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2011                                                                     Poster 7
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  Contrôle de l’hyperhomocystéinémie
    par un adénovirus surexprimant
                 DYRK1A

Tlili A1, Jacobs F2, Mohamed S1, Paul JL3,4, Delabar JM1, De Geest B2, Janel N1

1 – Laboratory of gene Dysregulation and Differentiation, Univ Paris Diderot-CNRS EAC 4413,
Unit of Functional and Adaptative Biology (BFA), Paris, France.
2 – Center for Molecular and Vascular Biology, Campus Gasthuisberg, Leuven, Belgique.
3 – HP, Hôpital Européen Georges Pompidou, Service de Biochimie, Paris, France.
4 – Université Paris-Sud, UMR 1154-INRA, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France.
Introduction
                      L’hyperhomocystéinémie
                                    (1)


Définition:
Maladie métabolique qui conduit à
l’augmentation du taux plasmatique de
l’homocystéine. Il existe 3 formes:
        Forme          Homocystéine (µM)
        Modérée            15-30
      Intermédiaire        30-100
        Sévère             >100



Les causes:
 Facteurs génétiques (déficit en
MTHFR, CBS, MS…)
 Mode de vie (alimentation, alcool, tabac…)
 Médicaments
(antiépileptiques, hypolipidémiants)
 Maladies (troubles
gastrointestinaux, troubles
rénaux, diabète, maladies
                                                           Cycle de
neurodégénératives)
                                                       l’homocystéine
Les conséquences:
Altération du métabolisme hépatique des facteur de risque des
      L’hyperhomocystéinémie est un
      maladies cardiovasculaires.
lipides
Introduction
                                 Dyrk1a , Trisomie
                                            (2)  21 et
                                 hyperhomocystéinémie
Dyrk1a (Dual-specificity tyrosine (Y) Regulated Kinase 1a) est une sérine-thréonine
kinase dont le gène codant est situé sur le chromosome 21 humain. Cette protéine
est donc surexprimée chez les personnes atteintes du Syndrome de Down (trisomie
21).                                  Hyperhomocystéinémie Trisomie 21

      Homocystéine plasmatique                   ++                 -
      Expression hépatique de Dyrk1a             -                  ++
      Incidence des maladies cardiovasculaires




 Une corrélation négative entre le taux d’homocystéine plasmatique et l’expression
hépatique de Dyrk1a, a été trouvée dans le laboratoire, chez un modèle de souris
hyperhomocystéinémique (Hamelet et al., 2009, Biochem Biophys Res Comm).
 D’autre part, une diminution du taux d’homocystéine a été observée chez des souris
transgéniques surexprimant Dyrk1a (Noll et al., 2009, PLoS One).
     L’ensemble de ces résultats montre l’existence d’interactions
     réciproques entre la protéine Dyrk1a et le métabolisme de
     l’homocystéine.
But du travail:
Etudier les effets de la surexpression hépatique de Dyrk1a (à l’aide d’un vecteur
adénoviral) sur les altérations du métabolisme hépatique de l’homocystéine chez
un modèle de souris hyperhomocystéinémique.
Matériels et
            Surexpression de Dyrk1a
                        méthodes                comme cible
                                   thérapeutique
Transfert du gène Dyrk1A in vivo via un vecteur adénoviral ciblant
spécifiquement les hépatocytes (en collaboration avec le Dr. B de Geest,
université catholique de Louvain).


                              Injection

         Souris CBS+/-
             Modèle
     d’hyperhomocystéinémie

                 Sacrifice après
                 une semaine de
                    l’injection           Dépôt de brevet: composés contenant un vecteur
                                          viral à spécificité hépatique et présentant une
                                          activité anti-inflammatoire » (27 juillet 2011 sous le
                                          numéro 11/56844)
Évaluation des altérations du métabolisme hépatique de l’homocystéine:
1. Dosage plasmatique de l’homocystéine (HPLC).
2. Dosage de l’activité des enzymes impliqués dans le cycle de l’homocystéine.
3. Analyse de l’expression plasmatique des protéines composantes des HDL et impliquées
   dans le transport inverse du cholestérol.
Résultats (1)
 La surexpression hépatique de Dyrk1a dans le modèle
d’hyperhomocystéinémie rétablit le taux d’homocystéine


                                Quantité de Dyrk1a                                                        Taux d’homocystéine
                                Dyrk1a hépatique                                                              plasmatique
         Slot
         blot
                                Ponceau                                                                                              *
                                                                                                          8
                                                                   **                                                **
Quantité de Dyrk1a hépatique




                                                                                    Taux d’homocystéine
 (% par rapport aux Cbs+/+ )




                                                                                     plasmatique (µM)
                               500                   *                                                    6
                               400

                               300                                                                        4

                               200                                                                        2
                               100
                                                                                                          0
                                 0                                                                             Cbs+/+
                                                                                                               WT         Cbs+/-
                                                                                                                           HT          Cbs+/-
                                                                                                                                      HT+AD
                                          Cbs+/+
                                           WT            Cbs+/-
                                                         HT          Cbs+/-
                                                                    HT+AD                                                            adénovirus
                                                                   adénovirus
                                                                                                              (n = 14)    (n = 11)       (n = 10)
                                          (n = 12)       (n = 7)    (n = 14)



                               La surexpression de Dyrk1a dans le foie des souris
                               hyperhomocystéinémique (Cbs+/-) induit une baisse du taux d’homocystéine
                               plasmatique.
Résultats (2)
                                         Le traitement à l’adénovirus rétablit le cycle de
                                                         l’homocystéine
                                          SAHH                                                                       NQO1




                                                                         Activité enzymatique (% par
                                                     **
Activité enzymatique (% par




                               160                                                               120                **
                                           *                                                                                    *




                                                                             rapport aux Cbs+/+ )
    rapport aux Cbs+/+ )




                               120
                                                                                                       80
                               80

                                                                                                       40
                               40


                                 0                                                                      0
                                      Cbs+/+
                                       WT         Cbs+/-
                                                  HT           Cbs+/-
                                                              HT+AD                                            Cbs+/+
                                                                                                               WT         Cbs+/-
                                                                                                                          HT          Cbs+/-
                                                                                                                                     HT+AD
                                                            adénovirus                                                              adénovirus
                                     (n = 20)    (n = 10)    (n = 13)                                         (n = 17)   (n = 18)    (n = 13)


                                                                                                                                                • SAHH: S-adénosyl homocystéine
                                                 CB                                                                                             • NQO1: NAD(P)H quinone
 Activité enzymatique (% par




                               160
                                                 S **                                                                                           oxydoréductase 1
                                                                                                                                                • CBS: Cystathionine β-synthase
     rapport aux Cbs+/+ )




                               120
                                                *
                                                                                                            Le traitement des souris (Cbs+/-) à l’adénovirus
                                80                                                                          tend à augmenter l’activité des enzymes
                                                                                                            hépatiques SAHH, NQO1 et CBS.
                                40


                                 0                                                                          Dyrk1a aurait un effet indirect sur l’activité
                                       Cbs+/+
                                       WT         Cbs+/-
                                                  HT           Cbs+/-
                                                              HT+AD
                                                            adénovirus                                      hépatique de la SAHH en passant par
                                     (n = 19)    (n = 14)     (n = 13)
                                                                                                            l’augmentation de l’expression de NQO1 (cascade
Résultats (3)
     Effet du traitement à l’adénovirus sur des marqueurs de la
                      dysfonction endothéliale

                                    PON-1 plasmatique
Activité enzymatique (% par




                                            **                                                                APO-A1
                              120                        **
    rapport aux Cbs+/+ )




                                                                                                   PON-1   HDL
                              80


                              40
                                                                                                 Ox
                               0
                                       Cbs+/+
                                       WT         Cbs+/-
                                                  HT            Cbs+/-
                                                               HT+AD             • PON-1: Paraoxonase-1 (associée aux HDL et
                                      (n = 20)   (n = 16)
                                                              adénovirus
                                                               (n= 20)
                                                                                 ayant pour rôle de prévenir l’oxydation des LDL)
                                                                                 • ApoA1: Apolipoprotéine A1 (associée aux
                                                                                 HDL)
                                    ApoA1 plasmatique
  Quantité protéique (% par




                              160
                                                                               La surexpression de Dyrk1a dans le foie des
    rapport aux Cbs+/+ )




                                                               *
                              120                *                             souris hyperhomocystéinémiques (Cbs+/-)
                                                                               induit une augmentation de l’activité de la
                               80
                                                                               PON-1 ainsi qu’une augmentation de la
                               40                                              quantité de ApoA1 dans le plasma.
                                0
                                       Cbs+/+
                                        WT           Cbs+/-
                                                      HT         HT+AD+/-
                                                                 Cbs           Ceci aura pour conséquence la diminution du
                                                               adénovirus
                                     (n = 17)    (n = 15)       (n= 13)
                                                                               taux de LDL oxydés: ce qui prévient
Conclusion

L’utilisation d’un vecteur adénoviral pour cibler la surexpression de Dyrk1a dans
le foie des souris hyperhomocystéinémiques a permis de rétablir le taux
d’homocystéine plasmatique .

Dyrk1a aurait un effet indirect sur l’activité hépatique de la SAHH en passant par
l’augmentation de l’expression de NQO1 (Noll et al., submitted 2011 « Dyrk1a activates
antioxidant NQO1 expression through an ERK1/2-Nrf2 dependent mechanism »).

La régulation du taux d’homocystéine plasmatique chez les souris
hyperhomocystéinémiques a un effet positif sur la stabilité et la maturation des
HDL: ce qui se traduit à long terme par un effet protecteur des vaisseaux contre la
mise en place d’une inflammation pouvant conduire à l’athérosclérose.
La surexpression de Dyrk1a dans le foie est une nouvelle
   approche thérapeutique visant à corriger les effets
  néfastes de l’hyperhomocystéinémie sur le système
                   cardiovasculaire.

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  • 1. 2011 Poster 7 Biochimie Biochemistry Contrôle de l’hyperhomocystéinémie par un adénovirus surexprimant DYRK1A Tlili A1, Jacobs F2, Mohamed S1, Paul JL3,4, Delabar JM1, De Geest B2, Janel N1 1 – Laboratory of gene Dysregulation and Differentiation, Univ Paris Diderot-CNRS EAC 4413, Unit of Functional and Adaptative Biology (BFA), Paris, France. 2 – Center for Molecular and Vascular Biology, Campus Gasthuisberg, Leuven, Belgique. 3 – HP, Hôpital Européen Georges Pompidou, Service de Biochimie, Paris, France. 4 – Université Paris-Sud, UMR 1154-INRA, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France.
  • 2. Introduction L’hyperhomocystéinémie (1) Définition: Maladie métabolique qui conduit à l’augmentation du taux plasmatique de l’homocystéine. Il existe 3 formes: Forme Homocystéine (µM) Modérée 15-30 Intermédiaire 30-100 Sévère >100 Les causes:  Facteurs génétiques (déficit en MTHFR, CBS, MS…)  Mode de vie (alimentation, alcool, tabac…)  Médicaments (antiépileptiques, hypolipidémiants)  Maladies (troubles gastrointestinaux, troubles rénaux, diabète, maladies Cycle de neurodégénératives) l’homocystéine Les conséquences: Altération du métabolisme hépatique des facteur de risque des L’hyperhomocystéinémie est un maladies cardiovasculaires. lipides
  • 3. Introduction Dyrk1a , Trisomie (2) 21 et hyperhomocystéinémie Dyrk1a (Dual-specificity tyrosine (Y) Regulated Kinase 1a) est une sérine-thréonine kinase dont le gène codant est situé sur le chromosome 21 humain. Cette protéine est donc surexprimée chez les personnes atteintes du Syndrome de Down (trisomie 21). Hyperhomocystéinémie Trisomie 21 Homocystéine plasmatique ++ - Expression hépatique de Dyrk1a - ++ Incidence des maladies cardiovasculaires  Une corrélation négative entre le taux d’homocystéine plasmatique et l’expression hépatique de Dyrk1a, a été trouvée dans le laboratoire, chez un modèle de souris hyperhomocystéinémique (Hamelet et al., 2009, Biochem Biophys Res Comm).  D’autre part, une diminution du taux d’homocystéine a été observée chez des souris transgéniques surexprimant Dyrk1a (Noll et al., 2009, PLoS One). L’ensemble de ces résultats montre l’existence d’interactions réciproques entre la protéine Dyrk1a et le métabolisme de l’homocystéine. But du travail: Etudier les effets de la surexpression hépatique de Dyrk1a (à l’aide d’un vecteur adénoviral) sur les altérations du métabolisme hépatique de l’homocystéine chez un modèle de souris hyperhomocystéinémique.
  • 4. Matériels et Surexpression de Dyrk1a méthodes comme cible thérapeutique Transfert du gène Dyrk1A in vivo via un vecteur adénoviral ciblant spécifiquement les hépatocytes (en collaboration avec le Dr. B de Geest, université catholique de Louvain). Injection Souris CBS+/- Modèle d’hyperhomocystéinémie Sacrifice après une semaine de l’injection Dépôt de brevet: composés contenant un vecteur viral à spécificité hépatique et présentant une activité anti-inflammatoire » (27 juillet 2011 sous le numéro 11/56844) Évaluation des altérations du métabolisme hépatique de l’homocystéine: 1. Dosage plasmatique de l’homocystéine (HPLC). 2. Dosage de l’activité des enzymes impliqués dans le cycle de l’homocystéine. 3. Analyse de l’expression plasmatique des protéines composantes des HDL et impliquées dans le transport inverse du cholestérol.
  • 5. Résultats (1) La surexpression hépatique de Dyrk1a dans le modèle d’hyperhomocystéinémie rétablit le taux d’homocystéine Quantité de Dyrk1a Taux d’homocystéine Dyrk1a hépatique plasmatique Slot blot Ponceau * 8 ** ** Quantité de Dyrk1a hépatique Taux d’homocystéine (% par rapport aux Cbs+/+ ) plasmatique (µM) 500 * 6 400 300 4 200 2 100 0 0 Cbs+/+ WT Cbs+/- HT Cbs+/- HT+AD Cbs+/+ WT Cbs+/- HT Cbs+/- HT+AD adénovirus adénovirus (n = 14) (n = 11) (n = 10) (n = 12) (n = 7) (n = 14) La surexpression de Dyrk1a dans le foie des souris hyperhomocystéinémique (Cbs+/-) induit une baisse du taux d’homocystéine plasmatique.
  • 6. Résultats (2) Le traitement à l’adénovirus rétablit le cycle de l’homocystéine SAHH NQO1 Activité enzymatique (% par ** Activité enzymatique (% par 160 120 ** * * rapport aux Cbs+/+ ) rapport aux Cbs+/+ ) 120 80 80 40 40 0 0 Cbs+/+ WT Cbs+/- HT Cbs+/- HT+AD Cbs+/+ WT Cbs+/- HT Cbs+/- HT+AD adénovirus adénovirus (n = 20) (n = 10) (n = 13) (n = 17) (n = 18) (n = 13) • SAHH: S-adénosyl homocystéine CB • NQO1: NAD(P)H quinone Activité enzymatique (% par 160 S ** oxydoréductase 1 • CBS: Cystathionine β-synthase rapport aux Cbs+/+ ) 120 * Le traitement des souris (Cbs+/-) à l’adénovirus 80 tend à augmenter l’activité des enzymes hépatiques SAHH, NQO1 et CBS. 40 0 Dyrk1a aurait un effet indirect sur l’activité Cbs+/+ WT Cbs+/- HT Cbs+/- HT+AD adénovirus hépatique de la SAHH en passant par (n = 19) (n = 14) (n = 13) l’augmentation de l’expression de NQO1 (cascade
  • 7. Résultats (3) Effet du traitement à l’adénovirus sur des marqueurs de la dysfonction endothéliale PON-1 plasmatique Activité enzymatique (% par ** APO-A1 120 ** rapport aux Cbs+/+ ) PON-1 HDL 80 40 Ox 0 Cbs+/+ WT Cbs+/- HT Cbs+/- HT+AD • PON-1: Paraoxonase-1 (associée aux HDL et (n = 20) (n = 16) adénovirus (n= 20) ayant pour rôle de prévenir l’oxydation des LDL) • ApoA1: Apolipoprotéine A1 (associée aux HDL) ApoA1 plasmatique Quantité protéique (% par 160 La surexpression de Dyrk1a dans le foie des rapport aux Cbs+/+ ) * 120 * souris hyperhomocystéinémiques (Cbs+/-) induit une augmentation de l’activité de la 80 PON-1 ainsi qu’une augmentation de la 40 quantité de ApoA1 dans le plasma. 0 Cbs+/+ WT Cbs+/- HT HT+AD+/- Cbs Ceci aura pour conséquence la diminution du adénovirus (n = 17) (n = 15) (n= 13) taux de LDL oxydés: ce qui prévient
  • 8. Conclusion L’utilisation d’un vecteur adénoviral pour cibler la surexpression de Dyrk1a dans le foie des souris hyperhomocystéinémiques a permis de rétablir le taux d’homocystéine plasmatique . Dyrk1a aurait un effet indirect sur l’activité hépatique de la SAHH en passant par l’augmentation de l’expression de NQO1 (Noll et al., submitted 2011 « Dyrk1a activates antioxidant NQO1 expression through an ERK1/2-Nrf2 dependent mechanism »). La régulation du taux d’homocystéine plasmatique chez les souris hyperhomocystéinémiques a un effet positif sur la stabilité et la maturation des HDL: ce qui se traduit à long terme par un effet protecteur des vaisseaux contre la mise en place d’une inflammation pouvant conduire à l’athérosclérose. La surexpression de Dyrk1a dans le foie est une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les effets néfastes de l’hyperhomocystéinémie sur le système cardiovasculaire.