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Les cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux humain :  Etude de leur potentiel myogénique Ari Massoudi UMR 6543 CNRS « Stem cells and differentiation » Centre de Biochimie Université de Nice-Sophia Antipolis Faculte des Sciences
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Des cellules non-spécialisées assurent le maintien de l’homéostasie tissulaire : « cellules souches et progéniteurs »  Un homme adulte ≈ 10 trillions (10.10 18  ) de cellules spécialisées ,[object Object],[object Object]
Totipotentes stade 8 blastomères  (3 jours) Nouveau-né œuf fécondé (jour 1) embryon  pré-implantatoire Pluripotentes cellules souches  embryonnaires (ES) (≈400 types cellulaires) trophoblaste Bouton embryonnaire (ICM) Embryon/Fœtus cellules foetales Multipotentes ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Multipotentes, Oligopotentes, Unipotentes ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],cellules souches/progéniteurs (Adulte ≈ 400 types cellulaires) cellules souches germinales embryonnaires (EG) Pluripotentes
progéniteur précurseur cellule différenciée cellule  souche Hiérarchie ontogénique Potentiel  régénératif Les cellules souches sont des cellules « rares » Fréquence : 1 / 500 à 10 8   Identité tissulaire
« Définition minimum mais insuffisante » : « Cellule  indifférenciée  » ayant la «  potentialité  »  de se transformer en au moins un type cellulaire Cellule souche
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
progéniteur précurseur cellule différenciée cellule  souche Auto-renouvellement Maintien du pool de cellules souches au fil des générations
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
progéniteur précurseur cellule différenciée cellule  souche Mulipotence La potentialité de se transformer  en plus d’un type  cellulaire
Multipotence par plasticité progéniteurs  unipotents cellule  souche indéterminée Programme type cellulaire B Plasticité : capacité d’acquérir  de novo   différents  « programmes » de différenciations Le programme peut se matérialiser par l’expression de facteurs de transcription qui  entrainent l’expression de gènes spécifiques d’un type cellulaire Programme type cellulaire A
Multipotence  par trans-différenciation Song et al. Faseb J. 2004 de la Fuente et al. Exp Cell Res. 2004 Real et al. Dev Biol. 2006
Multipotence par fusion Ying et al. Nature. 2002 Terada et al. Nature. 2002 Spees et al. PNAS. 2003 Garbade et al. EJCS. 2005  Ishikawa et al.FASEB J.2006
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Cellules souches mésenchymateuses (MSC) ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
culture  in vitro expansion  cellules adhérentes adipocytes cellules  stroma-vasculaire  Tissu adipeux humain nouveaux-nés ou enfants human Multipotent Adipose-Derived Stem cells (hMADS cells) Culture secondaire Zaragosi et al. Stem Cells. 2006  Rodriguez et al.  J Exp Med. 2005 ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],cellules hMADS => propriétés fondamentales de cellules souches  :
Multipotence  mésenchymateuse des cellules hMADS cellules hMADS adipocytes ostéocytes chondrocytes induction  adipogénique induction  osteogénique induction  chrodrogénique cellules hMADS = MSC du tissu adipeux ,[object Object],[object Object]
Multipotence  mésenchymateuse par «  plasticité  » ALP Ostéonectine Ostéocalcine Ostéopontine Col I  1 … CBFA-1 Osterix SMADs VD 3 R FosB Adipocytes CD36 GAPDH LPL aFABP Leptine Adiponectine Adipsine … Pref-1 C/EBP  C/EBP  PPAR  PPAR  C/EBP  Induction adipogénique Induction ostéogénique progéniteur précurseur Ostéocytes Alizarin red ORO hMADS cells
Contribution myogénique cellules hMADS  in vivo   cellules hMADS injection intra-musculaire Résultats antérieurs du laboratoire  : Protéine dystrophine humaine Noyaux hMADS / myofibre Rodriguez et al.  J Exp Med . 2005. plusieurs  mois après souris mdx Souris mdx = modèle de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) Mutation ponctuelle dans le gène dystrophine => nécrose musculaire
Myogenèse La myogenèse est sous le contrôle de facteurs de transcription « clés » : Myogenic Regulatory Factors (MRF) : Pax7, MyoD, myf-5, myogénine, MRF4
nls-LacZ cellules hMADS myoblastes  lignée C2C12  souris + noyau humain  -gal + myotube hybride homme - souris ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Contribution myogénique cellules hMADS  in vitro
Expression de messagers musculaires humains en co-culture hMADS / C2C12 D 0 D 1 D 2 D 4 hMADS cells / C2C12  co-cultures h = human specific primers m = mouse specific primers h sarcospan h dystrophin h muscle creatine kinase h enolase 3 h desmin h actin m hprt muscle  markers human muscle cells mouse C2C12 RT-PCR
noyaux hMADS  sarcoglycane  humain ( confocal analysis ) Expression de la protéine   -sarcoglycane en co-culture hMADS / C2C12  sarcoglycane  humain
Expression de la dystrophine en co-culture Myotubes hybrides hMADS/DMD expriment la dystrophine Myotubes issus de myoblastes de patient DMD Co-culture  celllules hMADS / myoblastes DMD dystrophine
3) Par quel mécanisme les cellules hMADS contribuent-elles à la myogenèse ? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],in vitro
Hypothèse :  Les cellules hMADS possèdent  une « plasticité myogénique » intrinsèque ? Stratégie : « Allumer » le programme myogénique  en testant différentes conditions inductives  connues pour promouvoir la myogenèse Mecanisme de la contribution myogénique ?
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Aucune des conditions testées n’a permit d’induire un programme myogénique Conditions de culture testées pour promouvoir la myogenèse des cellules hMADS
Hypothèse :   Seuls les myoblastes induisent le programme myogénique  dans les cellules hMADS ? Stratégie : Evaluer l’expression des MRF par les cellules hMADS en co-cultures Pax7 ?  MyoD ?  Myogenin ? cellules  hMADS Myoblastes Induction « complexe » Mecanisme de la contribution myogénique ? Pax7 +  MyoD +  Myogenin + « myo »-hMADS
myoblastes   Myogenin +   Expression de la myogénine  en co-culture GFP-hMADS / myoblastes C2C12 GFP-hMADS cells Myogenin - Aucun MRF exprimé par les cellules hMADS en co-culture Expression des MRF en co-culture  GFP-hMADS cells   :   Pax7 - Myoblasts :  Pax7+ GFP-hMADS cells   :   MyoD -   Myoblasts   :  MyoD+ Résultats similaires : co-cultures hMADS/ myoblastes humains
Expression de la myogenin en co-culture GFP   noyau  hMADS  Hoescht  smooth noyau  souris merge  myoG   Noyaux issus des cellules hMADS dans les myotubes hybrides contiennent la myogénine codée par le génome de souris noyau  hMADS  noyau  souris hum myogenin hum actin mouse hprt co-culture hMADS/C2C12  myotubes RT-PCR human muscle cells mouse C2C12
Mécanisme de la contribution myogénique ? cellules  hMADS Myoblastes induction «  complexe  »  Engagement «  partiel  » indépendante des MRF ? Hypothèse : Pax7  -   MyoD  -   Myogenin  - Desmine + Nestine + « myo-like »-hMADS Desmine ? Nestine ?
myoblastes  myotubes (j4) myoblastes  humains GFP-hMADS + myoblastes C2C12 souris  Nestine   «  humaine  »  différenciation Expression de Nestine humaine En co-cultures, seuls les myotubes hybrides expriment la Nestine humaine Co-culture
Expression de Nestine humaine Co-culture cellules hMADS / myoblastes C2C12 souris Myotube hybride Myotubes   humain * * * *
Conclusion 2 nd  hypothèse Engagement partiel 1 st  hypothèse Plasticité myogénique Modèle : Conversion  myogénique post-fusion Expression  gènes musculaires :  sarcoglycane   + dystrophine + nestine + sarcospane + desmin + enolase3 + muscle creatine kinase + myocytes cellules hMADS Fusion cellulaire myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Conversion myogénique des cellules hMADS
Perspectives Expression  gènes musculaires :  sarcoglycan   + dystrophin + nestin + sarcospan + desmin + enolase3 + muscle creatin kinase + myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Rôle des MRFs dans  la reprogrammation Facteurs impliqués dans la fusion hétérologue reprogrammation approche globale Myogenin-expressing  myoblasts hMADS cells cellular fusion
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How fat stem cells could or not form muscle cells (French)

  • 1. Les cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux humain : Etude de leur potentiel myogénique Ari Massoudi UMR 6543 CNRS « Stem cells and differentiation » Centre de Biochimie Université de Nice-Sophia Antipolis Faculte des Sciences
  • 2.
  • 3.
  • 4. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Hiérarchie ontogénique Potentiel régénératif Les cellules souches sont des cellules « rares » Fréquence : 1 / 500 à 10 8 Identité tissulaire
  • 5. « Définition minimum mais insuffisante » : « Cellule indifférenciée  » ayant la « potentialité  » de se transformer en au moins un type cellulaire Cellule souche
  • 6.
  • 7. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Auto-renouvellement Maintien du pool de cellules souches au fil des générations
  • 8.
  • 9. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Mulipotence La potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
  • 10. Multipotence par plasticité progéniteurs unipotents cellule souche indéterminée Programme type cellulaire B Plasticité : capacité d’acquérir de novo différents « programmes » de différenciations Le programme peut se matérialiser par l’expression de facteurs de transcription qui entrainent l’expression de gènes spécifiques d’un type cellulaire Programme type cellulaire A
  • 11. Multipotence par trans-différenciation Song et al. Faseb J. 2004 de la Fuente et al. Exp Cell Res. 2004 Real et al. Dev Biol. 2006
  • 12. Multipotence par fusion Ying et al. Nature. 2002 Terada et al. Nature. 2002 Spees et al. PNAS. 2003 Garbade et al. EJCS. 2005 Ishikawa et al.FASEB J.2006
  • 13.
  • 14.
  • 15.
  • 16.
  • 17. Multipotence mésenchymateuse par «  plasticité  » ALP Ostéonectine Ostéocalcine Ostéopontine Col I  1 … CBFA-1 Osterix SMADs VD 3 R FosB Adipocytes CD36 GAPDH LPL aFABP Leptine Adiponectine Adipsine … Pref-1 C/EBP  C/EBP  PPAR  PPAR  C/EBP  Induction adipogénique Induction ostéogénique progéniteur précurseur Ostéocytes Alizarin red ORO hMADS cells
  • 18. Contribution myogénique cellules hMADS in vivo cellules hMADS injection intra-musculaire Résultats antérieurs du laboratoire : Protéine dystrophine humaine Noyaux hMADS / myofibre Rodriguez et al. J Exp Med . 2005. plusieurs mois après souris mdx Souris mdx = modèle de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) Mutation ponctuelle dans le gène dystrophine => nécrose musculaire
  • 19. Myogenèse La myogenèse est sous le contrôle de facteurs de transcription « clés » : Myogenic Regulatory Factors (MRF) : Pax7, MyoD, myf-5, myogénine, MRF4
  • 20.
  • 21. Expression de messagers musculaires humains en co-culture hMADS / C2C12 D 0 D 1 D 2 D 4 hMADS cells / C2C12 co-cultures h = human specific primers m = mouse specific primers h sarcospan h dystrophin h muscle creatine kinase h enolase 3 h desmin h actin m hprt muscle markers human muscle cells mouse C2C12 RT-PCR
  • 22. noyaux hMADS  sarcoglycane humain ( confocal analysis ) Expression de la protéine  -sarcoglycane en co-culture hMADS / C2C12  sarcoglycane humain
  • 23. Expression de la dystrophine en co-culture Myotubes hybrides hMADS/DMD expriment la dystrophine Myotubes issus de myoblastes de patient DMD Co-culture celllules hMADS / myoblastes DMD dystrophine
  • 24.
  • 25. Hypothèse : Les cellules hMADS possèdent une « plasticité myogénique » intrinsèque ? Stratégie : « Allumer » le programme myogénique en testant différentes conditions inductives connues pour promouvoir la myogenèse Mecanisme de la contribution myogénique ?
  • 26.
  • 27. Hypothèse : Seuls les myoblastes induisent le programme myogénique dans les cellules hMADS ? Stratégie : Evaluer l’expression des MRF par les cellules hMADS en co-cultures Pax7 ? MyoD ? Myogenin ? cellules hMADS Myoblastes Induction « complexe » Mecanisme de la contribution myogénique ? Pax7 + MyoD + Myogenin + « myo »-hMADS
  • 28. myoblastes Myogenin + Expression de la myogénine en co-culture GFP-hMADS / myoblastes C2C12 GFP-hMADS cells Myogenin - Aucun MRF exprimé par les cellules hMADS en co-culture Expression des MRF en co-culture GFP-hMADS cells : Pax7 - Myoblasts : Pax7+ GFP-hMADS cells : MyoD - Myoblasts : MyoD+ Résultats similaires : co-cultures hMADS/ myoblastes humains
  • 29. Expression de la myogenin en co-culture GFP noyau hMADS Hoescht smooth noyau souris merge myoG Noyaux issus des cellules hMADS dans les myotubes hybrides contiennent la myogénine codée par le génome de souris noyau hMADS noyau souris hum myogenin hum actin mouse hprt co-culture hMADS/C2C12 myotubes RT-PCR human muscle cells mouse C2C12
  • 30. Mécanisme de la contribution myogénique ? cellules hMADS Myoblastes induction «  complexe  » Engagement «  partiel  » indépendante des MRF ? Hypothèse : Pax7 - MyoD - Myogenin - Desmine + Nestine + « myo-like »-hMADS Desmine ? Nestine ?
  • 31. myoblastes myotubes (j4) myoblastes humains GFP-hMADS + myoblastes C2C12 souris Nestine «  humaine  » différenciation Expression de Nestine humaine En co-cultures, seuls les myotubes hybrides expriment la Nestine humaine Co-culture
  • 32. Expression de Nestine humaine Co-culture cellules hMADS / myoblastes C2C12 souris Myotube hybride Myotubes humain * * * *
  • 33. Conclusion 2 nd hypothèse Engagement partiel 1 st hypothèse Plasticité myogénique Modèle : Conversion myogénique post-fusion Expression gènes musculaires :  sarcoglycane + dystrophine + nestine + sarcospane + desmin + enolase3 + muscle creatine kinase + myocytes cellules hMADS Fusion cellulaire myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Conversion myogénique des cellules hMADS
  • 34. Perspectives Expression gènes musculaires :  sarcoglycan + dystrophin + nestin + sarcospan + desmin + enolase3 + muscle creatin kinase + myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Rôle des MRFs dans la reprogrammation Facteurs impliqués dans la fusion hétérologue reprogrammation approche globale Myogenin-expressing myoblasts hMADS cells cellular fusion
  • 35. This work has been supported by Association Française contre les Myopathies

Notes de l'éditeur

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