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  1. 1. Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères 71Sciences & Nature Vol.6 N°1: 71 - 82 (2009)Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyèresen Côte d’Ivoire et mise en évidence de leurs effets antagonistes vis-à-vis de Phytophthora palmivora, agent de la pourriture brune descabosses.Ismaël B. KEBE1*, Joseph MPIKA1, Kouamé F. N’GUESSAN1, Prakash K. HEBBAR2, Gary S. SAMUELS2&Severin AKE31CNRA, BP 808 Divo, Côte d’Ivoire.2USDA-ARS, Beltsville, MD 20705, USA.3Université de Cocody, UFR Biosciences, Côte d’Ivoire*Auteur pour les correspondances (Email : ibkebefr@yahoo.fr)Reçu le 07-02-2008, accepté le 21-04-2009.RésuméEn Côte d’Ivoire, avec des pertes de production qui avoisinent 60 % dans certaines régions, la lutte contre la pourriturebrune des cabosses du cacaoyer est devenue une priorité. La stratégie préconisée par la recherche est ledéveloppement d’une méthode de lutte intégrée, peu onéreuse et compatible avec les préoccupationsenvironnementales. L’une des approches privilégiées de cette stratégie est l’utilisation des antagonistes naturelsde Phytophthora sp. Dans cette optique, la biodiversité a été explorée dans l’écosystème de la cacaoyère. Deschampignons et des bactéries ont été isolés à partir des sols sous cacaoyères et des cabosses. L’action antagonistedes champignons sur P. palmivora a été évaluée in vitro ainsi que la sensibilité foliaire à P. palmivora sur des disquesde feuilles de cacaoyers en présence des bactéries. Les résultats montrent qu’en culture mixte avec P. palmivora,des isolats de Trichoderma sp ont montré un effet fongistatique et fongicide. Une réduction significative des notesde sensibilité selon l’échelle de Blaha a été obtenue avec deux bactéries, appartenant au genre Bacillus. L’étudese poursuit avec l’évaluation de l’efficacité des antagonistes naturels de Phytophthora sp en milieu réel sur lecacaoyer.Mots clés : Cacaoyer ; pourriture brune ; Phytophthora ; Trichoderma ; antagonistesAbstractIsolation and identification of indigenous micro-organisms of cocoa farms in Côte d’Ivoire andassessment of their antagonistic effects on Phytophthora sp, the causal agent of black pod disease.In Côte d’Ivoire, yield losses due to Phytophthora sp. reach of about 60% in some cocoa growing areas; therefore,the control of cocoa black pod disease has become a priority. The management strategy is based on thedevelopment of an integrated control method which is cost effective and environmentally sound. The emphasis hasbeen put on the use of natural antagonists of Phytophthora sp. Thus, the microbial biodiversity in the cocoaecosystem has been explored. Fungi and bacteria have been isolated from pods and soil in cocoa farms. Theantagonistic effects of these micro-organisms on Phytophthora sp. have been assessed in vitro. In addition, theleaf susceptibility to P. palmivora was assessed on cocoa leaf disks in the presence of the bacteria. The resultsshowed that in a mix culture with P. palmivora, some isolates of Trichoderma sp. showed fungicidal effects. Twobacteria belonging to the genus Bacillus significantly reduced cocoa leaf susceptibility to P. palmivora. The studywill continue to assess the efficacy of the potentially effective micro-organisms in the field for the control of theblack pod disease.Key words: Cocoa tree, Black pod disease, Phytophthora, Trichoderma, antagonists.Article original
  2. 2. 72Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)KEBE I. Boubacar et al.721. IntroductionLa pourriture brune des cabosses due àPhytophthora spp est une maladie trèspréjudiciable du cacaoyer. Au niveau mondial, elleengendre des pertes de production de l’ordre de30 % (Lass, 1985). La Côte d’Ivoire, premierproducteur mondial de cacao, avec plus de 44 %de l’offre (ICCO, 2000), n’échappe pas à cetteaffection. Plusieurs espèces de Phytophthorapeuvent être à l’origine de la maladie. Deuxespèces, P. palmivora et P. megakarya, sont lesplus importantes en Afrique. La première, la pluscosmopolite, sévit dans tous les pays producteursde cacao, causant des pertes de l’ordre de 20 à 30% ; la deuxième, endémique en Afrique centrale etde l’Ouest, est la plus agressive. Ce pathogènepeut engendrer dans certains pays, la perte de latotalité de la production de cacao (Flood 2006). EnCôte d’Ivoire, depuis l’apparition de P. megakaryadans le secteur Est du verger, vers la fin des années1990, la pourriture brune des cabosses prend deplus en plus d’ampleur (Koné, 1999 ; Kouamé,2006). Les pertes de production sont passéesd’une moyenne de 10 % à 30-45 % (Kébé et al.,1996). Ainsi, la lutte contre la pourriture brune descabosses en Côte d’Ivoire devient une priorité.Bien que la lutte chimique soit mise au point par larecherche, la vulgarisation de cette méthode aconnu peu de succès en milieu paysan. Le faibleniveau d’adoption de cette technologie par lesproducteurs s’explique aussi bien par le coût élevédes fongicides, que par la pénibilité du travail dueà la collecte de l’eau des traitements et l’applicationdes produits. Par ailleurs, les exigences du marchéinternational en termes de qualité du cacaomarchand, les préoccupations environ-nementales, la santé des consommateurs, lesdifférents moratoires en la matière de la part despartenaires commerciaux (Anonyme 2006), sontautant d’éléments qui ne favorisent pas ledéveloppement de la lutte chimique. La stratégieadoptée est le développement d’une méthode delutte intégrée, peu onéreuse et compatible avecles préoccupations environnementales. Cetteapproche s’articule autour de trois axes : la lutteagronomique, la résistance variétale et la luttebiologique. Le programme de recherche en luttebiologique contre les maladies à Phytophthora sp,a démarré en 2000.Au cours de la présente étude, la biodiversité aété explorée dans des écosystèmes decacaoculture. Des champignons et desbactéries ont été collectés à partir des sols souscacaoyères et des cabosses et une collectionde microorganismes a été constituée. L’actionantagoniste des champignons sur P. palmivoraa été évaluée in vitro ainsi que la sensibilitéfoliaire à P. palmivora sur des disques de feuillesde cacaoyers en présence des bactéries.2. Matériel et méthodes2.1. Echantillons et milieux de cultureLes microorganismes utilisés au cours de cetteétude ont été isolés des écosystèmes decacaoculture, notamment à partir des sols souscacaoyers et des cabosses. Les échantillons desol ont été collectés dans des cacaoyèreslocalisées dans la région d’Abengourou, dans l’Estde la Côte d’Ivoire, et dans la région de Divo dansle Centre - Ouest de la Côte d’Ivoire. Dans chacunedes deux localités, les échantillons de sol ont étéprélevés dans 8 cacaoyères réparties en deuxcatégories de parcelles selon l’âge. La premièrecatégorie est constituée de 4 parcelles jeunes (3à 5 ans), en phase d’installation dont la canopéeest encore ouverte avec une litière peu abondanteau sol. La seconde catégorie est constituée de 4parcelles adultes (25 à 30 ans) en pleineproduction avec une canopée bien fermée et unelitière abondante au sol. Dans chaque parcelle,un échantillon composite de 800 g de sol a étéconstitué à partir de 4 prélèvements effectués aupied de 4 cacaoyers chargés de cabosses saines,choisis de manière aléatoire dans les partieshomogènes de la parcelle. Avant chaqueprélèvement, la surface du sol a été d’aborddébarrassée des feuilles mortes et des débrisvégétaux. Les prises d’échantillons de sol ont étéensuite effectuées dans les couches superficiellesqui du fait du travail du sol et de la fertilisation estcolonisée par le chevelu racinaire des cacaoyers.C’est donc dans cet horizon de 30 à 40 cmd’épaisseur que les échantillons sont prélevés(Davet et Rouxel, 1997). Chaque échantilloncomposite est soigneusement mélangé et diviséen deux parties égales qui sont recueillies dansdes boîtes en plastique. Dans l’une des deuxboîtes, des pièges constitués de fragments decortex de cabosses infectées par Phytophthorapalmivora, ont été enfouis dans l’échantillon de
  3. 3. Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères 73sol pour servir d’appâts aux antagonistes (Tim etal., 2003). L’autre boîte ne contient pas de piège.Afin d’obtenir une bonne colonisation des pièges,les échantillons sont conservés au laboratoire àla température de 26 °C pendant 30 jours.Les cabosses ayant servi à l’isolement desmicroorganismes ont été collectées dans lesprincipales zones de production cacaoyère deCôte d’Ivoire. Ainsi 390 cabosses saines ont étéprélevées dans les 13 régions productrices decacao. Dans chaque région, la collecte a étéeffectuée dans 10 plantations. 3 cabosses ontété prélevées par parcelle. Les cabossesprélevées sont conservées dans des sachetsplastiques renfermant des étiquettes portant lescoordonnées des prélèvements et ramenées aulaboratoire pour l’isolement des endophytes.De nombreux champignons et bactéries isolésdu sol ou des cabosses ont été désignés parplusieurs auteurs comme potentiels agents delutte contre les maladies des plantes (Evans etal., 2003 ; Krauss and Soberanis, 2001 ; Shari,2000). Ainsi, pour évaluer la diversité des deuxgroupes cibles dans les sols sous cacaoyers etdans les cabosses, quatre milieux de culturesélectifs ont été éprouvés. Pour l’isolement desbactéries, le milieu PCAT « P. cepacia Azelaicacid tryptamine», spécifique des Pseudomonaset des Burkhoderia (Burbage, 1982), et le milieuNYD «nutrient yeast dextrose» (Guizzardi etPratella, 1996), adapté à un spectre plus largede bactéries ont été utilisés. Pour l’isolementdes champignons, le milieu TME «Trichodermamedium», spécifique des champignonsappartenant aux genres Trichoderma. etGliocladium (Papavizas et Lumsden, 1982) a étééprouvé. Le milieu PDA «potato dextrose agar»,adapté à un spectre plus large de champignons,a été utilisé pour l’isolement des autreschampignons.2.2. Isolement des microorganismes2.2.1. Endophytes des cabossesLa surface des cabosses est préalablementlavée à l’eau du robinet, puis a subi une sériede désinfection à l’éthanol à 95 %, pendant 30secondes, dans l’hypochlorite de sodium à 10%, pendant 2 minutes puis dans l’éthanol à 75% pendant 2 minutes, de manière à éliminerles microorganismes présents sur le cortex. Lescabosses sont ensuite rincées trois fois à l’eaudistillée stérile pour éliminer les traces dedésinfectant (Arnold, 1999 ; Evans, et al., 2003 ;Rubini et al ., 2005). La zone de prélèvement estchoisie et les tissus superficiels sont décapésà l’aide d’un scalpel stérile. Dix morceaux deforme cubique de 5 à 7 mm de côté ont étéprélevés par cabosse dans les tissus souscorticaux. Les fragments prélevés sont mis enculture sur les milieux sélectifs contenus dansdes boites de Pétri. L’incubation est faite àl’obscurité dans une étuve, à 26 °C pendant 2jours pour les bactéries et 7 jours pour leschampignons.2.2.2. Microorganismes du sol.Les microorganismes ont été obtenus, parisolement direct, à partir du sol selon la méthodedécrite par Davet & Rouxel (1997) et à partir desfragments pièges de cortex de cabossesenfouis dans les échantillons de sol. Leséchantillons de sol ont été préalablementséchés, broyés et calibrés par tamisage. Lesfragments pièges du fait de la consistancegélatineuse du cortex des cabosses endécomposition, sont broyés dans un mortier enporcelaine émaillée pour individualiser chaquepropagule vivante. Dans les deux cas, 10 g dubroyat sont transférés dans 90 ml d’eau distilléestérile contenue dans un Erlenmeyer. Lemélange est ensuite mis en agitation pendant30 minutes pour obtenir une bonne dilacérationdes particules. Pour obtenir une concentrationvariable de propagules et faciliter ledénombrement des colonies une série dedilution est réalisée à partir de la solution mèredont la concentration est de 10-1(Rapilly, 1968).Pour obtenir une solution à 10-2, 1 ml de lasolution mère est transféré dans 9 ml d’eaudistillée stérile. Ainsi, une série de dilution allantde 10-2à 10-9est réalisée dans des tubesd’hémolyse. 100 de chaque dilution est étaléesur les milieux de culture contenus dans desboîtes de Pétri. Pour chaque dilution et pourchaque milieu de culture 4 boîtes de pétri sontensemencées.L’incubation est faite à l’obscurité dans une étuve,à 26 °C pendant 2 jours pour les bactéries et 7jours pour les champignons.
  4. 4. 74Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)KEBE I. Boubacar et al.742.3. Conservation des microorganismesLes microorganismes isolés sont d’abord purifiéspar deux ou trois repiquages successifsmonospore ou mono-colonie sur des milieux deculture spécifiques. Une fois purifié, chaque isolatest désigné par un numéro de code. Pour lessouches bactériennes, le numéro de code estprécédé par la lettre B, suivi d’un numéro d’ordre.La nomenclature des isolats de champignoncommence par la ou les premières lettres du nomdu genre, suivi d’un numéro d’ordre. Laconservation des microorganismes ainsidésignés se fait au congélateur à une températurede – 80°C pour les bactéries, et à – 10°C pour leschampignons. Dans les deux cas, des disques degélose prélevés sur le pourtour de la culture purifiée,sont transférés dans des microtubes d’Eppendorfstériles de 1,5 ml, contenant du glycérol à 50 %.2.4. Evaluation de l’action antagoniste desmicroorganismes.L’action antagoniste des microorganismes isoléscontre P. palmivora a été évaluée par deux tests.Le premier test réalisé in vitro, est un test deconfrontation directe entre P palmivora et lemicroorganisme en culture mixte. Le second testest réalisé in vivo sur des disques de feuilles decacaoyer. Le test consiste à mesurer la sensibilitéfoliaire à P. palmivora selon une échelle qui variede 0 à 5 (Nyasse et al., 1995)., en présence dumicroorganisme.Le test de confrontation Trichoderma-P. palmivoraà été réalisé dans des boîtes de pétri contenantun milieu de culture gélosé à base de bouillon depomme de terre (milieu PDA). Un fragmentmycélien de 6 mm de diamètre est prélevé sur lepourtour des cultures de chacun des deuxchampignons. Ces fragments sont repiqués faceà face dans la même boîte de pétri, à 2 centimètresdu centre de la boîte (Benhanou et Chet, 1996).Les témoins sont des monocultures de chacundes 2 champignons éprouvés. Dans ce cas,l’explant est déposé au centre de la boîte de pétri. Sixrépétitions sont ainsi réalisées pour objet. L’incubationest réalisée à l’obscurité dans une étuvecryptogamique. 24 heures après la mise en culture,la croissance mycélienne de chaque explant estmesurée quotidiennement jusqu’au plein de la boîte.Sept jours après la rencontre des filamentsmycéliens des deux champignons, la survie despropagules de P. palmivora a été évaluée par leprélèvement d’explants dans la boîte de culturemixte selon un axe qui passe par le centre de laboîte et les explants d’ensemencement des deuxchampignons. Deux prélèvements consécutifssont espacés de 0,5 cm. Neuf explants sont ainsiprélevés dans chaque boîte de culture mixte. Lesfragments mycéliens ainsi prélevés, sont placésdans des ouvertures réalisées sur le cortex decabosses saines de cacaoyers prélevées sur unmême clone, indemnes d’attaques dePhytophthora sp. Les cabosses ainsi inoculéessont placées dans des cristallisoirs dans laquellel’humidité est entretenue par un tampon de cotonhydrophile stérile imbibé d’eau distillée stérile.L’incubation est réalisée à la températureambiante du laboratoire. La survie de Phytophthoraest évaluée par le dénombrement des taches depourriture brune initiées à la surface des cabossesinoculées après 15 jours d’observationquotidienne. La présence de Phytophthora dansles taches de pourriture est ensuite confirmée pardes observations réalisées au microscope optique.L’évaluation de l’action des bactéries sur P.palmivora été réalisée par le test feuille. Ce testest effectué sur des disques de feuilles decacaoyer de 15 mm de diamètre. Les disques defeuille sont préalablement trempés dans lasuspension bactérienne pendant une minute puisdisposés dans des bacs sur une plaque demousse imbibée d’eau. Chaque disque reçoitalors 10 μl d’une suspension calibrée à 3.105zoospores/ml. Les témoins ne subissent pas letrempage dans la suspension bactérienne. Ils nereçoivent que la suspension de zoospores. Lesdisques de feuilles ont été prélevés sur 3 clonesde cacaoyer dont la réaction à Phytophthora sp estconnue (Tahi et al., 2000). Ainsi, le clone sensible(IFC5), le clone moyennement résistant (P7), et leclone résistant (SCA6) ont été éprouvés. Pourchaque clone, 40 disques de feuille ont été inoculéset repartis dans 4 bacs constituant chacun unerépétition. L’incubation a été réalisée à l’obscurité à26°C pendant 7 jours. Les résultats ont été notésselon l’échelle de Blaha (Nyassé et al., 1995).2.5. Analyses des donnéesLe logiciel SAS (Statistical Analysis System, SASInstitute, Cary, NC) a été utilisé pour toutes lesanalyses statistiques. Pour les isolements desmicroorganismes et le test sur disques de feuille,les analyses de variance (ANOVA) ont porté sur lenombre moyen des colonies de microorganismesdénombrées sur milieu de culture et la note
  5. 5. Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères 75moyenne de sensibilité foliaire à Phytophthora enprésence des bactéries. La normalité desrésiduels et l’homogénéité des variances ont étévérifiées. Les comparaisons entre les moyennesont été faites selon le test de Student Newman etKeuls au seuil de 5 %.3. Résultats3.1. Microorganismes isolésL’exploration de la biodiversité au sein desmicroorganismes issus des sols souscacaoyers et des endophytes des cabosses, amis en évidence deux catégories demicroorganismes : les champignons et lesbactéries. Au niveau des cabosses, leschampignons représentent 66,31 % desisolements positifs, contre 33,04 % pour lesbactéries. Ces deux types de microorganismesse retrouvent en proportions inversées au niveaudu sol : 55, 8 % pour les bactéries et 29,8 %pour les champignons. Dans le groupe deschampignons, les levures qui représentent 11,6% de la population au niveau des cabosses nereprésentent plus que 3,7 % au niveau du sol.Parmi les bactéries isolées, les actinomycètesqui ne représentent que 0,64 % au niveau descabosses, passent à 10,5 % au niveau du sol.01020304050607080ChampignonsdiversBactériesdiversesLevures ActimycétesMicroorganismesPourcentageEndophytes des cabossesSol sous cacaoyersFigure 1: Groupes de microorganismes et leur importance relative dans le sol sous cacaoyers et dans le cortexdes cabossesLes résultats des analyses statistiquesmontrent que le nombre moyen de colonies demicroorganismes dénombrées par gramme desol varie de manière significative (au seuil de5%), en fonction de la technique d’isolement,avec ou sans pièges. Ce résultat révèle quel’utilisation de fragments de cabosses infectéespar Phytophthora comme piège, amélioresignificativement le rendement des isolementssur les milieux PDA, TME et PCAT (Tableau 1).L’analyse des échantillons prélevés dans larégion de Divo et d’Abengourou n’a révélé, auplan statistique, aucune différence significative(au seuil de 5%) du nombre moyen de coloniesen fonction de la localité pour les différents milieuxde culture éprouvés sauf pour le NYD. Aucunerelation directe n’est établie entre la densité desmicroorganismes isolés et l’âge des cacaoyèressauf pour les bactéries sur le milieu de cultureNYD à Abengourou (Tableau 2).
  6. 6. 76Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)KEBE I. Boubacar et al.76Milieux de cultureTechniques NYD PDA TME PCATIsolement direct 3,27.1011a± 2,14.10114,72.106a± 1,42.1064,64.105a±1,6.1055,1.105a± 2,5.105Isolement par piégeage 3,80.1011a± 2,35.10112,43.109b±1,41.1096,1.106b±1,6.1067,64.107b ± 3,67.107Tableau 1 : Nombre moyen de colonies dénombrées par gramme de sol en fonction de la technique d’isolement etdu milieu de culture.Les moyennes de la même colonne suivies de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le testde Student Newman & KeulsTableau 2 : Nombre moyen de colonies dénombrées par gramme de sol en fonction des localités et de l’âge descacaoyères.Les moyennes de la même colonne affectées de la même lettre pour chaque localité ne sont pas significativement différentes au seuilde 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.Milieux de cultureLocalités Type cacaoyère NYD PDA TME PCATJeune 1,9.107a ±1,42.1071,75.106a±0 4,67.106a±2,2.1061,2.108a±6,96.1AbengourouAdulte 1,38.1012b±4,31.10101,15.107b±1,11.1065,97.106a±3,221062,77.107a±1,52.Jeune 5,81.107a ±4,78.1072,05.108a±1,42.1081,42.106a±7,96.1055,75.106a±4.106DivoAdulte 3,2.1010a ±2,15.10103,45.109a±1,99.1091.106a ±5,76.1055,78.104a±3,77.3.2. Identification des organismes isolésAu niveau des cabosses, 313 isolats dechampignons ont été purifiés. Parmi les isolatspurifiés, cinquante huit (58) isolats appartenant à9 genres ont été identifiés. Il s’agit de Trichodermasp (7), Penicillium sp (6), Fusarium sp (7), Botrytissp. (2), Pestalotia sp. (24). Le reste des isolatsidentifiés appartiennent aux genres Nigrospora (2),Physoderma (1), Polynema (1), et Botryodiplodia(8). Les autres isolats (255) appartiennent à desespèces ou genres divers dont l’appartenance n’apu être encore identifiée.Cent deux (102) colonies bactériennes endophytesdes cabosses ont été isolées. Ces bactériesappartiennent à deux groupes selon les réponsesaux réactions chimiques colorées : 56 bactériesGram positif (45 bacilles et 11 coques) et 46bactéries gram négatif (9 bacilles et 37 coques).Les colonies bactériennes B105 et B116 ont étéidentifiées comme appartenant au genre Bacillus.Enfin, 55 souches levuriformes et 2 isolatsd’actinomycètes ont été identifiés.Au niveau du sol, sur 450 isolats collectés etpurifiés, 254 bactéries, 136 champignons, 48actinomycètes et 17 levures ont été identifiés. Dansle groupe des champignons, 15 isolats appar-tiennent au genre Trichoderma. Quatre espècesont été identifiées. Il s’agit de T. virens (6 isolats),T. harzianum (6 isolats), T. hamatum (2) et T.spirale (1 isolats). Trois isolats appartenant augenre Clonostachys ont également été identifiés3.3.Actiondesorganismessur Phytophthorapalmivora3.3.1.Action de Trichoderma sur la croissancemycélienne de P. palmivoraLes tests de confrontation directe réalisés invitro, entre les isolats de Trichoderma sp, et dePhytophthora palmivora mettent en évidence uneaction inhibitrice de Trichoderma sur P.palmivora en culture mixte.Après trois jours de confrontation, l’inhibition dela vitesse devient très forte et la croissance deP. palmivora devient pratiquement nulle (Fig. 3).La capacité de Trichoderma à bloquer lacroissance mycélienne de P. palmivora révèleun effet fongistatique avéré. A partir du quatrièmejour, on note une disparition progressive dumycélium de P. palmivora. Cette dégradation dumycélium de P. palmivora qui est plus marquéeau cinquième jour, avec tous les isolats, révèleune action mycoparasitique de Trichoderma.
  7. 7. Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères 77Après 7 jours de confrontation, en culturemixte, la survie des propagules de P.palmivora a été évaluée. L’influence deTrichoderma sp. a varié selon les isolats. Lepourcentage de survie de Phytophthora varierespectivement de 90 à 50 % avec les isolatsTrichoderma 3 et Trichoderma 6. Ce tauxpasse de 30 à 10 % avec Trichoderma 2 et 4.Enfin, la présence de Trichoderma 1 et 5 enculture mixte, a un effet fongicide très net qui aété observé avec un pourcentage de survie deP. palmivora égal à 0.Culture purePhytophthorapalmivoraCulture pureTrichoderma spCulture MixeP. palmivora / Trichoderma sp.Trichoderma 1peu compétitifTrichoderma 2très compétitifPhytophthora palmivorapartiellement envahiPar Trichoderma 1Phytophthora palmivoraentièrement envahi avecdestruction du mycéliumPar Trichoderma 2Figure 2 : Boîtes de Pétri montrant des cultures pures et des cultures mixtes de P. palmivora et Trichoderma sp. in vitro.01020304050607080901001 2 3 4 5Diamètredecroissancemycélienne(mm)Temps (jours)PPTrichoP/Tricho1P/Tricho 2P/Tricho 3P/Tricho 4P/Tricho 5P/Tricho 6Figure 3 : Influence des isolats de Trichoderma sp. sur la croissance mycélienne de P. palmivora
  8. 8. 78Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)KEBE I. Boubacar et al.783.3.2. Influence des bactéries sur la sensibilitéfoliaire à P. palmivoraL’action de 37 souches bactériennes sur P.palmivora a été évaluée par le test sur des disquesde feuilles. Les résultats montrent que, pour leclone résistant (SCA 6), les notes de sensibilitéfoliaire varient de 2,75 à 0,37 avec respec-tivement les souches bactériennes B104 et B105(Fig. 4). Avec le clone moyennement résistant(P7), la note de sensibilité varie dans lesmêmes proportions (Fig. 5).00,511,522,533,5temoinB104B132B108B84B127B4B122B132B85B92B103B130B54B14B108B4B141B13B121B135B106B99B140B86B124B113B110B88B129B20BB10B69B10B114B102B123B116B105Souches de bactériesNotesdesensibilitéaababab abab ab ab ab ababab ab ab abab abab ab ababab bb b b b b bbc bc bcbcbcbc bc bcccLes barres surmontées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.00,511,522,533,5temoinB104B132B84B108B85B22B120B122B127B92B103B130B54B14B108B4B121B141B13B135B106B99B140B86B142B113B110B88B69BB10B20B129B10B102B123B114B116B105Souches de bactériesNotesdesensibilitéaababab abab ab ab ab ababab ab ab abababab ab ababb bb bb b b bbb b bbc bc bc bcccFigure 4 : Effet des souches bactériennes sur la sensibilité foliaire à Phytophthora palmivora d’un clone de cacaoyerrésistant (SCA6).Les barres surmontées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.Figure 5 : Effet des souches bactériennes sur la sensibilité foliaire à Phytophthora palmivora d’un clone de cacaoyermoyennement résistant (P7).
  9. 9. Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères 79Dans les deux cas, les analyses de variancerévèlent un effet bactérie significatif au seuil de5% selon le test de Student Newman & Keuls etmettent en évidence l’existence de 5 groupeshomogènes de bactéries (a, ab, b, bc, et c). L’effetle plus marqué a été obtenu avec les bactériesBI05 et B116 (groupe c). Avec le clone sensibleIFC 5, on note que la réduction des notes desensibilité foliaire est nettement plus faible. Lesnotes de sensibilité varient de 3,6 à 2,5. Lesanalyses statistiques ne révèlent aucunedifférence significative au seuil de 5% entre lesobjets traités avec les suspensionsbactériennes et le témoin non traité (Fig. 6).00,511,522,533,544,5B92temoinB124B113B88B129B54B140B86B84B20B122B103B99B141B4B120B108B18B124B104B10B227B22B132B106B85B69B14B116B118B135B123B114B105BB10B102B129B113B88NotesdesensibilitéSouches bactériennesaa a a a a aa a a a a aa a a a a a aa a a a a aaa a a a a aaa a aa a aFigure 6 : Effet des souches bactériennes sur la sensibilité foliaire à Phytophthora palmivora d’un clone de cacaoyersensible (IFC5).Les barres surmontées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5 % selon le test de Student Newman & Keuls.4. DiscussionCette étude a permis de mettre en évidencel’existence d’une forte biodiversité au sein de lapopulation de microorganismes dans l’éco-système de la cacaoyère. Au niveau des deuxcomposantes explorées, le sol et les endophytesdes cabosses, la biodiversité s’avère variée auxplans qualitatif et quantitatif.Les endophytes sont des microorganismes quicolonisent les tissus des plantes hôtes sansprovoquer de symptômes visibles en conditionnormale (Carroll, 1998). Depuis le début desannées 2000, ces organismes sont courammentétudiés dans les plantes tropicales pour leurutilisation en lutte biologique ou pour la productionde substances ayant des propriétés pharma-cologiques (Azevedo, 2002 ; Peixoto-Neto, 2002).Les isolements réalisés sur les cabosses ducacaoyer ont montré une prédominance deschampignons (66,31 %), contre 33,04 % debactéries. Des résultats similaires ont été obtenuspar Evans et al. (2003) et Rubini et al. (2005). Auniveau du sol, les résultats de l’étude ontégalement montré une forte prolifération des deuxcatégories de microorganisme avec une plus forteproportion de bactéries. Les sols sous cacaoyerset les cabosses constituent donc des sites deprédilection de microorganismes indigènes,antagonistes potentiels de P palmivora, occupantla même niche écologique.Les résultats montrent que l’utilisation de piègesà microorganismes, constitués de fragments decabosses de cacaoyers, infectés par P.palmivora, améliore de manière significative lerendement des isolements de micro-
  10. 10. 80Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)KEBE I. Boubacar et al.80organismes au niveau du sol. Cette améliorationpourrait s’expliquer par une affinité entre P.palmivora et les microorganismes collectés.L’examen de la liste des microorganismes isolésrévèle l’existence de champignons et de bactériesidentifiés par de nombreux auteurs comme ayantun effet antagoniste avéré contre des agentspathogènes responsables de maladies desplantes. C’est le cas des genres Trichoderma etClonostachys, dont plusieurs espèces sontéprouvées dans la lutte contre les maladies ducacaoyer (Sanogo et al., 2002 ; Krauss etSoberanis, 2001 ; Tondje et al., 2007 ; Samuels,1996). Dans le groupe des bactéries, l’effetantagoniste du genre Bacillus a été mis enévidence par Shari Fuddin, 2000.Les tests de confrontations directes réalisés invitro entre P. palmivora et les isolats Trichodermaont mis en évidence un effet allant de l’inhibitionde la croissance mycélienne (effet fongistatique),à la dégradation puis la disparition du mycéliumde P. palmivora (mycoparasitisme et effetfongicide). Des résultats similaires ont été obtenusavec Trichoderma harzianum sur Fusariumoxysporum (Hibar et al., 2005). En Amériquecentrale, des résultats analogues ont étéégalement obtenus avec Trichodermastromaticum dans la lutte contre la maladie desbalais de sorcière du cacaoyer et avec Trichodermavirens contre la pourriture brune des cabosses(Krauss & Soberanis, 2002). Cette étude a doncpermis d’isoler et purifier plusieurs antagonistespotentiels de Phytophthora sp, susceptibles d’êtreutilisés dans la lutte contre la pourriture brunedes cabosses du cacaoyer.L’étude de l’action des souches bactériennes surP. palmivora par le test sur disques de feuilles, amis en évidence une réduction de la sensibilitéfoliaire à P. palmivora des clones de cacaoyersrésistants (SCA6) ou moyennement résistants(P7). Par contre, cet effet est moins perceptibleavec le clone sensible (IFC5). Des résultatsanalogues ont été obtenus par Maurhofer et al.(1994) sur le tabac, Duijff et al., 1997) sur la tomateet Chen et al (1998) sur le concombre. Cesrésultats pourraient révéler un renforcement de larésistance intrinsèque du matériel végétal par lessouches bactériennes. Les effets les plus fortsont été enregistrés avec les souches bactériennesB 105 et B 116, ce qui fait de ces deux souchesbactériennes des candidats potentiels à la luttebiologique contre P. palmivora. Ces deux bactériesappartiennent au genre Bacillus doté d’uneaptitude à sporuler, ce qui pourrait présager unebonne aptitude à la dissémination dans le cadred’un programme de lutte biologique.5. ConclusionLes résultats montrent qu’il est possibled’identifier des antagonistes naturels àPhytophthora sp issus de la microflore indigènedes cacaoyères. Ainsi, plusieurs isolats deTrichoderma et des souches bactériennes ontrévélé un effet antagoniste avéré contre Ppalmivora en laboratoire. Cette efficacité laisseentrevoir la possibilité d’utiliser ces micro-organismes dans la lutte contre les maladies àPhytophthora sp du cacaoyer. Toutefois, cetteéventualité ne pourra être envisagée que sil’efficacité observée in vitro, se confirme enmilieu réel sur le cacaoyer. La mise en œuvrede cette seconde phase de l’étude nécessite lamaîtrise de la technique de production massivede la biomasse des microorganismes éprouvéspour la réalisation des essais.Références citéesAnonyme 2006. New EU regulation on maximumresidue levels of pesticides in food : minimisingthe impact on the cocoa sector. In: proceedingsof the 15th International Cocoa ResearchConference. 9-10 October 2006. San Jose(Costa Rica). pp. 1565-1571.Arnold B.1999. Fungal endophytes of tropicaltrees: Methods and potential for biologicalcontrol of fungal pathogens of cocoa.Research methodology in biocontrol of plantdiseases with special reference to fungaldiseases of cocoa. Worshop manual, CATIE,Turrialba, Costa Rica 28 june – 4 july, 1999.Edited by Ulrike Krauss & Prakash Hebbar.pp 44 -54.Azevodo J.L. 2002. Microrganismos endofiticos eseu papel em plantas tropicais. In: SerafiniLA, et al. Ed.Biotecnologia : avanços naagricultura e na agroindùstria. Caxias do sul :EDUCS, 2002 : 233-268.Benhanou N., & Chet I., 1996. Parasitism ofsclerotia of Sclerotium rolfsii by Trichoderma
  11. 11. Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)Isolement et identification de microorganismes indigènes de cacaoyères 81harzianum :ultrastructural and cytochemicalaspects of the interaction. Phytopathology86:405-416.Burbage D.A., Sasser M. 1982. A medium selectivefor Pseudomonas cepacia. Phytopathology.72: 706.Carroll G. C., 1998. Fungal endophytes in stemsand leaves: from latent pathogen to mutualisticsymbiont. Ecol. 69: 2-9.Chen C, Bélanger RR., Benhamou N. & PaulitzTC. 1998. Induced systemic resistance (ISR)by Pseudomonas spp. Impairs pre-and post-infection development of Pythiumaphanidermatum on cucumber roots.European Journal of Plant Pathology 104:877-886.Davet, P. & Rouxel, F. 1997. Détection et isolementdes champignons du sol. Eds. INRA, Paris.France.194 p.Duijff BJ., Gianinazzi-Pearson V. & Lemanceau P.1997. Involvement of the outer membranelipopolysaccharides in the endophyticcolonization of tomato roots by biocontrolPseudomonas fluorescens strain WCS417r.New Phytologist 135: 325-334.Evans H.C., Holmes K. A., & Thomas S. E., 2003.Endophytes and mycoparasites associatedwith an indigenous forest tree, Theobromagileri, in Ecuador and preliminaryassessment of their potential as biocontrolagents of cocoa diseases. MycologicalProgress 2 (2): 149-160.Flood J. 2006. The threat from global spread ofcocoa pests and diseases : hypotheticalscenario or clear and present danger. In:proceedings of the 15th International CocoaResearch Conference. 9-10 October 2006. SanJose (Costa Rica). pp.857-872.Guizzardi M. M., & Pratella G. C., 1996. Biologicalcontrol of gray molt in pears by antagonisticbacteria. Biological Control 7: 30-37Hibar K. Daami-Remadi M. Khiaaareddine H., & ElMahjoub M. 2005. Effet inhibiteur in vitro et invivo de Trichoderma harzianum sur Fusariumoxysporum f. sp radicis-lycopersici Biotechnol.Agron. Soc Environ. 9 (3) 163-171.International Cocoa and Chocolate Organisation(ICCO), 2000. Célébration du cacao, 115 p.Kébé I. B., N’goran J. A.K., Tahi, G.M., Paulin, D.,Clément, D., & Eskes, A.B. 1996. Pathologyand breeding for resistance to black pod inCôte d’Ivoire.In : proceedings of theInternational Workshop on the Contribution ofdisease Resistance to cocoa VarietyImprovement. 24th- 26thNovember, 1996.Salvador, Bahia (Brazil). pp. 135-139.Koné Y. R., 1999. Etude de la structure actuelledes populations de Phytophthora spp., agentsde la pourriture brune des cabosses ducacaoyer (Theobroma cacao L.) en Côted’Ivoire. Mémoire de Diplôme d’AgronomieApprofondie, Option Défense des cultures,Ecole Supérieure d’Agronomie, Yamous-soukro.111 p.Kouamé K. D. 2006. Structure et dynamique despopulations de Phytophthora spp., agents dela pourriture brune des cabosses du cacaoyer(Theobroma cacao L.) en Côte d’Ivoire.Mémoire de DEA. UFR Biosciences. Universitéde Cocody, Abidjan, Côte d’Ivoire. 74 p.Krauss U. & Soberanis W., 2001. Biocontrol ofcocoa pod diseases with Mycoparasitemixtures. Biological control 22: 149-158.Krauss U. & Soberanis W., 2002. Effect offertilization and biocontrol applicationfrequency on cocoa pod diseases. BiologicalControl 24: 82-89.Lass R. A., 1985 Disease. In Cocoa.. Wood G.A.R.,& Lass R. A. Eds. 4thedition, Longman,Longman, 265-365.Maurhofer M., Hase C., Meuwly Ph., Métraux J-P.,Défago G. 1994. Induction of systemicresistance of tobacco to tobacco necrosis virusby the root colonizing Pseudomonasfluorescens strain CHAO: influence of the gacA gene and of pyoverdine production.Phytopathology 84: 139-146.Nyassé S., Cilas C., Hérail C., & Blaha G. 1995.Leaf inoculation as an early screening test forcocoa (Theobroma cacao L.) resistance toPhytophthora black pod disease. CropProtection 14 (8): 657-663.Peixoto-Neto P.A.S. 2002. Microorganismosendofiticos. Biotecnologia Ciência &Desenvolvimento. 2002: 62-76.Rapilly F. 1968. Les techniques de mycologieen pathologie végétale. Annales des
  12. 12. 82Sci. Nat. Vol. 6 N°1 : 71 - 82 (2009)KEBE I. Boubacar et al.82Epiphyties Volume 19. N° hors-série. INRA.Paris. pp 25-39.Rubini M. R., Silva-Ribeiro R. T., Pomella, A. W.V., Maki C. S., Araujo W. L., dos Santos D. R.,& Azevedo J. L., 2005. Diversity of endophyticfungal community of cacao (Theobromacacao L.) and biological control of Crinipellisperniciosa, causal agent of Witches’BroomDisease. Int. J Biol Sci. 1: 24-33.Samuels G.J. 1996. Trichoderma: a review ofbiology and systematic of the genus.Mycological Research 100: 923 – 935.Sanogo S, Pomella A., Hebbar P.K., Bailey B.Costa J.C.B., Samuels G.J. & LumsdenR.D.2002. Production and germination ofconidia of Trichoderma stromaticum, aMycoparasite of Crinipellis perniciosa onCacao. Phytopathology 92: 1032-1037.Shari Fuddin S. 2000. Studies on cocoarhizosphere Bacteria for biological control ofPhytophthora species. In: proceedings of the13th International Cocoa Research Conference.9-14 October 2000. Kota Kinabalu, Sabah(Malaysia). pp.489-493.Tahi M., Kebe, I. Eskes A.B., Ouattara S., SangareA. & Mondeil F. 2000. Rapid screening ofcacao genotypes for field resistance toPhytophthora palmivora using leaves, twigsand roots. European Journal of PlantPathology 106: 87-94.Tondje P. R., Roberts D.P., Bon M.C., Widmer T.,Samuels G.J., Ismaiel A., Begoude A.D.,Tchana T., Nyemb-Tshomb E., Ndoumbe-Nkeng M., Bateman R, Fontem D. & HebbarK.P. 2007. Isolation and identification ofmycoparasitic isolates of Trichodermaasperellum with potential for suppression ofblack pod disease of cacao in Cameroon.Biological control. 43: 202-212.

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