Ce document examine les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain et leur potentiel myogénique, en mettant en lumière leur capacité à se différencier en divers types cellulaires, y compris les myoblastes. Il analyse les mécanismes régulant la myogenèse, notamment les facteurs de transcription essentiels, et présente des résultats expérimentaux révélant que ces cellules peuvent contribuer à la formation de myotubes hybrides avec des myoblastes. La recherche soutient l'idée que les cellules souches mésenchymateuses ont une plasticité myogénique intrinsèque, impliquant une conversion myogénique potentielle par fusion cellulaire.

1. Les cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux humain : Etude de leur potentiel myogénique Ari Massoudi UMR 6543 CNRS « Stem cells and differentiation » Centre de Biochimie Université de Nice-Sophia Antipolis Faculte des Sciences

2. Renouvellement tissulaire - Tissus à renouvellement rapide Renouvellement de l’épiderme Renouvellement de l’épithélium intestinal Renouvellement des cellules du sang … . Dégénérescence - Traumatique (brulure, blessure…) - Pathologique (Alzheimer, défaut génétique, cirrhose…) Des cellules non-spécialisées assurent le maintien de l’homéostasie tissulaire : « cellules souches et progéniteurs » Un homme adulte ≈ 10 trillions (10.10 18 ) de cellules spécialisées 20- 40 millions de cellules disparaissent / seconde !

3. Totipotentes stade 8 blastomères (3 jours) Nouveau-né œuf fécondé (jour 1) embryon pré-implantatoire Pluripotentes cellules souches embryonnaires (ES) (≈400 types cellulaires) trophoblaste Bouton embryonnaire (ICM) Embryon/Fœtus cellules foetales Multipotentes Cellules souches du cordon ombilical Cellules souches adultes NSC MSC SC ESC SPG … Multipotentes, Oligopotentes, Unipotentes Totipotentes => organisme entier Pluripotentes => l’ensemble des types cellulaires Multi / oligopotentes => capacités plus restreintes Unipotentes => un seul type cellulaire cellules souches/progéniteurs (Adulte ≈ 400 types cellulaires) cellules souches germinales embryonnaires (EG) Pluripotentes

4. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Hiérarchie ontogénique Potentiel régénératif Les cellules souches sont des cellules « rares » Fréquence : 1 / 500 à 10 8 Identité tissulaire

5. « Définition minimum mais insuffisante » : « Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire Cellule souche

6. Cellule souche « Définition minimum mais insuffisante » : « Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire Traits importants s’ajoutant à la définition minimum : Auto-renouvellement : maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires Multipotence : la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire Clonogénicité : les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule

7. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Auto-renouvellement Maintien du pool de cellules souches au fil des générations

8. Cellule souche « Définition minimum mais insuffisante » : « Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire Traits importants s’ajoutant à la définition minimum : Auto-renouvellement : maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires Multipotence : la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire Clonogénicité : les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule

9. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Mulipotence La potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire

10. Multipotence par plasticité progéniteurs unipotents cellule souche indéterminée Programme type cellulaire B Plasticité : capacité d’acquérir de novo différents « programmes » de différenciations Le programme peut se matérialiser par l’expression de facteurs de transcription qui entrainent l’expression de gènes spécifiques d’un type cellulaire Programme type cellulaire A

11. Multipotence par trans-différenciation Song et al. Faseb J. 2004 de la Fuente et al. Exp Cell Res. 2004 Real et al. Dev Biol. 2006

12. Multipotence par fusion Ying et al. Nature. 2002 Terada et al. Nature. 2002 Spees et al. PNAS. 2003 Garbade et al. EJCS. 2005 Ishikawa et al.FASEB J.2006

13. Cellule souche « Définition minimum mais insuffisante » : « Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire Traits importants s’ajoutant à la définition minimum : Auto-renouvellement : maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires Multipotence : la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire Clonogénicité : les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule

14. Cellules souches mésenchymateuses (MSC) Définition de l’ International Society for Cellular Therapy (ISCT) : Toute population cellulaire obtenue à partir d’un tissu/organe ayant in vitro les caractéristiques minimums suivantes : Adhérence au plastique (par opposition aux cellules hématopoïétiques) Multipotence mésenchymateuse Adipo-Ostéo-Chondrocytaire Combinatoire d’expression des marqueurs de surface : CD45, CD34 , CD19, CD14, CD11b, HLA-II… Négatives CD105, CD90, CD73… Positives Clonogénicité

15. culture in vitro expansion cellules adhérentes adipocytes cellules stroma-vasculaire Tissu adipeux humain nouveaux-nés ou enfants human Multipotent Adipose-Derived Stem cells (hMADS cells) Culture secondaire Zaragosi et al. Stem Cells. 2006 Rodriguez et al. J Exp Med. 2005 Auto-renouvellement Activité télomérase Caryotype normal Non-tumorigénique in vivo - souris nude - Multipotence cellules hMADS => propriétés fondamentales de cellules souches :

16. Multipotence mésenchymateuse des cellules hMADS cellules hMADS adipocytes ostéocytes chondrocytes induction adipogénique induction osteogénique induction chrodrogénique cellules hMADS = MSC du tissu adipeux CD34 négative adhérence au plastique

17. Multipotence mésenchymateuse par « plasticité » ALP Ostéonectine Ostéocalcine Ostéopontine Col I  1 … CBFA-1 Osterix SMADs VD 3 R FosB Adipocytes CD36 GAPDH LPL aFABP Leptine Adiponectine Adipsine … Pref-1 C/EBP  C/EBP  PPAR  PPAR  C/EBP  Induction adipogénique Induction ostéogénique progéniteur précurseur Ostéocytes Alizarin red ORO hMADS cells

18. Contribution myogénique cellules hMADS in vivo cellules hMADS injection intra-musculaire Résultats antérieurs du laboratoire : Protéine dystrophine humaine Noyaux hMADS / myofibre Rodriguez et al. J Exp Med . 2005. plusieurs mois après souris mdx Souris mdx = modèle de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) Mutation ponctuelle dans le gène dystrophine => nécrose musculaire

19. Myogenèse La myogenèse est sous le contrôle de facteurs de transcription « clés » : Myogenic Regulatory Factors (MRF) : Pax7, MyoD, myf-5, myogénine, MRF4

20. nls-LacZ cellules hMADS myoblastes lignée C2C12 souris + noyau humain  -gal + myotube hybride homme - souris Résultats similaires obtenus avec : Myoblastes primaires souris wt ou mdx Myoblastes humains de patients sains Myoblastes humains de patient DMD Contribution myogénique cellules hMADS in vitro

21. Expression de messagers musculaires humains en co-culture hMADS / C2C12 D 0 D 1 D 2 D 4 hMADS cells / C2C12 co-cultures h = human specific primers m = mouse specific primers h sarcospan h dystrophin h muscle creatine kinase h enolase 3 h desmin h actin m hprt muscle markers human muscle cells mouse C2C12 RT-PCR

22. noyaux hMADS  sarcoglycane humain ( confocal analysis ) Expression de la protéine  -sarcoglycane en co-culture hMADS / C2C12  sarcoglycane humain

23. Expression de la dystrophine en co-culture Myotubes hybrides hMADS/DMD expriment la dystrophine Myotubes issus de myoblastes de patient DMD Co-culture celllules hMADS / myoblastes DMD dystrophine

24. 3) Par quel mécanisme les cellules hMADS contribuent-elles à la myogenèse ? Contribution des cellules hMADS à la formation de myotubes hybrides 2) Expression de gènes musculaires codés par le génome hMADS dans les myotubes hybrides in vitro

25. Hypothèse : Les cellules hMADS possèdent une « plasticité myogénique » intrinsèque ? Stratégie : « Allumer » le programme myogénique en testant différentes conditions inductives connues pour promouvoir la myogenèse Mecanisme de la contribution myogénique ?

26. 46 conditions de culture testées en présence ou en l’absence de sérum milieux conditionnés provenant de myoblastes membrane natives provenant de myoblastes différents type de matrice extracellulaire Aucune des conditions testées n’a permit d’induire un programme myogénique Conditions de culture testées pour promouvoir la myogenèse des cellules hMADS

27. Hypothèse : Seuls les myoblastes induisent le programme myogénique dans les cellules hMADS ? Stratégie : Evaluer l’expression des MRF par les cellules hMADS en co-cultures Pax7 ? MyoD ? Myogenin ? cellules hMADS Myoblastes Induction « complexe » Mecanisme de la contribution myogénique ? Pax7 + MyoD + Myogenin + « myo »-hMADS

28. myoblastes Myogenin + Expression de la myogénine en co-culture GFP-hMADS / myoblastes C2C12 GFP-hMADS cells Myogenin - Aucun MRF exprimé par les cellules hMADS en co-culture Expression des MRF en co-culture GFP-hMADS cells : Pax7 - Myoblasts : Pax7+ GFP-hMADS cells : MyoD - Myoblasts : MyoD+ Résultats similaires : co-cultures hMADS/ myoblastes humains

29. Expression de la myogenin en co-culture GFP noyau hMADS Hoescht smooth noyau souris merge myoG Noyaux issus des cellules hMADS dans les myotubes hybrides contiennent la myogénine codée par le génome de souris noyau hMADS noyau souris hum myogenin hum actin mouse hprt co-culture hMADS/C2C12 myotubes RT-PCR human muscle cells mouse C2C12

30. Mécanisme de la contribution myogénique ? cellules hMADS Myoblastes induction « complexe » Engagement « partiel » indépendante des MRF ? Hypothèse : Pax7 - MyoD - Myogenin - Desmine + Nestine + « myo-like »-hMADS Desmine ? Nestine ?

31. myoblastes myotubes (j4) myoblastes humains GFP-hMADS + myoblastes C2C12 souris Nestine « humaine » différenciation Expression de Nestine humaine En co-cultures, seuls les myotubes hybrides expriment la Nestine humaine Co-culture

32. Expression de Nestine humaine Co-culture cellules hMADS / myoblastes C2C12 souris Myotube hybride Myotubes humain * * * *

33. Conclusion 2 nd hypothèse Engagement partiel 1 st hypothèse Plasticité myogénique Modèle : Conversion myogénique post-fusion Expression gènes musculaires :  sarcoglycane + dystrophine + nestine + sarcospane + desmin + enolase3 + muscle creatine kinase + myocytes cellules hMADS Fusion cellulaire myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Conversion myogénique des cellules hMADS

34. Perspectives Expression gènes musculaires :  sarcoglycan + dystrophin + nestin + sarcospan + desmin + enolase3 + muscle creatin kinase + myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Rôle des MRFs dans la reprogrammation Facteurs impliqués dans la fusion hétérologue reprogrammation approche globale Myogenin-expressing myoblasts hMADS cells cellular fusion

35. This work has been supported by Association Française contre les Myopathies