainsi, altérer la justesse du taux de fluorescence (Gaulin, 2014). 2.2.2 Cinétique de libération Les étapes nécessaires à l’évaluation de la cinétique de libération ressemblent à celles pour le pourcentage d’encapsulation étant donné qu'elles impliquent également l'utilisation de la spectrofluorimétrie. En fait, il s'agit d'abord de faire plusieurs aliquots de 3 mL de la solution de nanoparticules en suspension dans le tampon HEPES. Ensuite, il faut évaluer la concentration de chlorure de berbérine libérée à différents intervalles de temps, soit directement après la préparation, après 15min, 30min, 1h, 2h, 24h, 48h, puis après 7 jours. La raison pour laquelle la concentration est évaluée plusieurs fois dans les deux heures qui suivent la fin de la préparation est que la majorité des médicaments (dont le chlorure de berbérine) pro- fitent d'un effet « burst », soit une libération rapide dans les quelques heures suivant l'encapsulation (voir la section 3. Résultats escomptés). Pour déterminer la concentration de chlorure de berbérine libérée à un temps donné, les aliquots seront centrifugés et le surnageant sera recueilli afin d'en faire une lecture de la fluorescence. Puis, cette lecture sera substituée dans l'équation de la courbe étalon de chlorure de berbérine. Enfin, une courbe de la quantité de berbérine libérée en fonction du temps permettra alors de déterminer la cinétique de libération de la berbérine. La grande sensibilité de la spectrofluorimétrie est alors très utile, puisqu'il est probable que de très faibles quantités de berbérine se retrouvent en solution pour certains intervalles de temps. D'ailleurs, il est important de noter que la cinétique de libération sera évaluée dans diverses conditions de température, soit à -80°C, à 4°C et à 37°C. Il est intéressant d'évaluer la cinétique de libération à une température de -80°C afin de voir si les nanoparticules particules peuvent être conservées en étant con- gelées (si la congélation ne provoque pas la diffusion de la berbérine à l'extérieur de la nanoparticule). Il est également logique de vérifier la cinétique de libération à 37°C étant donné qu'il s'agit de la tempéra- ture corporelle, soit celle à laquelle les nanoparticules seraient soumises dans un réel contexte biomédi- cal.
  • 13.
      13 Toutefois, l'évaluationde la cinétique à ces conditions de température pose certaines limites méthodolo- giques qui pourraient altérer la représentativité des résultats obtenus. D'abord, une lecture de la fluores- cence est effectuée 15 minutes après avoir terminé les essais de préparation. Or, pour les aliquots gardés à -80°C, il est possible que ce temps ne permette pas une congélation complète et, ainsi, que la lecture ne soit pas représentative de la condition de l'aliquot. Dans un même ordre d'idées, il est probable que la température des échantillons à 4°C et à 37°C n'atteignent pas ces valeurs lorsqu'ils auront seulement été incubés pendant 15 minutes à ces conditions. Encore une fois, cela contribuerait à diminuer la représen- tativité des résultats. De plus, tous les échantillons à -80°C doivent être décongelés dans un bain d'eau avant d'être centrifugés et transférés sur la plaque de lecture du spectrofluorimètre. Or, il est probable que le chlorure de berbérine soit libéré de la matrice de chitosane lors de cette étape, ce qui viendrait fausser la cinétique de libération. Enfin, la centrifugation est effectuée à 4°C, ce qui implique que la température des aliquots sera légère- ment abaissée dans le cas des échantillons conservés à 37°C. 2.2.3 Taille et nombre de nanoparticules La microscopie électronique est utilisée comme alternative à la microscopie photonique (utilisant la lu- mière), puisqu’elle offre une résolution bien supérieure. Un microscope photonique ne peut distinguer un écart plus grand que 0,2 micromètres. En effet, la résolution de ce type de microscope est limitée par la longueur d’onde de la lumière utilisée ainsi que la qualité et le nombre de lentilles dans le microscope. Par conséquent, même si l’on augmente indéfiniment le nombre de lentilles, la résolution sera toujours limitée à cause de la longueur d’onde de la lumière (FEI Corporation, 2010). Toutefois, les électrons ont une longueur d’onde 100 000 fois plus courte que celle de la lumière. Par conséquent, lorsqu’on utilise un microscope électronique muni de lentilles électrostatiques et électromagnétiques pour concentrer le rayon d’électrons (FEI Corporation, 2010), cela permet d’avoir une résolution de 0,1 nanomètre, c’est- à-dire à l’échelle atomique plutôt que cellulaire. Dans le cadre de ce projet, le but est d’utiliser la microscopie électronique à balayage comme méthode de caractérisation afin de déterminer la taille, la forme, et le nombre de nanoparticules présentes dans la solution. En effet, à cause de sa résolution allant de 0,1 nm à 100 000 nm, ce type de microscopie sert d’excellent outil de caractérisation (FEI Corporation, 2010). La microscopie électronique à balayage (MEB) est surtout utilisée lorsqu’on souhaite observer la surface de l’échantillon, plutôt que de le pénétrer afin d’en examiner l’intérieur (Zaluzec, 2009). Cependant, afin d’obtenir une bonne résolution de l’image, il est nécessaire de préparer l’échantillon. Puisque le but de cette caractérisation est simplement d’observer la surface de l’échantillon et de compter les nanoparti- cules, il faudra les assécher avec la méthode de la lyophilisation (voir la section 2.2.3.1), puis les insérer dans la chambre sous vide du microscope (AMMRF, 2012). Puisque la MEB utilise des électrons, il est nécessaire de s’assurer que l’échantillon est assez conducteur pour produire une image de qualité en évitant l’accumulation de charges. Pour ce faire, une des méthodes les plus utilisées dans la littérature est la métallisation (coating) de nanoparticules à l’aide d’une fine couche de carbone, d’or ou de platine ajoutée à la surface de l’échantillon. Le choix de la métallisation dépend de l’image qui doit être obtenue. Si le but est d’obtenir une analyse compositionnelle des nano- particules (c’est-à-dire une analyse des éléments qui les composent), l’utilisation d’une métallisation de carbone est préférée puisque l’or ou le platine risquent de causer une interférence. Dans le cas d’une analyse topographique, l’utilisation d’or et de platine est préférée (AMMRF, 2012).
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      14 La pulvérisationcathodique est une méthode utilisée lors de la métallisation utilisant de l’or et du palla- dium. L’échantillon est d’abord déposé sur l’anode de la chambre à vide de l’appareil, alors que la ca- thode contient le métal qui doit être utilisé pour la métallisation. Une fois la chambre purgée avec de l’argon, un courant électrique est appliqué, permettant ainsi aux atomes de métal d’enrober en fine couche l’échantillon. L’échantillon est ensuite prêt à être observé via microscopie électronique (Magny, Gitzho- fer, 2000). Une fois l’image obtenue, il sera possible de dénombrer les nanoparticules présentes dans l’échantillon, puis de déterminer le nombre de nanoparticules total en utilisant le rapport volume de l’échantillon/vo- lume total. En combinant ce nombre avec la masse de berbérine encapsulée (déterminée précédemment), la quantité moyenne de berbérine se trouvant dans une nanoparticule (Q) pourra être trouvée (éq. 5) : Q = masse de berbérine encapsulée/nombre de nanoparticules (éq. 5) Puis, il sera possible de déterminer la taille des nanoparticules et, ainsi, de s’assurer que leurs dimensions soient bel et bien de l’ordre du nanomètre. La forme ainsi que l'homogénéité des nanoparticules pourront également être observées. La microscopie électronique laisse tout de même place à une marge d’erreur. En effet, étant donné que seul un échantillon très limité est évalué, il est probable que cet échantillon ne soit pas représentatif de la totalité de la solution, ce qui pourrait amener à des résultats différents de ceux escomptés. Cependant, il est possible que la taille des nanoparticules soit plus grande que prévue, à cause d'une erreur dans l’exécution du protocole. Si tel est le cas, il est possible qu'un microscope électronique ne soit pas nécessaire et qu'un microscope photonique dont la résolution peut aller jusqu’à 0,2 micron puisse être utilisé (FEI Corporation, 2010). 2.2.3.1 La lyophilisation Même si les nanoparticules ont une grande utilité dans le domaine, leur faible stabilité en milieu aqueux forme un obstacle à leur entreposage à long terme (Abdelwahed, 2006). En effet, des phénomènes comme l’agrégation et/ou la fusion des particules, les réactions d’hydrolyse du polymère qui forme la nanopar- ticule, la perte de la substance active, et autres, nuisent à la stabilité des nanoparticules. Pour pallier à ce problème, il est nécessaire d’enlever l’eau du colloïde (Abdelwahed, 2006). Le produit final est donc un échantillon de nanoparticules lyophilisées, donc sans trace d’eau à 99%. Cela est très utile non seulement pour la conservation à long terme, mais aussi pour la caractérisation au microscope électronique, qui requiert un échantillon lyophilisé (Abdelwahed, 2006). La lyophilisation de nanoparticules se fait en trois étapes. Comme le principe de lyophilisation consiste en la sublimation de l’eau, la première étape consiste donc à congeler le colloïde (Abdelwahed, 2006). Dans la littérature, il est dit que la température du colloïde lors de la phase de congélation peut être au- dessus du point de transition vitreuse sans que cela n’affecte la forme et la stabilité des nanoparticules avec un agent cryoprotecteur (Beirowski, 2011). Pour cette étape, le lyophilisateur sera réglé à -40°C pour 240 minutes (Hirsjärvi, 2009). Dans le cas d’un colloïde de nanoparticules de chitosane, il faut utiliser du tréhalose à une concentration de 15% et un ratio de poids de 1:1 avec les nanoparticules. Le tréhalose est choisi car il est le plus efficace en tant qu’agent cryoprotecteur et agent lyoprotecteur pour les biomolécules (Abdelwahed, 2006). Il est important d’effectuer la congélation à une haute vitesse pour ne pas modifier les caractéristiques du produit pour pouvoir les analyser au microscope électronique. Ainsi, le refroidissement à l’azote liquide peut être la meilleure option (Abdelwahed, 2006). Il peut rester un petit pourcentage d’eau qui n’aura pas gelé, mais elle sera traitée à l'étape du séchage secondaire. (Abdelwahed, 2006)
  • 15.
      15 Par lasuite, il faut effectuer un séchage primaire du colloïde gelé. Pour cela, il faut mettre l’échantillon sous vide et régler la température à -35°C. La pression devrait être d’environ 150 mTorr. Il faut ensuite laisser la glace sublimer pour 1020 minutes (Hirsjärvi, 2009). Dans le cas d’une solution de nanoparti- cules, il n’est pas nécessaire de mettre la température sous le point Tc (collapse temperature), donc ce n’est pas un paramètre à vérifier avant d’effectuer les manipulations (Beirowski, 2011). Finalement, la troisième étape est d’effectuer un séchage secondaire du colloïde partiellement lyophilisé. À cette phase, il ne devrait rester que 7-8% d’eau dans la solution de nanoparticules. Il s’agit de l’eau qui n’a pas gelé (Labconco, 2010). Pour cette étape, il faut mettre la température à 20°C et la pression au minimum possible. Dans la littérature, il est dit de la mettre à 50 mTorr. Le temps du séchage secondaire est de 180 minutes (Hirsjärvi 2009). Une fois le colloïde lyophilisé, le produit obtenu est poreux dû au fait des molécules de glace qui se sont évaporés entre les nanoparticules. La concentration en eau du produit final devrait être de 1% et moins (Abdelwahed, 2006). Les nanoparticules lyophilisées peuvent ainsi être conservé à la température pièce. Toutefois, pour maxi- miser la quantité de berbérine au sein de nos nanoparticules après 12 mois, il est préférable de garder les nanoparticules à 4°C (Abdelwahed, 2006). Pour réhydrater les nanoparticules, il faut ajouter la même quantité d’eau qui a été retirée au départ. Il est donc nécessaire de conserver l’eau évaporée au cours du processus pour connaître la quantité d’eau pour réhydrater (Abdelwahed, 2006).            
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      16 3. RÉSULTATSESCOMPTÉS 3.1 Résultats de la préparation des nanoparticules Lors de la préparation des nanoparticules, des « pré-résultats » permettront de déterminer si les protocoles explicités dans ce rapport fonctionnent. D’abord, les nanoparticules de chitosane sont préparées par la méthode de la réticulation ionique. La préparation résultera par l’obtention d’une substance laiteuse. En effet, successivement aux diverses manipulations, des nanoparticules homogènes sont formées au mo- ment où la solution passe de claire à opaque. Les nanoparticules ainsi formées restent en suspension dans la solution (Zhou et coll., 2014). De même, si des agrégations se forment entre les nanoparticules, un amas sera facilement visible dans la solution de préparation. Après centrifugation de cette solution, le surnageant sera composé principalement d’acide acétique, mais aussi de chlorure de berbérine (exceptant lors de la préparation de nanoparticules vides), de STPP, de chitosane et de DMSO. Le culot sera, quant à lui, composé de nanoparticules de chitosane. 3.2 Résultats de la caractérisation des nanoparticules Ensuite, quelques caractéristiques des nanoparticules seront déterminées, soit leur taille, leur pourcentage d’encapsulation et leur cinétique de libération. Premièrement, la taille des nanoparticules est déterminée par la microscopie électronique à balayage (MEB). Tel que mentionné précédemment, plusieurs para- mètres peuvent influencer la taille des nanoparticules préparées, soit, entre autres, le pH, la température, le rythme d’ajout du STPP, la concentration du chitosane, la concentration du STPP et la quantité ajoutée de chlorure de berbérine. Dans ce présent laboratoire, seule la quantité de berbérine ajoutée est modifiée. Le pH, la température et le rythme d’ajout du STPP seront constants d’un essai à l’autre. La concentration de chitosane restera de 1 % m/v et celle de STPP restera de 5 mg/ml. Selon l’étude de Chou et coll., avec ces dernières concentrations, la taille moyenne des nanoparticules sèches de chitosane vides serait d'en- viron 15 nm (Figure 7). Les nanoparticules "témoin" préparées selon le protocole A-1.2 devraient donc avoir une taille similaire à cette valeur. Il est à noter que la colonne DLS de la Figure 7, soit la diffusion dynamique de la lumière (une technique d'analyse spectroscopique), donne la taille des nanoparticules lorsqu'elles se trouvent en solution (Fritsch, 2015). Dans le présent rapport, l'utilisation de cette technique n'est pas prévue. Par contre, comme l'indique la Figure 7, la taille réelle des nanoparticules est sous- estimée lorsqu'elle est déterminée par MEB puisque lorsque les nanoparticules voyagent en solution, une couche de liquide les recouvre et augmente le rayon de ces dernières (rayon hydrodynamique) (Fritsch, 2015). Figure 7: Taille des nanoparticules sans berbérine (Chou et coll., 2013). Dans les protocoles du présent rapport, un ration de chitosane/STPP de 5:1 dans la solution de préparation sera utilisé. Tel que mentionné précédemment, il s'agit du ratio pour lequel les nanoparticules obtenues sont le plus homogène et, surtout, pour lequel les images de la MEB sont les plus faciles à interpréter. La Figure 8 présente le type d'image qui devrait être obtenu si des agrégats sont formés (ii) ou non (iii).
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      17 Figure 8:Nanoparticules ne formant pas d'agrégats (ii) formant des agrégats (iii) (Chou et coll., 2013). Des quantités de 4.2, 8.4, 16.8 et 21.0 mg de chlorure de berbérine seront ajoutées à la solution d’acide acétique et de chitosane pour la formation de nanoparticules renfermant l’agent actif. Selon l’étude de Chou et de ses collaborateurs, les nanoparticules obtenues auront une taille moyenne comprise approxi- mativement entre 60 et 110 nm, tel que présenté à la Figure 9. D'ailleurs, une augmentation de la quantité de berbérine ajoutée induit une augmentation de la taille moyenne des nanoparticules.   Deuxièmement, tel que démontré à la colonne EE de la Figure 9 (encapsulation efficiency), pour des quantités de 4.2, 8.4, 16.8 et de 21.0 mg de chlorure de berbérine, les pourcentages d’encapsulation at- tendus sont d'environ 10 à 11%. D'ailleurs, il est possible de constater qu'une relation de variation inverse est présente entre la quantité de berbérine ajoutée et le pourcentage d’encapsulation (Chou et coll., 2013).     Figure 9: Propriétés des nanoparticules selon les quantités de berbérine ajoutées (Chou et coll., 2013).   En ce qui concerne la cinétique de libération de la berbérine, les résultats de la littérature indiquent que les nanoparticules préparées avec 8.4 mg et 16.8 mg de berbérine profitent d'une libération rapide dans les 24h suivant leur préparation (effet « burst »). En effet, dans le PBS à 37°C et à un pH de 7.4, plus de 65% de la berbérine est relâchée dans cet intervalle de temps pour les nanoparticules à 16.8 mg et 52,85% est relâchée pour les nanoparticules à 8.4 mg (Figure  10). La libération s'est ensuite poursuivie de manière pratiquement constante sur trois jours. Les résultats montrent également que la cinétique de libération des nanoparticules contenant 4.2 mg de chlorure de berbérine est significativement plus lente que celle des précédentes.
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      18 Figure 10:Cinétique de libération des nanoparticules contenant de la berbérine (Chou et coll., 2013). Les résultats escomptés diffèrent légèrement des résultats présentés à la Figure  10. En effet, les courbes de cinétique de cette figure sont évaluées alors que les nanoparticules ont été resuspendues dans le PBS. Cependant, à cause des groupements phosphate qu'il contient, il est possible que ce tampon ait déstabilisé les nanoparticules et qu'il ait donc provoqué une libération plus rapide de la berbérine. En se basant sur cette hypothèse, les cinétiques de libération observées dans le cadre du présent rapport pourraient être plus lente en raison du fait que le tampon choisi (HEPES) n'est, en théorie, pas censé interagir avec les groupements amine des chaînes de chitosane. D'ailleurs, les données des courbes présentées ont été éva- luées à 37°C. Les protocoles de ce rapport prévoient également de tester les cinétiques de libération dans des conditions de température de -80°C et 4°C. À ces températures, les vitesses de libération du chlorure de berbérine pourraient être moindres (voir nulles pour les échantillons à -80°C) en raison du fait que ces conditions rendent le chitosane plus visqueux et plus rigide (Wen et coll., 2011).
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      19 4. BUDGET LeTableau  2 présente les produits et les équipements consommables nécessaires à la réalisation du pro- jet. Au total, 15 essais de préparation seront réalisés (5 concentrations de chlorure de berbérine réalisées en triplicata) et, pour certains protocoles de la caractérisation, les échantillons seront décuplés à 375 (voir l'annexe A-3.2). Les quantités requises indiquées dans la dernière colonne représentent les quantités né- cessaires à la réalisation de tous les essais, multipliées par un facteur 2 afin d'assurer qu'aucun produit ne soit en manque lors des manipulations. Tableau 2: Liste d'épicerie de l'équipe 1B et coûts afférents.             Produit Compagnie Numéro Prix affiché Quantité requise Acide acétique glacial (≥ 99,7%) Sigma-Aldrich 320099-500ML 59,70$ (500 mL) ≈ 150 ml Chitosane Sigma-Aldrich 448869-250G 217,50$ (250 g) ≈ 120 g Chlorure de berbérine Sigma-Aldrich PHR1502-500MG 112,40$ (500 mg) ≈ 320 mg DMSO Sigma-Aldrich D8418-50ML 42,80$ (50 mL) ≈ 10 ml HEPES (1M) Sigma-Aldrich H0887-100ML 67,60$ (100 mL) ≈ 60 ml STPP Sigma-Aldrich 238503-500G 42,90$ (500 g) ≈ 40 g Équipement Compagnie Numéro Prix affiché Quantité requise Tube Falcon 50 mL Sigma-Aldrich CLS4558-25EA 51,60$ (50) Tube à centrifuger 5 mL Sigma-Aldrich Z688223-200EA 110,60$ (400) Embouts P200 Sigma-Aldrich Z740030-1000EA 32,70$ (1000) Embouts P1000 Sigma-Aldrich Z740031-1000EA 40,20$ (1000) Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956-1PAK 13,30$ (280) Plaque 96 puits Sigma-Aldrich P8991-30EA 350,50$ (30) Nacelle de pesée Sigma-Aldrich Z154849-1PAK 27,10$ (100) Gants nitrile Sigma-Aldrich Z677272-100EA 65,70$ (100) Unité de filtration Sigma-Aldrich Z370541-12EA 115,00$ (12) TOTAL: 1350$
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      20 5. RISQUESET MESURES DE SÉCURITÉ Tableau 3: Mesures de prévention selon les produits utilisés.                             Les manipulations nécessaires à la préparation des nanoparticules s'effectueront sous une hotte chimique, ce qui peut remplacer les équipements de protection respiratoires nécessaires lors de l'utilisation d'acide acétique glacial. Des gants en viton, caoutchouc, nitrile ou néoprène, un sarrau ainsi que des lunettes avec protection latérale sont tout de même de mise (Brenntag Canada Inc) puisque l’acide acétique glacial est un produit très corrosif (Brenntag Canada Inc). D’autre part, il est très important de tenir toute flamme éloignée de ce produit puisqu’il est inflammable. Les vapeurs de l’acide acétique peuvent traverser de grandes distances jusqu’à une source d’ignition et provoquer un retour de flamme qui pourrait par la suite provoquer une explosion. Du fait même, le contact avec un agent oxydant peut provoquer le feu (Brenn- tag Canada Inc). Pour le DMSO, les mêmes mesures pour les cas d’incendie sont nécessaires puisque ce produit est autant inflammable que l’acide acétique (Anechmia Canada Inc). Le port des gants n’est pas seulement pratique puisque le produit est corrosif, mais aussi puisqu’il peut être absorbé de plusieurs façons soit par inhalation par le contact avec les yeux et par la peau (Brenntag Canada Inc). À des con- centrations de 50 ppm dans le corps, il devient dangereux pour la vie (Brenntag Canada Inc). S’il y a contact avec les yeux, le rinçage immédiat à l’aide d’une douche oculaire est de mise et doit durer au moins une minute (Brenntag Canada Inc). S’il y a contact cutané, rincer immédiatement à grande eau pendant 15 minutes tout en retirant les vêtements ou les chaussures contaminés (Brenntag Canada Inc). S’il y a inhalation, apporter la victime à grande air et, si elle respire difficilement, administrer de l’oxy- gène à l’aide d’un respirateur agréé (Brenntag Canada Inc). S’il y a ingestion, il est très important de ne pas faire vomir la victime pour ne pas irriter son œsophage (Brenntag Canada Inc). Dans tous les cas présentés, il est important d’obtenir de l’aide médicale le plus tôt possible (Brenntag Canada Inc). Aux risques de manipulation des produits s'ajoutent les risques de manipulation des nanoparticules. En effet, il a été prouvé que les nanoparticules ayant un diamètre inférieur à 320 nm pénètrent la peau non pas par les pores, mais par les follicules des poils et des cheveux (Lademann and Richter, 2006). Par contre, étant donné que le chitosane et la berbérine sont des molécules non toxiques qui, par le fait même, détiennent une très bonne pharmacocinétique d’excrétion (Lademann and Richter, 2006), il n’y a aucun effet direct sur la santé des chercheurs s’il y a à avoir pénétration par les follicules. Toutefois, il est possible que, lors de la formation des nanoparticules, des solvants (p. ex. l'acide acétique), des polluants atmosphériques ou même des microorganismes se fixent aux nanoparticules. Si tel est le cas et qu'il y a
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      21 pénétration, cesagents pourraient atteindre les cellules et mettre en danger la santé du ou des manipula- teurs (Mahérou et coll., 2014). Un équipement de protection individuel (gants, sarrau et lunettes à pro- tection latérale) est donc obligatoire, d'autant plus qu'il a été démontré que le DMSO amplifie l'effet de pénétration des nanoparticules (Ho, 2010). Enfin, lors de l’utilisation du microscope électronique à ba- layage, il est important de laisser tout élément liquide le plus loin possible du microscope. Cette mesure vise à prévenir les cas d'électrocution causés par le voltage très élevé qui est utilisé par cet appareil. Afin d'assurer la sécurité de chacun des manipulateurs dans le laboratoire, une bonne communication est de mise. Les manipulateurs devraient réduire leurs déplacements au stricte minimum dans le laboratoire et avertir leurs coéquipiers lors du déplacement d'un produit dangereux. Chaque membre de l'équipe a d'ailleurs la responsabilité d'identifier convenablement chacune des solutions préparées afin d'éviter les mélanges fautifs et dangereux de solutions. Enfin, il est important de rappeler que le travail de laboratoire à huit manipulateurs demande une organisation rigoureuse. Ainsi, au début de chaque séance de labora- toire, les manipulateurs de l'équipe se regrouperont afin de faire une brève planification du déroulement de la séance. Cela a pour objectif de limiter les pertes de temps et les accidents. En ce qui concerne l’élimination des déchets chimiques, deux cruches seront nécessaires, soit une pour jeter les nanoparticules et le tampon HEPES et l’autre pour jeter les produits restant, soit l’acide acétique, le DMSO, le chlorure de berbérine, le STPP et le chitosane. Le premier contenant sera acheminé vers les produits organiques solides ayant un pH de 7 et le second sera envoyé vers les produits organiques li- quides ayant un pH inférieur à 7.    
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      22 6. PLANIFICATIONEXPÉRIMENTALE DE LA PROCHAINE SESSION Le Tableau 4 présente les protocoles à effectuer selon les différentes semaines de la session Hiver 2016. Au cours des deux premières semaines, la préparation des nanoparticules sans chlorure de berbérine sera effectuée. Ceci a pour but de vérifier si les protocoles proposés dans le présent rapport permettent ou non la formation de nanoparticules. Dans l'éventuel cas où des nanoparticules sont bel et bien formées, ces deux semaines serviront également à voir si des agrégations se forment lors de la préparation. Si tout se passe comme prévu, alors, dès la troisième semaine, des nanoparticules contenant de la berbérine seront préparées. Étant donné que la libération de la berbérine peut débuter dès la fin des étapes de préparation, il est nécessaire d'évaluer la cinétique de libération à chaque fois que de nouvelles nanoparticules sont préparée (0, 15min, 30min, 1h et 2h). Les autres intervalles de temps de la cinétique de libération seront évalués le lendemain (24h), le surlendemain (48h) et la semaine suivante (7 jours) avant de commencer tout autre protocole. Au cours de la neuvième semaine, aucune manipulation n'a été prévue puisqu'il s'agit de la semaine de relâche et des entrevues pour les stages. Toutefois, si besoin est, certains membres de l'équipe pourraient venir compléter certaines manipulations. Dans un même ordre d'idées, l'échéancier prévoit deux semaines libres avant la fin des cours afin de compiler les résultats obtenus et en faire l'analyse finale. Tableau 4: Protocoles à effectuer selon les semaines de la session.                
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      23 7. CONCLUSION Dansce rapport, la méthodologie nécessaire à la préparation et à la caractérisation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine a été explicitée. En effet, la méthode de la réticulation ionique avec le tripolyphosphate de sodium sera employée pour la formation des nanoparticules. Cinq essais réalisés en triplicata seront alors effectués et seule la concentration de chlorure de berbérine ajoutée diffèrera d'un essai à l'autre. Cela permettra d'obtenir des nanoparticules dont la taille, le pourcentage d'encapsulation et la cinétique de libération varieront. Les nanoparticules qui présentent le meilleur profil de libération de chlorure de berbérine et qui en contiennent une quantité suffisante pour avoir des effets sur les cellules B16F10 (≈ 50 µM) seront reproduites et stérilisées avec une unité de filtration sous vacuum pour ensuite les transmettre à l'équipe 1C. Le pourcentage d'encapsulation ainsi que la cinétique de libération des nanoparticules seront déterminés par spectrofluorimétrie. Les pourcentages d'encapsulation attendus sont de l'ordre de 10 à 11%, alors qu'il est prévu que les cinétiques de libération de chlorure de berbérine varieront significativement d'un essai à l'autre. Les nanoparticules préparées avec une quantité plus élevée de chlorure de berbérine (8.4 mg et 16.8 mg) relâcheraient plus rapidement le principe actif en profitant d'un effet de « burst » dans les 24 premières heures suivant leur préparation. De même, les nanoparticules maintenues à 37°C devraient relâcher le chlorure de berbérine plus rapidement que celles incubées à 4°C et à -80°C. En ce qui a trait à la taille des nanoparticules, elle sera évaluée par la microscopie électronique à balayage. Les échantillons de nanoparticules devront donc préalablement être séchés par la méthode de la lyophi- lisation. Les tailles des nanoparticules sèches attendues sont d'approximativement 60 nm à 110 nm pour celles ayant été préparées avec du chlorure de berbérine et de l'ordre de 15 nm seulement pour celles ne comportant pas de principe actif. Si les étapes de préparation et de caractérisation des nanoparticules se déroulent sans problème majeur, alors le budget nécessaire à la réalisation des expériences est d'environ 1350,00 $. Ce montant considère des quantités de produit deux fois plus élevées que ce qui est réellement requis afin d'assurer qu'aucun produit ne vienne à manquer lors des manipulations. D'ailleurs, dans l'éventuel cas où l'équipement serait déjà disponible au laboratoire de l'Université, alors le montant pourrait être revu à la baisse de 800,00$. Il est important de rappeler que les nanoparticules préparées dans le cadre de ce laboratoire ne pourront être utilisées à des fins biomédicales étant donné qu'elles ne rempliront pas les normes très élevées de ce standard et qu'elles ne comportent pas de ligand pouvant reconnaître directement les cellules cancéreuses par rapport aux cellules saines. Cependant, l'exécution des protocoles du présent rapport permettra aux membres de l'équipe d'évaluer la facilité et l'efficacité de la préparation et de la caractérisation des nano- particules produites. Ainsi, dans un contexte d'ingénierie, ils pourront discuter de la viabilité de la mé- thode afin qu'éventuellement, des nanoparticules puissent être produites à grande échelle et être rendues disponibles dans les établissements de santé comme alternative à la chimiothérapie.  
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      24 Médiagraphie Abdelwahed, W.,Degobert, G., Stainmesse, S., & Fessi, H. (2006). Freeze-drying of nanoparticles: for- mulation, process and storage considerations. Advanced drug delivery reviews. Consulté le 22 octobre 2015. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X06001840 Abdul Ghafoor Raja, M. et coll. (2015).  Stability, Intracellular Delivery, and Release of siRNA from Chitosan Nanoparticles Using Different Cross-Linkers. PLOS ONE, volume 10, n° 6. Anechmia Canada Inc, fiche signalétique diméthyle sulfoxyde, Toronto, dernière mise à jour le 17 sep- tembre 2013, http://www.anachemia.com/msds/french/6180f.pdf, consulté le 20 novembre 2015 Anachemia. Fiche signalétique Tripolyphosphate de sodium [publication Web]. Consulté le 19 octobre 2015. http://www.anachemia.com/msds/french/8552f.pdf Australian Microscopy & Microanalysis Research Facility (AMMRF) (2012), Sample Preparation|My Scope [site Web]. Consulté le 21 octobre 2015. http://www.ammrf.org.au/myscope/sem/prac- tice/sample/#prettyPhoto Bahrke, S. et coll. (2003). Pharmaceutical composition comprising chito-oligomers. Google Patents. Bashmakova, N. et coll. (2009). Optical spectroscopy studies of the interaction between a number of plant alkaloids and the dna double helix in an aqueous solution. Ukrainian Journal of Physics, volume 54, n° 5, p. 471-479. Beirowski, J., Inghelbrecht, S., Arien, A., & Gieseler, H. (2011). Freeze drying of nanosuspensions, 2: the role of the critical formulation temperature on stability of drug nanosuspensions and its practical implication on process design. Journal of pharmaceutical sciences. Consulté le 22 octobre 2015. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jps.22634/pdf Brenntag Canada Inc, Fiche signalétique acide acétique, Toronto, créé le 17 janvier 2014, dernière mise à jour le 17 janvier 2014. Consulté le 20 octobre 2015. http://candmz04.brenn- tag.ca/MSDS/Fr/00062279.pdf Brenntag Canada Inc, fiche signalétique tripolyphosphate de sodium, Toronto, créé le 12 mars 2013, dernière mise à jour le 12 mars 2013. Consulté le 20 octobre 2015. http://candmz04.brenn- tag.ca/MSDS/Fr/00060722.pdf Centre canadien d’hygiène et de sécurité au travail (13 novembre 2015) Centre canadien d’hygiène et de sécurité au travail [site web]. Consulté le 15 novembre 2015. http://www.cchst.ca/os- hanswers/chemicals/ld50.html Chih-Hui, Y. et coll. (2009). Microfluidic emulsification and sorting assisted preparation of monodis- perse chitosan microparticles. Lab Chip, volume 9, p.145-150.   Chou, C. et coll. (2013). Highly bioavailable anticancer herbal-loaded nanocarriers for use against breast and colon cancer in vitro and in vivo systems. Polymer Chemistry, no. 4, p. 2040-2052.
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      25 CNRS (2015).La vectorisation des médicaments. Sur le site du Centre National de la Recherche Scien- tifique. Consulté le 18 novembre 2015. http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosnano/de- couv/03/03_2_2/05.htm De Jong, W. et Borm, P. (2008). Drug delivery and nanoparticles: Applications and hazards. Internatio- nal journal of nanomedicine, volume 3, n° 2, p. 133-149. Faucheux, N. (2015), GBT 415 2015. Sherbrooke: Université de Sherbrooke, Faculté de génie. FEI Corporation (2010). An Introduction to Electron Microscopy [pamphlet], sur le site UCLA Nanoe- lectronics Research Facility. Consulté le 20 octobre 2015. http://www.nano- lab.ucla.edu/pdf/Introduction_to_EM_booklet_July_10.pdf Gálvez, E. et coll. (2006). General Contribution of Nonspecific Interactions to Fluorescence Intensity. Analytical Chemistry, volume 78, p. 3699-3705. Gaulin, Jean-Philippe, Analyse instrumentale I (2014) [Notes de cours], Cégep de Sherbrooke, Au- tomne 2014. Hasanzadeh Kafshgari, M. et al. (2012). Preparation of alginate and chitosan nanoparticles using a new reverse micellar system. Iranian Polymer Journal, volume 21, n° 2, p. 99-107. Heimburger, F. (2010). « Les médicaments sont plus efficaces sous forme de nanoparticules » dans la revue La Recherche. n°444, p. 68. Consulté le 18 novembre 2015. http://www.lare- cherche.fr/savoirs/portrait/medicaments-sont-plus-efficaces-forme-nanoparticules-01-09- 2010-78979 Hirsjärvi, S., Peltonen, L., & Hirvonen, J. (2009). Effect of sugars, surfactant, and tangential flow fil- tration on the freeze-drying of poly (lactic acid) nanoparticles. AAPS PharmSciTech. Consulté le 22 octobre 2015. http://link.springer.com/article/10.1208/s12249-009-9236-z HO, Dean (2010). Nanodiamonds. Applications in biology ans nanoscale medicine [livre]. Sur le site Google Books. Consulté le 25 octobre 2015. https://books.google.ca/books?id=uKcDZ37Amh4C&pg=PA106&lpg=PA106&dq=DMSO+n anoparticles+penetration&source=bl&ots=- tbL5dK0xj&sig=DL04LD84PLeqWG2xE0Kw4HoR3p8&hl=fr&sa=X&ved=0CDkQ6AEw- BDgKahUKEwi9yuml-97IAhWEXR4KHTARDoY#v=onepage&q=DMSO%20nanopar- ticles%20penetration&f=false Ifremer (août 2010). Chitine et chitosan [publication web]. Consulté le 20 octobre 2015. http://www.bi- bliomer.com/documents/fiches/Chitine_et_chitosan_vf.pdf INESSS (2012). Accessibilité à des médicaments anticancéreux à caractère jugé prometteur [page web]. Consulté le 18 novembre 2015. https://www.inesss.qc.ca/fileadmin/doc/INESSS/Rap- ports/Medicaments/INESSS_Accessibilite_medicaments_anticancereux_prometteurs.pdf Jiaolin, B. et coll. (2015). Hormetic Effect of Berberine Attenuates the Anticancer Activity of Chemo- therapeutic Agents. Plos One. Volume 10, n° 9.
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      28 Sigma-Aldrich, Dimethylsulfoxide for molecular biology [site Web]. Consulté le 19 octobre 2015. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=fr&region=CA Sigma-Aldrich, Fiche de données de sécurité berberine chloride, créé le 21 octobre 2010, dernière mise à jour le 27 mai 2011. Consulté le 20 octobre 2015. https://intranet.ssp.ulaval.ca/cgpc/fsss/fi- chiers/Berberine%20chloride%20form.pdf Sigma-Aldrich, Fiche de données de sécurité diméthylsulfoxyde, créé le 5 juillet 2014, dernière mise à jour le 5 juillet 2014. Consulté le 25 octobre 2015. ftp://ftp.mern.gouv.qc.ca/Public/Drf/Fi- chesSignaletiques/MSDS/67-68-5.pdf Sigma-Aldrich, Fiche de données de sécurité glycol chitosan, créé le 14 janvier 2015, dernière mise à jour le 26 juin 2015. Consulté le 20 octobre 2015. ftp://ftp.mern.gouv.qc.ca/Public/Drf/Fi- chesSignaletiques/MSDS/123938-86-3.pdf Sigma-Aldrich, HEPES [site Web]. Consulté le 19 octobre 2015. http://www.sigmaaldrich.com/cata- log/product/sigma/h4034?lang=fr&region=CA Sigma-Aldrich, Sodium tripolyphosphate technical grade, 85% [site Web]. Consulté le 19 octobre 2015. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/238503?lang=fr&region=CA Sobolewski, C. et coll. (2010). The Role of Cyclooxygenase-2 in Cell Proliferation and Cell Death in Human Malignancies. International Journal of Cell Biology, volume 2010, 21 p. Société canadienne du cancer (juin 2015). Statistiques canadiennes sur le cancer 2015 [publication Web]. Consulté le 20 octobre 2015. http://www.cancer.ca/~/media/cancer.ca/CW/can- cer%20information/cancer%20101/Canadian%20cancer%20statistics/Canadian-Cancer-Statis- tics-2015-FR.pdf Société canadienne du cancer (2015). La chirurgie [site web]. Consulté le 18 novembre 2015. http://www.cancer.ca/fr-ca/cancer-information/diagnosis-and-treatment/surgery/?region=on   Société canadienne du cancer (2015). Effets secondaires de la chimiothérapie [site web]. Consulté le 20 octobre 2015. http://www.cancer.ca/fr-ca/cancer-information/diagnosis-and-treatment/chemo- therapy-and-other-drug-therapies/chemotherapy/side-effects-of-chemotherapy/?region=qc Société canadienne du cancer (2015). Vue d'ensemble du cancer métastatique [site web]. Consulté le 20 octobre 2015. http://www.cancer.ca/fr-ca/cancer-information/cancer-type/metastatic-can- cer/metastatic-cancer/?region=on Société de recherche sur le cancer (2015). Traitements du cancer - Chimiothérapie [site Web]. Con- sulté le 18 novembre 2015. http://www.societederecherchesurlecancer.ca/page.aspx?pid=2093 Stora, D. (1 février 2013). Pharnacologie et thérapeutique 2e édition [livre], sur le site Google Livres, 240 p. Consulté le 17 novembre 2015. https://books.google.ca/books?id=- nHVBgAAQBAJ&dq=dl50+pharmacologie&hl=fr&source=gbs_navlinks_s
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      29 ThermoFisher Scientific(2015). ThermoFisher Scientific [site web]. Consulté le 15 novembre 2015. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-cul- ture/reagents/hepes.html Toutain, P. L. et A. Bousquet-Melou. La biodisponibilité et son évaluation [page web]. Consulté le 18 novembre 2015. http://physiologie.envt.fr/spip/IMG/pdf/La_biodisponibilite_et_son_evalua- tion.pdf Uptima. Good's buffers (biological buffers) [publication Web]. Consulté le 23 octobre 2015. http://www.interchim.fr/ft/0/062000.pdf Wen et coll. (2011). Formation mechanism of monodisperse, low molecular weight chitosan nanopar- ticles by ionic gelation technique. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. Volume 90. p. 21- 27. Xuan, L. et coll. (2015). Berberine Inhibits Invasion and Metastasis of Colorectal Cancer Cells via COX-2/PGE2 Mediated JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Plos One. Volume 10, no 5. Xue, M. et coll. (2013). Characterization, pharmacokinetics, and hypoglycemic effect of berberine loaded solid lipid nanoparticles. International Journal of Nanomedicine, volume 8, p. 4677- 4687. Zaluzec, Nestor J. Introduction to Transmission/Scanning Transmission Electron Microscopy and Mi- croanalysis [Présentation Powerpoint], sur le site TelePresence Microscopy Collaboratory. Consulté le 20 octobre 2015. http://tpm.amc.anl.gov/Lectures/Zaluzec-1-Instrumenta- tion.ppt.pdf Zhou, Yan et coll. “In vivo anti-apoptosis activity of novel berberine-loaded chitosan nanoparticles ef- fectively ameliorates osteoarthritis”. International Immunopharmacology, vol. 28, no 1, (sept. 2015), p. 34–43.
  • 30.
      30 ANNEXE A-1. Protocolesde la préparation des nanoparticules (ionic cross-linking) Précision : Les quantités utilisées sont valables pour un seul essai de préparation des nanoparticules. A-1.1. Préparation des solutions A-1.1.1 Solution de chitosane 1% (m/v) dissout dans l'acide acétique 1% (v/v) Matériel : •   Fiole jaugée 500 mL •   Bécher de 250 et de 600 mL •   Cylindre gradué de 500 mL •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Balance analytique •   Spatule •   Nacelle de pesée •   Chitosane (4 g) •   Acide acétique glacial (≥ 99,7%) (5 ml) •   Eau distillée (≈ 500 mL) Procédure : 1.   Sous une hotte chimique, verser environ 400 mL d’eau distillée dans la fiole jaugée de 500 mL. 2.   Pipeter 5 mL d’acide acétique glacial (≥ 99,7%) et l’ajouter dans la fiole. 3.   Compléter le volume à 500 mL avec de l’eau distillée. 4.   Agiter par inversion (10 fois). 5.   Transférer le contenu de la fiole dans le bécher de 600 mL. 6.   Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 250 mL et y verser environ 100 mL de la solu- tion d'acide acétique 1% (v/v). 7.   Peser 4 g de chitosane et l'ajouter dans le bécher de 250 mL. 8.   Rincer les parois du bécher de 250 mL avec 50 mL de solution d'acide acétique. 9.   Mettre le bécher de 250 mL sur une plaque agitatrice et démarrer l'agitation à 200 RPM. Laisser agiter pour 1 minute. 10.  Verser la solution contenue dans le bécher de 250 mL dans le cylindre gradué de 500 mL. 11.  Compléter le volume à 400 mL avec la solution d'acide acétique 1% (v/v). 12.  Laver et rincer la verrerie. A-1.1.2. Solution de tripolyphosphate de sodium (STPP) 5 mg/mL Matériel : •   Fiole jaugée de 250 mL •   Bécher de 250 mL •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Balance analytique •   Spatule •   Nacelle de pesée •   STPP (1,25 g) •   Eau distillée (≈ 250 mL) Procédure : 1.   Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 250 mL et y verser environ 100 mL d'eau distillée. 2.   Peser 1,25 g de STPP et l'ajouter dans le bécher. 3.   Rincer les parois du bécher avec 50 mL d'eau distillée. 4.   Mettre le bécher sur une plaque d'agitation et laisser agiter à 200 RPM pour 1 minute.
  • 31.
      31 5.  Transvider le contenu du bécher dans la fiole jaugée de 250 mL et compléter le volume avec de l'eau distillée. 6.   Agiter par inversion (10 fois). 7.   Laver puis sécher la verrerie. A-1.1.3. Solution mère de chlorure de berbérine (60 mg/ml) Matériel : •   Pipette jaugée de 5 mL •   Tube vortex •   Support pour tubes vortex •   Vortex •   Balance analytique •   Spatule •   Nacelle de pesée •   Diméthylsulfoxyde (DMSO) (≥99,9%) (5 mL) •   Chlorure de berbérine (300 mg) Procédure : 1.   Peser environ précisément 300 mg de chlorure de berbérine. Noter la masse obtenue. 2.   Identifier un tube vortex "SM CBRB (60 mg/mL)" et y transférer le chlorure de berbérine. 3.   Pipeter 5 mL de DMSO et l’ajouter dans le tube en le laissant couler sur la paroi de verre. 4.   Mélanger au vortex sous agitation modérée pendant 15 secondes (5 x 3 secondes). 5.   Mettre le tube dans le support à tubes vortex. Boucher le tube et le conserver à 4 ºC à l'abri de la lumière. A-1.1.4. Tampon HEPES (20 mM) Matériel : •   Fiole jaugée de 100 mL •   Micropipette P1000 •   Embout pour micropipette •   HEPES 1M (2 mL) •   Eau distillée (≈ 100 mL) Procédure : 1.   Verser environ 80 mL d’eau distillée dans la fiole jaugée de 1000 mL. 2.   Pipeter 2 mL de tampon HEPES 1M et l’ajouter dans la fiole. 3.   Compléter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée. 4.   Agiter par inversion (10 fois). A-1.2. Préparation des nanoparticules témoins (sans chlorure de berbérine) Matériel : •   Cylindres gradués de 200 mL, 500 mL et 1 L •   Erlenmeyers de 250 mL et de 1L •   Micropipette P1000 + embout •   Pompe péristaltique + tube •   Support universel •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Bouteille de 1000 mL •   DMSO (210 µL) •   Solution de chitosane 1% (m/v) (400 mL) •   Solution de STPP (5 mg/ml)
  • 32.
      32 Procédure : 1.  Mesurer 400 mL de la solution de chitosane 1% (m/v) avec le cylindre gradué de 500 mL. 2.   Mettre le barreau magnétique dans l'erlenmeyer de 1 L et y verser le contenu du cylindre gradué. 3.   Pipeter 210 µL de DMSO et l'ajouter dans l'erlenmeyer de 1 L. 4.   Mettre l'erlenmeyer sur la plaque agitatrice. Ne pas démarrer l'agitation. 5.   Mesurer 160 mL de la solution de STPP 5 mg/ml avec le cylindre gradué de 200 mL et verser le volume dans l'erlenmeyer de 250 mL. 6.   Placer le tube dans le socle de la pompe péristaltique. Mettre la première extrémité du tube dans l'erlenmeyer de 250 mL et fixer la seconde sur le support universel de sorte que l'embout pointe à la verticale dans l'erlenmeyer de 1 L. 7.   Régler le débit d'écoulement de la pompe à 53 ml/h. 8.   Démarrer l'agitation à 550 RPM et activer la pompe. 9.   Laisser le système réactionnel sous agitation à la température de la pièce jusqu'à ce que la solu- tion de STPP 5mg/ml se soit entièrement écoulée (≈ 3 h). 10.   Transvider la solution contenue dans l'erlenmeyer de 1 L dans le cylindre gradué de 1 L. Mesurer et noter le volume obtenu. 11.   Laver et sécher la verrerie. A-1.3. Préparation des nanoparticules contenant de la berbérine A-1.3.1. Ajout de la solution de chlorure de berbérine à la solution de chitosane Précision : Le protocole suivant considère une masse de chlorure de berbérine ajoutée de 4,2 mg. Les volumes de la solution mère à prélever pour les autres essais se trouvent dans le tableau A-1. Tableau A-1 : Volume de solution mère "SM CBRB (60 mg/ml) à prélever pour chacun des essais. Essai Volume à prélever (µL) Pipette à utiliser 4,2 mg 70 P200 8,4 mg 140 P1000 16,8 mg 280 P1000 21,0 mg 350 P1000 Matériel : •   Cylindre gradué de 500 mL •   Bécher de 600 mL •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Solution de chitosane 1% (m/v) (400 mL) •   Solution de chlorure de berbérine •   Micropipette P200/P1000 + embout Procédure : 1.   Mesurer 400 mL de la solution de chitosane 1% (m/v) avec le cylindre gradué de 500 mL. 2.   Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 600 mL et y verser la solution contenue dans le cylindre gradué. 3.   Pipeter 70 µL du tube "SM CBRB (60 mg/ml)" et l'ajouter dans le bécher de 600 mL. 4.   Mettre le bécher sur la plaque agitatrice et régler la vitesse d'agitation à 200 RPM. 5.   Laisser sous agitation pendant 1 heure à la température de la pièce. 6.   Laver et sécher la verrerie (hormis le bécher de 600 mL).
  • 33.
      33 A-1.3.2. Ajoutde la solution de STPP à la solution de chitosane et de chlorure de berbérine Matériel : •   Cylindres gradués de 200 mL et 1 L •   Erlenmeyers de 250 mL et de 1 L •   Bouteille de 1000 mL •   Pompe péristaltique + tube •   Support universel •   Barreau magnétique •   Plaque agitatrice •   Tige magnétique •   Bécher de 600 mL contenant la solution en A-1.3.1. •   Solution de STPP 5 mg/ml (160 mL) Procédure : 1.   Mettre le barreau magnétique dans l'erlenmeyer de 1 L et y transvider la solution de chitosane et de chlorure de berbérine contenue dans le bécher de 600 mL. 2.   Mesurer 160 mL de la solution de STPP 5 mg/ml avec le cylindre gradué de 200 mL et verser le volume dans l'erlenmeyer de 250 mL. 3.   Mettre l'erlenmeyer de 1 L sur la plaque agitatrice. Ne pas démarrer l'agitation. 4.   Placer le tube dans le socle de la pompe péristaltique. Mettre la première extrémité du tube dans l'erlenmeyer de 250 mL et fixer la seconde sur le support universel de sorte que l'embout pointe à la verticale dans l'erlenmeyer de 1 L. 5.   Régler le débit d'écoulement de la pompe à 53 ml/h. 6.   Démarrer l'agitation à 550 RPM et activer la pompe. 7.   Laisser le système réactionnel sous agitation à la température de la pièce jusqu'à ce que la solu- tion de STPP 5mg/ml se soit entièrement écoulée (≈ 3 h). 8.   Transvider la solution contenue dans l'erlenmeyer de 1 L dans le cylindre gradué de 1 L. Mesurer et noter le volume obtenu. 9.   Laver et sécher la verrerie. A-1.4. Purification des nanoparticules A-1.4.1. Séparation des nanoparticules des solvants et des excès de réactifs Matériel : •   Centrifugeuse •   Pipette volumétrique de 50 mL •   Tubes Falcon de 50 mL •   Bouteille d'entreposage de 1000 mL •   Solution contenant les nanoparticules (A-1.2 ou A-1.3) Procédure : 1.   Avec la pipette volumétrique de 50 mL, pipeter approximativement 50 mL de la solution con- tenant les nanoparticules et ajouter le volume dans un tube Falcon. 2.   Répéter l'étape 1 pour 5 autres tubes Falcon. 3.   Placer les tubes Falcon dans le rotor de la centrifugeuse. Disposer les tubes de façon à équilibrer le rotor. 4.   Régler la vitesse de centrifugation à 2000g et laisser centrifuger pendant 10 minutes à 4 ºC. 5.   Vérifier qu'un culot est présent au fond des tubes. Si aucun culot n'est détectable, répéter l'étape 4 en augmentant la vitesse à 3000g, 4000g et ainsi de suite.
  • 34.
      34 6.  Noter la vitesse de centrifugation nécessaire à la formation du culot ainsi que le temps total de centrifugation. 7.   Avec la pipette volumétrique, retirer les surnageants et les conserver dans une bouteille d'entre- posage de 1000 mL identifiée "Surnageants A-1.4 (masse de berbérine) (numéro de l'échantil- lon)". 8.   Répéter les étapes 1 à 7 en disposant les volumes de solution de nanoparticules dans les mêmes tubes Falcon et en utilisant les paramètres de centrifugation définis à l'étape 6. A-1.4.2. Lavage des nanoparticules Matériel : •   Centrifugeuse •   Cylindre gradué de 50 mL •   Bécher de 500 mL •   Bouteille de 500 mL •   Pipette volumétrique de 50 mL •   pH-mètre •   Tubes Falcon (A-1.4.1) •   Eau distillée •   Tampon HEPES 20 mM (48 mL) Procédure : 1.   Resuspendre chacun des culots des 6 tubes Falcon du protocole A-1.4.1 dans 50 mL d'eau dis- tillée. 2.   Placer les tubes Falcon dans le rotor de la centrifugeuse. Disposer les tubes de façon à équilibrer le rotor. 3.   Centrifuger selon les paramètres établis à l'étape 6 du protocole A-1.4.1. 4.   Avec la pipette volumétrique, retirer les surnageants et les transvider dans un bécher de 500 mL. 5.   Tester le pH de la solution et verser le contenu du bécher de 500 mL dans une bouteille d'entre- posage de 500 mL identifiée "Surnageants A-1.4.2 (masse de chlorure de berbérine) (numéro de l'échantillon)". Si le pH n'est pas de 7,0, répéter les étapes 1 à 5 jusqu'à ce que ce soit le cas et passer à l'étape suivante. 6.   Resuspendre chacun des culots dans 8 mL de tampon HEPES 20 mM. 7.   Pipeter les solutions des 6 tubes Falcon et mettre les volumes dans un cylindre gradué de 50 mL. Noter le volume obtenu. 8.   Transvider le contenu du cylindre gradué dans un autre tube Falcon identifié "NPs HEPES (masse de chlorure de berbérine) (numéro de l'échantillon)". 9.   Effectuer le protocole A-1.4.3.Filtration des contaminants. A-1.4.3. Filtration des contaminants Matériel : •   Unité stérile de filtration jetable (pores : 0,2 micron) (filtration avec vacuum) •   Pipette volumétrique de 50 mL •   Tampon HEPES 20 mM (50 mL) •   Nanoparticules lavées (A-1.4.2) •   Procédure : 1.   Filtrer les nanoparticules lavées dans l'unité de filtration. 2.   Rincer le filtre avec 25 mL de solution tampon HEPES 20 mM. 3.   Répéter l'étape 2 avec le volume restant de solution HEPES 20 mM. 4.   Fermer le contenant de façon stérile. NB: Prochains protocoles effectués de façon stérile.
  • 35.
      35 A-2. Protocolede la préparation de la courbe étalon de chlorure de berbérine A-2.1 Échantillons de la courbe étalon Matériel : •   Surnageant du témoin (≈ 200 mL) •   Chlorure de berbérine (4 mg) •   Bécher de 100 mL •   Bécher de 50 mL •   Micropipette P1000 •   Embout à micropipette •   Pipette volumétrique de 50 mL •   Fiole jaugée de 100 mL •   Plaque 96 puits 300 µL •   Spectrofluorimètre Procédure : 1.   Pipeter 300 µL de surnageant et l'ajouter dans un puits de la plaque. 2.   Mettre approximativement 50 mL de surnageant du témoin dans la fiole jaugée de 100 mL. 3.   Mettre un barreau magnétique dans le bécher de 100 mL et y ajouter 25 mL de surnageant. 4.   Peser 4 mg de chlorure de berbérine et l'ajouter dans le bécher de 100 mL. 5.   Mettre le bécher sur la plaque agitatrice et régler la vitesse d'agitation à 200 RPM. Laisser sous agitation pendant 1 minute. 6.   Verser le contenu du bécher de 100 mL dans la fiole jaugée et compléter le volume à 100 mL avec le surnageant. 7.   Prélever 300 µL du contenu de la fiole jaugée et l'ajouter dans un second puits de la plaque. 8.   Pipeter 18,75 mL de la solution contenue dans la fiole jaugée et transférer le volume dans un bécher de 50 mL. 9.   Ajouter 6,25 mL de surnageant au bécher de 50 mL et agiter avec une tige de verre. 10.   Prélever 300 µL de la solution de l'étape précédente et le déposer dans un puits de la plaque. 11.   Répéter les étapes 8 à 10 selon les volumes donnés dans le tableau A-2. 12.   Mettre la plaque 96 puits dans le spectrofluorimètre. 13.   Régler les paramètres de l'appareil afin qu'il reconnaisse le blanc (puits de l'étape 1), qu'il con- figure la longueur d'onde d'excitation à 365 nm et qu'il configure la longueur d'onde d'émission à 550 nm. 14.   Faire la lecture de la fluorescence. 15.   Sur un logiciel d'analyse de données, tracer une courbe de la fluorescence des échantillons en fonction de leur concentration en chlorure de berbérine et demander l'équation. Tableau A-2 : Volumes à prélever pour préparer les échantillons de la courbe étalon. Échantillon Solution 4 mg/100 ml [CBRB] (mL) Surnageant (pur) (mL) Blanc --- 1,00 4 mg/100 ml 1,00 --- 3 mg/100 ml 18,75 6,25 2 mg/100 ml 12,50 12,50 1 mg/100 ml 6,25 18,75 0,5 mg/100 ml 3,13 21,88      
  • 36.
      36 A-3. Protocolesde la caractérisation des nanoparticules A-3.1. Détermination du pourcentage d'encapsulation (effectuer de façon stérile) Matériel : •   Surnageants (A-1.4) •   Micropipette P1000 •   Embouts à micropipette •   Plaque 96 puits 300 µL •   Spectrofluorimètre Procédure : 1.   Allumer le spectrofluorimètre. 2.   Effectuer le réglage des paramètres (λexcitation : 365 nm, λémission : 550 nm). 3.   Déposer 300 µL de blanc dans les puits A1 à A3. 4.   Mettre 300 µL de la solution "Surnageant A-1.4 (masse berbérine)_(#1)" B1 à B3. 5.   Mettre 300 µL de la solution "Surnageant A-1.4 (masse berbérine)_(#2)" C1 à C3. 6.   Mettre 300 µL de la solution "Surnageant A-1.4 (masse berbérine)_(#3)" D1 à D3. 7.   Nettoyer sous la plaque 96 puits avec un kimwipes. 8.   Effectuer la lecture de la fluorescence des puits de la plaque. 9.   Substituer les valeurs obtenues dans l'équation de la courbe étalon pour obtenir la concentration en chlorure de berbérine. A-3.2. Évaluation de la cinétique de libération (effectuer de façon stérile) A-3.2.1. Préparation des échantillons Matériel : •   Nanoparticules (A-1.4.3) •   Micropipette P1000 •   Embouts à micropipette •   Tubes à centrifuger de 5 mL •   Spectrofluorimètre Procédure : 1.   Homogénéiser la solution de HEPES contenant les nanoparticules. 2.   Faire 25 aliquots de 3 mL dans des tubes à centrifuger de 5 mL pour chaque triplicata. 3.   Identifier 25 tubes par triplicata. a.   1 tube pour le temps b.   8 tubes pour congélation à -80°C (15min, 30 min, 1h, 2h, 24h, 48h, 7 jours et surplus) c.   8 tubes pour température 4°C, (15min, 30 min, 1h, 2h, 24h, 48h, 7 jours et surplus) d.   8 tubes pour température 37°C, (15min, 30 min, 1h, 2h, 24h, 48h, 7 jours et surplus) 4.   Mettre les tubes dans des supports (pas en polystyrène) 5.   Placer les aliquots aux différentes conditions. A-3.2.2. Dosage de la berbérine dans les échantillons Matériel : •   Échantillons (A-3.2.1.) •   Solution "Blanc" •   Micropipette P1000 •   Embouts à micropipette •   Spectrofluorimètre + plaque 96 puits •   Centrifugeuse
  • 37.
      37 Procédure : 1.  Allumer le spectrofluorimètre. 2.   Effectuer le réglage des paramètres (λexcitation : 365 nm, λémission : 550 nm). 3.   Centrifuger l’échantillon selon les paramètres déterminés à l'étape 6 du protocole A-1.4.1. 4.   Déposer 300 µL de blanc dans les puits A1 à A3. Échantillon congelé à -80°C (décongeler dans un bain d'eau à 37 °C) 5.   Mettre 300 µL du triplicata #1 dans les puits B1 à B3. 6.   Mettre 300 µL du triplicata #2 dans les puits C1 à C3. 7.   Mettre 300 µL du triplicata #3 dans les puits D1 à D3. Échantillon à 4°C 8.   Mettre 300 µL du triplicata #1 dans les puits B5 à B7. 9.   Mettre 300 µL du triplicata #2 dans les puits C5 à C7. 10.   Mettre 300 µL du triplicata #3 dans les puits D5 à D7. Échantillon à 37°C 11.   Mettre 300 µL du triplicata #1 dans les puits B10 à B12. 12.   Mettre 300 µL du triplicata #2 dans les puits C10 à C12. 13.   Mettre 300 µL du triplicata # dans les puits D10 à D12. 14.   Nettoyer sous la plaque 96 puits avec un kimwipes. 15.   Lire la fluorescence des échantillons de la plaque 96 puits. 16.   Comparer les valeurs obtenues avec la courbe étalon pour obtenir la concentration en berbé- rine. 17.   Réaliser un graphique de la concentration de la berbérine en fonction du temps. A-3.3. Évaluation de la taille par microscopie électronique à balayage 1.   Introduire l’échantillon dans la chambre 2.   Régler la distance de travail à 20 mm. 3.   Régler l’énergie primaire à 15 keV et l’enclencher dès que le vide l’autorise. 4.   Régler le contraste et la brillance sur la valeur habituelle moyenne (réglage automatique). 5.   Mettre le grandissement au minimum, en balayage rapide (valeur : 0,5 à 1 nA pour MEB ana- logique, 50 à 100 pA pour MEB numérisé). 6.   Monter progressivement, sans à-coups, l’intensité de chauffage du filament. Surveiller le cou- rant de chauffage du filament, le courant d’émission du canon et l’apparition d’une image sur l’écran. 7.   Régler le filament sur le deuxième pic d’émission. 8.   Si l’image qui apparait est floue, corriger la mise au point en augmentant le grandissement, en corrigeant l’astigmatisme, en vérifiant l’alignement du canon et le centrage du diaphragme jusqu’à ce que l’image soit nette. 9.   Avant de sortir l’échantillon, éteindre le filament et la haute tension, couper la tension du pho- tomultiplicateur (si ce n’est pas automatique), remettre les mouvements x, y et z et les rota- tions à leur « zéro », mettre le grandissement au minimum et mettre le courant condenseur à une valeur moyenne.