Le document décrit la préparation et l'observation microscopique d'échantillons, y compris des organismes vivants, des fragments de végétaux et des minéraux. Il explique les méthodes adéquates pour réaliser des préparations, ainsi que l'utilisation de divers colorants pour mieux visualiser les structures biologiques. Des conseils pratiques pour l'observation au microscope et des techniques de coloration spécifiques sont également fournis.

1. Faire une
préparation
microscopique

2. Une préparation microscopique est constituée de :
1. une lame de verre
2. un objet de petite taille et de faible épaisseur
3. une lamelle
L'objet, compris entre la lame et la lamelle, est traversé par la lumière et peut être observé au
microscope.
Que peut-on observer au microscope ?
Les rayons lumineux chauffent la préparation légèrement mais ne sont pas destructeurs : on
peut donc observer de petits êtres vivants entiers (bactéries, unicellulaires) ou des fragments
vivants de plus grands organismes (végétaux ou animaux). On peut aussi observer les
minéraux.
Les organismes unicellulaires au microscope
Lorsque l’on place de l’herbe, du cresson, des grains de blé ou d’autres végétaux dans de l’eau,
on observe quelques semaines plus tard une sorte de voile à la surface de l’eau : il contient des
micro-organismes appelés paramécies.
Des colorants doivent être utilisés pour observer les bactéries du yaourt ou des levures (on met
de la levure de boulanger dans de l’eau et on laisse les levures se réhydrater).

3. Le monde végétal au microscope
1. Les moisissures sont faciles à observer. Pour se procurer des moisissures, c’est très
simple : On peut imprégner d’eau une tranche de pain que l’on dépose sur une assiette
et que l’on recouvre d’un verre ou d’un saladier. Autant que possible, le verre choisi
ne doit pas toucher le pain et doit reposer sur les bords de l’assiette. Au bout de
quelques jours, on voit le pain se couvrir d’une multitude de moisissures de toutes les
couleurs. On peut mettre sous le verre ou le saladier d’autres substances humides : du
crottin de cheval, de la bouse de vache, des fruits, des haricots ayant gonflé dans de
l’eau durant 24 heures, du bois, etc.
2. L’étude du pollen est également simple. Il suffit de prendre une étamine encore
chargée de pollen dans une fleur.
Si on veut observer l’organisation d’un grain de pollen, on doit l’observer à sec :
placés dans une goutte d’eau, les grains de pollen se gonflent énormément et les
détails de la surface disparaissent. Les grains de pollen peuvent même éclater. Si on
dépose le pollen dans de l’eau sucrée, on peut voir les grains se gonfler lentement et,
quelques heures après, donner naissance à un tube qui s’allonge de plus en plus : c’est
la germination du grain de pollen.
3. Sur l’écorce des arbres, on voit souvent une poudre verte : ce sont des algues
microscopiques. On peut récupérer d’autres algues microscopiques en passant le doit
sur la vitre d’un aquarium, là où on voit des taches vertes.
4. Parmi les fragments de végétaux couramment observés, il y a l’oignon (au-dessous
des « pelures » extérieures, l’oignon est constitué de lames épaisses imbriquées ; il
faut prélever un fragment dans la pellicule extérieure de l’une ce ces lames).

4. Le monde animal au microscope
1.
Les ailes des papillons sont recouvertes d’une fine poussière qui s’enlève facilement.
Vue au microscope, cette matière pulvérulente se montre constituée par de petites
écailles qui portent des dessins, des lignes très fines… On trouve aussi des écailles sur
les ailes ou le corps de divers insectes.
2. En grattant la peau d’un poisson, on récupère aisément des écailles transparentes, que
l’on peut facilement observer au microscope.
3. On peut observer des cheveux, des poils d’animaux ou de la laine.
4. Si on laisse un seau d’eau dans un jardin, au bout d’un certain temps, on pourra
observer des sortes de petits vers noirâtres près de la surface, la tête en bas : ce sont
des larves de moustique.
5. Pour observer des animaux singuliers, intermédiaires entre des vers et des acariens, on
peut percer un point noir du nez : dans la masse blanchâtre qui sort vit un animal qui
s’appelle Demodex folliculorum.
L’observation d’une goutte de sang exige qu’on se pique avec une aiguille à coudre
que l’on stérilise en chauffant…
6. On peut aussi observer la circulation du sang chez un animal à sang froid tel qu’un
guppy femelle : on sort le poisson de son aquarium, on lui met une gaze humide sur la
tête et les branchies, et on place la queue bien étalée du poisson sous l’objectif du
microscope… Dès que l’observation est finie, le guppy est libéré dans son aquarium.
On peut aussi faire cette observation sur une patte de grenouille, au niveau des
membranes qui relient ses doigts ; la circulation dans la langue de la grenouille serait
encore plus belle… mais attention, la plupart des espèces de grenouilles sont
protégées, il est interdit de les sortir de leur milieu !

5. Les minéraux au microscope
Pour observer de petits cristaux au microscope, il suffit de dissoudre dans de l’eau du sel, du
suce, de la vanilline… Il faut avoir une solution très concentrée. On dispose une goutte de la
solution sur la lame de verre et on laisse la lame pendant plusieurs jours. L’eau de la goutte se
concentre de plus en plus, et le sel cristallise sur la lame de verre.

6. Réaliser une préparation microscopique simple
Préparer
le
matériel
Rassembler une lame et une lamelle de verre propres et sèches,
un compte-gouttes, un liquide de préparation (eau, colorée ou
non), des pinces fines… et ce que l’on veut observer.
Placer
l’objet sur
la lame de
verre
Si l’élément observé est liquide, on en prélève avec le compte-
goutte et on en dépose une goutte au centre de la lame.
Si l’élément observé est solide, on dépose une goutte du liquide
de préparation au centre de la lame, on place ensuite l’objet
dans la goutte, à l’aide des pinces fines. Par exemple on prélève
une petite partie de la moisissure que l’on veut étudier, en
faisant le possible pour ne pas enchevêtrer les filaments.
Des éléments du type « poudre » se font à sec, sans eau ni
colorant. C’est le cas des écailles des ailes de papillons (on
enlève un peu de « poussière » d’une aile de papillon, on la
dépose sur une lame de verre) ou du pollen (on frotte l’étamine
sur le centre de la plaque de verre).
Pour observer de petits animaux, on utilise des lames spéciales
qui ont un creux pour que l’animal puisse « tenir en épaisseur ».
Ces lames sont appelées « lames à concavité ».
Recouvrir
d’une
lamelle
On prend la lamelle très délicatement par deux de ses cotés, on
la pose contre la lame par un troisième coté. On approche la
lamelle au contact du liquide, tout en la maintenant oblique par
rapport à la lame. On lâche délicatement la lame.
Conseils pour réussir :
1. Ne pas mettre trop d'eau sur la préparation, ne pas mouiller la platine et l'objectif.
2. Regarder à l'oeil nu avant de mettre une préparation sous le microscope, on apprécie
ainsi la taille de l'objet, sa couleur, son mouvement éventuel...
3. Pour les moisissures : les filaments qui constituent les moisissures ne se mouillent pas
facilement. Il en résulte qu’entre eux subsistent des bulles d’air qui gênent une peu les
observations. Pour les diminuer, on peut remplacer l’eau par de l’acide lactique.

7. Les colorants pour préparation microscopique
La plupart des objets biologiques ne sont pas colorés ou sont faiblement colorés. D'où la
nécessité de colorer la plupart des échantillons. Voici les principaux colorants, il en existe
d’autres.
Coloration des structures cellulaires
Bleu de méthylène
Dissoudre 1 g de bleu de méthylène
dans 1 litre d’eau distillée, bien
mélanger
Ce colorant est utilisé essentiellement
pour colorer les noyaux et autres
structures oxydantes
Bleu de méthylène phéniqué
Dissoudre 2 g de Bleu de méthylène
et 20 g de phénol dans 100 ml
d’alcool à 95 %
Ce colorant est utilisé en
bactériologie (coloration simple pour
bactéries).
Liquide de Lugol
Broyer dans un mortier 1 g d’Iode
bisublimé et 2 g d’Iodure de
Potassium
Dissoudre dans 100 ml d’eau
distillée
(ajouter éventuellement un peu
d’iodure pour permettre la
dissolution totale de l’iode,
conserver dans une bouteille en
verre brun, s’utilise dilué et se
décolore à la longue)
Ce colorant s'utilise comme colorant
des noyaux des cellules végétales et
des membranes.
Il permet la mise en évidence des
grains d’amidon (amyloplastes)
contenus dans les cellules végétales :
par exemple dans le tubercule de
pomme de terre, dans les grains de
blé…

8. La coloration de Gram.
Mise au point en 1884 par le bactériologiste danois Hans Christian Gram, la méthode (ou
coloration) de gram ne permet pas seulement de déterminer la dimension, la forme ou
l'arrangement des bactéries, mais divise aussi les bactéries en deux grandes catégories selon
leur coloration :
 les bactéries qui se colorent en violet sont dites « gram-positives »
 les bactéries qui se colorent en rose sont dites « gram-négatives ».
C'est un important système de groupement parce que la couleur indique de quelle façon la
cellule bactérienne est structurée et de quelle manière elle peut réagir à certains antibiotiques.
Pour réaliser la coloration de Gram, on utilise plusieurs produits et, selon le type de paroi qui
entoure les bactéries, c’est un produit ou un autre qui va être retenu. Résultat : les bactéries
apparaissent de différentes couleurs.
 Les bactéries dites Gram positif, colorées en violet, ont une paroi très riche en
peptidoglycane (polymère de glucides) qui retient le colorant violet, ainsi le rinçage à
l'alcool ne parvient pas à éliminer la coloration au cristal violet.
 Les bactéries dites Gram négatif, renferment très peu de peptoglycane dans leur paroi
et apparaissent colorées en rose par la safranine, le rinçage à l'alcool éliminant la
coloration au cristal violet.
Technique opératoire :
 Faire un frottis de bactéries à identifier, laisser sécher à l’air libre.
 Fixer le frottis à la flamme et laisser refroidir.
 Recouvrir le frottis de cristal violet ; laisser 1 min puis rincer à l’eau distillée.
 Recouvrir la lame de Lugol (mordant) ; laisser 1 min puis rincer à l’eau distillée.
 Recouvrir la lame d’Alcool (rinçage du cristal violet) ; laisser 30 s puis rincer à l’eau
distillée.
 Recouvrir le frottis de safranine ; laisser 1 min puis rincer à l’eau distillée.
 Sécher et observer au microscope.

9. Coloration des chromosomes
Carmin acétique
Dissoudre 0,5 g de Carmin 40
pour Histologie, dans un mélange
de 55 ml d’eau distillée et 45 ml
d’acide Acétique.
Porter le mélange à ébullition,
laisser ensuite bouillir 1 à 2
minutes. Laisser refroidir, puis
filtrer. Ce colorant se conserve
bien à température ambiante.
Ce colorant s'utilise à chaud pour
colorer les chromosomes des cellules
de racines de liliacées.
Il s’utilise à froid pour colorer les
chromosomes des cellules des parois
de glandes salivaires de chironomes
(laisser agir quelques minutes).
Orcéine acétique
Dissoudre 1 g d’Orcéine dans 45
ml d’acide Acétique.
Porter le mélange à ébullition,
laisser bouillir 1 à 2 minutes.
Laisser refroidir et filtrer.
Ce colorant se conserve bien au
frais (non dilué).
Ce colorant s’utilise dilué au demi pour
la coloration à froid des chromosomes
des cellules de racines de liliacées,
après trempage dans un bain d'acide
chlorhydrique.
Vert de méthyle acétique
Dissoudre 1 g de Vert de Méthyle
dans un mélange de 55 ml d’eau
distillée et 45 ml d’acide Acétique.
Ce colorant s'utilise pour colorer les
chromosomes des cellules des parois
de glandes salivaires de chironomes.
Coloration des vacuoles végétales
Rouge neutre
Dissoudre 1 g de Rouge Neutre
dans 1 l d’eau à pH 7 (tampon
phosphate ou eau de Volvic)
Colorant de la vacuole, le rouge neutre
s'utilise sur toutes les cellules végétales
(épithéliums, poils absorbants...)
Coloration des coupes de tissus végétaux
Carmin aluné
Dissoudre 1 g de Carmin 40 pour
histologie et 4 g d’alun de Potassium
dans 100 ml d’eau distillée.
Porter le mélange à ébullition,
laisser refroidir et filtrer.
Colore en rose les tissus contenant de
la cellulose (phloème ...)
Vert d'iode
Dissoudre 1 g de vert d’iode dans
100 ml d’eau distillée.
Colore en vert les tissus lignifiés
(xylème, sclérenchyme...)
Carmin Vert d'iode (ou Carmino-
vert de Mirande)
Dissoudre 6 g de Carmin 40 pour
histologie et 12 g d’alun de
Potassium dans 200 ml d’eau
distillée.
Chauffer à feu doux, ajouter 200 ml
d’eau distillée et 0,4 g de Vert
Double coloration des tissus
végétaux (colore en rose les tissus
cellulosiques et en vert les tissus
lignifiés)

10. d’Iode, porter à ébullition puis
laisser refroidir et filtrer.
Les colorants spécifiques
Rouge Soudan III :
Dissoudre 1 g de Rouge
Soudan dans 100 ml d’alcool à
70 %.
Laisser décanter puis filtrer.
Peu soluble dans l'alcool et très soluble
dans les lipides, le rouge soudan III colore
les lipides, par exemple les lipides du lait
ou des graines à réserves lipidiques.
Bleu de Toluidine :
Dissoudre 0,1 g de bleu de
Toluidine dans 100 ml d’eau
distillée tamponnée à pH 4,6
(tampon acétate).
Ce colorant est utilisé pour colorer les
protides, par exemple les grains d'aleurone
des graines à réserves protidiques ...