Conception et  caractérisation  d’un vaccin antitumoral à base de  liposomes : Application à la vaccination contre le canc...
1) Le cancer du poumon <ul><li>Cancer très fréquent: 30 000 nouveaux cas/an en France </li></ul><ul><li>1 e  cause de décè...
Forte  toxicité  des traitements Risque de  rechute  important Risque de  métastases  important Faible survie  des patient...
2) Nouvelle stratégie: la vaccination antitumorale <ul><li>Les  cellules tumorales  peuvent exprimer à leur surface des  T...
3) Réponse immunitaire antitumorale I- Introduction  4 <ul><li>- fragments cellulaires </li></ul><ul><li>corps apoptotique...
4) La vaccination antitumorale - Mimer - Amplifier I- Introduction  Vaccin liposomal <ul><li>Peptide Tc </li></ul><ul><li>...
5) Constructions vaccinales <ul><li>Epitope Tc  : Peptide d’intérêt  VLLQAGSLHA </li></ul><ul><ul><li>Surexprimé 100-200x ...
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5) Les liposomes <ul><li>Utilisation comme vecteur : </li></ul><ul><li>Encapsulation de molécules hydrophiles </li></ul><u...
6) Association aux liposomes <ul><li>Insertion dans la bicouche : molécules amphiphiles </li></ul>I- Introduction  DOGP 4 ...
5) Association aux liposomes Addition de Mickaël à pH6,5 Peptide modifié : <ul><li>Liaison covalente : peptide en présence...
Ancre DPG-Mal Pam 2 CAG DOGP 4 KMan 2 Peptide CVL Peptide HA PC/PG/Chol Mise au point Caractérisation des formulations 6) ...
PC, PG, Chol Man, Pam, DPG-Mal MLV 400-500nm Hydratation Evap. SUV <100nm Ultrasons Peptide ≠  eq/ancre Formulation vaccin...
<ul><li>Dosage du peptide CVL seul  </li></ul><ul><ul><li>Choix d’une technique de dosage </li></ul></ul><ul><li>2)  Carac...
1) Dosage du peptide seul III- Résultats - Dosage au BCA  : trop d’absorbance des liposomes blancs - Dosage au TNBS  : vol...
2) Dosage du peptide sur les liposomes Droite dans la gamme de concentration qui nous intéresse Pas d’interférence par les...
2.a) Formulations avec le peptide CVL Tampon Hepes 10mM-NaCl 145mM III- Résultats 16 Nbre de formula-tions Diamètre moyen ...
2.b) Formulations contenant le peptide HA Congélation : Pas d’incidence sur diamètre et distribution des liposomes 17 Nbre...
Conclusion et perspectives Evaluation de l’efficacité des constructions vaccinales par mesure de production du TNFβ par de...
Remerciements <ul><li>Dr. Béatrice HEURTAULT </li></ul><ul><li>Dr. Benoît FRISCH </li></ul><ul><li>Dr. Line BOUREL </li></...
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  • Mortalité en constante augmentation, surtout chez la femme Étoposide: inhib topo 2 Cisplatine: agent alkylant Gemcitabine: antimétabolite de la phase S
  • TAA: tumor associated antigens MAGE= melanoma associated gene p53= gène suppresseur de tumeur muté ds bcp de cancers
  • IGR-Heu proviennent d’un cancer du poumon réséqué il y a 12 ans
  • IGR-Heu proviennent d’un cancer du poumon réséqué il y a 12 ans
  • Coating: PEG ou chitosan
  • Coating: PEG ou chitosan
  • Pam 2 CAG: adjuvant, ligand des TLR DOGP 4 KMan 2 : agent de ciblage des cellules dendritiques Peptide HA: Peptide issu de l’hémagglutinine du virus de la grippe, induit une réponse immunitaire Th Peptide CVL: Peptide d’intérêt, induit une réponse immunitaire Tc
  • Soutenance De ThèSe

    1. 1. Conception et caractérisation d’un vaccin antitumoral à base de liposomes : Application à la vaccination contre le cancer du poumon Présenté par Gabrielle HEINIMANN Le 11 juillet 2011 Jury: Line BOUREL, Présidente Béatrice HEURTAULT, Directrice de thèse Benoît FRISCH, Membre extérieur Equipe de Biovectorologie UMR 7199
    2. 2. 1) Le cancer du poumon <ul><li>Cancer très fréquent: 30 000 nouveaux cas/an en France </li></ul><ul><li>1 e cause de décès par cancer </li></ul><ul><li>3 e cause de décès par cancer </li></ul>I- Introduction bibliographique <ul><li>Différents types de traitement: </li></ul><ul><li>Chimiothérapie (étoposide, cisplatine, gemcitabine) </li></ul><ul><li>Radiothérapie </li></ul><ul><li>Chirurgie si tumeur localisée </li></ul>1
    3. 3. Forte toxicité des traitements Risque de rechute important Risque de métastases important Faible survie des patients Problème de santé publique qui nécessite de nouvelles perspectives de traitements Le cancer du poumon (2) I- Introduction 2
    4. 4. 2) Nouvelle stratégie: la vaccination antitumorale <ul><li>Les cellules tumorales peuvent exprimer à leur surface des TAA </li></ul><ul><li>(Tumor Associated Antigen): </li></ul><ul><li>Ag spécifiques des tumeurs </li></ul><ul><li>Ag surexprimés par les cellules cancéreuses </li></ul><ul><li>… </li></ul><ul><li>Anticorps dirigés contre certains TAA </li></ul><ul><li>Mécanisme de défense naturel contre les cellules tumorales: </li></ul><ul><li>le système immunitaire. </li></ul>I- Introduction 3
    5. 5. 3) Réponse immunitaire antitumorale I- Introduction 4 <ul><li>- fragments cellulaires </li></ul><ul><li>corps apoptotiques </li></ul><ul><li>(de cellules tumorales) </li></ul>Cytokines CD4 Lymphocytes T auxilliaires (helper) IFN-  TLR adjuvants -> maturation R Man : Récepteur du mannose R Man TLR : Toll-like Receptor MHC-I MHC-II Epitope Tc (peptide) Epitope Th (peptide) CD8 Cellule tumorale processing cellule présentatrice de l’antigène Lymphocytes T cytotoxiques Activation Prolifération Différenciation Cellule tumorale Destruction Cellulaire
    6. 6. 4) La vaccination antitumorale - Mimer - Amplifier I- Introduction Vaccin liposomal <ul><li>Peptide Tc </li></ul><ul><li>Peptide Th </li></ul><ul><li>Adjuvant </li></ul><ul><li>Agent de ciblage </li></ul>5
    7. 7. 5) Constructions vaccinales <ul><li>Epitope Tc : Peptide d’intérêt VLLQAGSLHA </li></ul><ul><ul><li>Surexprimé 100-200x </li></ul></ul><ul><ul><li>Faible immunogénicité </li></ul></ul><ul><li>Epitope Th : Peptide HA PKYVKQNTLKLATC </li></ul><ul><li>Adjuvant ligand des TLR: Pam 2 CAG </li></ul><ul><li>Molécule de ciblage des CD : dérivé mannosylé DOGP 4 KMan 2 </li></ul>I- Introduction EL HAGE F., STROOBANT V., MAMI-CHOUAIB F. Preprocalcitonin signal peptide generates a cytotoxic T lymphocyte-defined tumor epitope processed by a proteasome-independent pathway, PNAS vol 105, No. 29 (juillet 2008) 10119-10124 6
    8. 8. <ul><li>Epitope Tc : Peptide d’intérêt VLLQAGSLHA </li></ul><ul><ul><li>Surexprimé 100-200x </li></ul></ul><ul><ul><li>Faible immunogenicite </li></ul></ul><ul><li>Epitope Th : Peptide HA PKYVKQNTLKLATC </li></ul><ul><li>Adjuvant ligand des TLR: Pam 2 CAG </li></ul><ul><li>Molécule de ciblage des CD : dérivé mannosylé DOGP 4 KMan 2 </li></ul>I- Introduction <ul><ul><li>Nécessité d’un vecteur : le liposome </li></ul></ul>7 5) Constructions vaccinales
    9. 9. 5) Les liposomes <ul><li>Utilisation comme vecteur : </li></ul><ul><li>Encapsulation de molécules hydrophiles </li></ul><ul><li>Présentation de molécules en surface </li></ul>- Petites vésicules sphériques - 1 ou plusieurs bicouches phospholipidiques (PC, PG, Chol) I- Introduction 8
    10. 10. 6) Association aux liposomes <ul><li>Insertion dans la bicouche : molécules amphiphiles </li></ul>I- Introduction DOGP 4 KMan 2 Agent de ciblage Pam 2 CAG Adjuvant 9
    11. 11. 5) Association aux liposomes Addition de Mickaël à pH6,5 Peptide modifié : <ul><li>Liaison covalente : peptide en présence d’ancre DPG-Maléimide </li></ul>I- Introduction 10 Ancre C VLLQAGSLHA VLLQAGSLHA Peptide CVL
    12. 12. Ancre DPG-Mal Pam 2 CAG DOGP 4 KMan 2 Peptide CVL Peptide HA PC/PG/Chol Mise au point Caractérisation des formulations 6) Construction vaccinale I- Introduction 11
    13. 13. PC, PG, Chol Man, Pam, DPG-Mal MLV 400-500nm Hydratation Evap. SUV <100nm Ultrasons Peptide ≠ eq/ancre Formulation vaccinale Dialyse - Préparation des liposomes: Hydratation de film lipidique - Couplage peptidique II- Matériel et méthodes Film lipidique 12 Tampon Chloroforme/méthanol (9/1)
    14. 14. <ul><li>Dosage du peptide CVL seul </li></ul><ul><ul><li>Choix d’une technique de dosage </li></ul></ul><ul><li>2) Caractérisation des liposomes: </li></ul><ul><ul><li>Determination du diamètre moyen des liposomes </li></ul></ul><ul><li> Diffusion quasi-élastique de la lumière </li></ul><ul><li>Homogénéité </li></ul><ul><li>60 <Taille < 90nm </li></ul><ul><ul><li>Concentration en phospholipides </li></ul></ul><ul><ul><li>Concentration en peptide </li></ul></ul><ul><li>Taux de fixation, efficacité du couplage </li></ul>I- Matériel et méthodes Problématique: doser le peptide et caractériser les formulations 13
    15. 15. 1) Dosage du peptide seul III- Résultats - Dosage au BCA : trop d’absorbance des liposomes blancs - Dosage au TNBS : volume de formulation nécessaire trop important - Dosage à la fluorescamine Droite dans une gamme de concentration qui nous intéresse Fluorescamine 14
    16. 16. 2) Dosage du peptide sur les liposomes Droite dans la gamme de concentration qui nous intéresse Pas d’interférence par les LB Dosage à la fluorescamine du peptide CVL couplé aux liposomes est utilisable III- Résultats 15
    17. 17. 2.a) Formulations avec le peptide CVL Tampon Hepes 10mM-NaCl 145mM III- Résultats 16 Nbre de formula-tions Diamètre moyen en nm PDI (indice de polydispersité) [CVL] moyenne en µmol/mL % Couplage CVL LB n=9 76 ± 24 0,261 / / Lp- CVL 1eq n=1 67 ± 23 0,234 0,115 49 Lp- CVL 2eq n=4 80 ± 21 0,214 0,229 93 Lp- man - CVL n=1 74 ±20 0,263 0,315 Quantitatif Lp- pam - CVL n=1 63 ± 12 0,296 0,28 Quantitatif Lp- pam - man - CVL n=1 84 ± 25 0,195 0,228 90
    18. 18. 2.b) Formulations contenant le peptide HA Congélation : Pas d’incidence sur diamètre et distribution des liposomes 17 Nbre de formula-tions Diamètre moyen en nm PDI [HA] moyenne en µmol/mL % couplage HA % couplage peptides Tampon Lp- HA 0,5eq n=1 Aggloméra-tion / / / / Hepes-NaCl Lp- HA 0,5eq n=2 69 ± 19 0,267 0,08 66 / Hepes-Sorbitol Lp- CVL - HA n=3 70 ± 25 0,215 / / 94 Hepes-Sorbitol
    19. 19. Conclusion et perspectives Evaluation de l’efficacité des constructions vaccinales par mesure de production du TNFβ par des LT après incubation, avec des CD <ul><li>Méthode de dosage du peptide d’intérêt </li></ul><ul><li>Formulation des constructions associant : </li></ul><ul><ul><ul><li>Peptide CVL </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Peptide HA </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Adjuvants et agents de ciblage </li></ul></ul></ul><ul><li>Caractérisation physicochimique répondant au cahier des charges </li></ul><ul><li>Formulations ont été transmises à l’Institut Gustave Roussy </li></ul>Etudes in vitro en cours: 18
    20. 20. Remerciements <ul><li>Dr. Béatrice HEURTAULT </li></ul><ul><li>Dr. Benoît FRISCH </li></ul><ul><li>Dr. Line BOUREL </li></ul><ul><li>Les membres du laboratoire de Biovectorologie: </li></ul><ul><li>Philippe GENTINE </li></ul><ul><li>Christophe EHRET </li></ul><ul><li>Patricia TIRADO </li></ul><ul><li>Merci à ma famille et à mes amis pour leur soutien </li></ul>
    21. 21. Merci pour votre attention
    22. 22. Serment de Galien

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