Soutenance Thèse Final

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Soutenance Thèse Final

  1. 1. Dépollution d’effluents gazeux halogénés par des micro-organismes déshydratés en réacteur solide/gaz: Etude de la stabilité du biocatalyseur Pierre Marchand Sous la direction du Pr. M-D Legoy et du Dr. I. Goubet
  2. 2. Agence De l’Environnement et de la Maîtrise de l’Energie Région Poitou-Charentes
  3. 3. Introduction Problématique Résultats Conclusions Perspectives
  4. 4. Introduction Les Composés Organiques Volatils (COV) Traitements et intérêt de la catalyse solide/gaz <ul><li>Définition et caractéristiques </li></ul><ul><li>Réglementation </li></ul><ul><li>Sources </li></ul>
  5. 5. Les COV Définition et caractéristiques Introduction <ul><li>Composés de carbone et d’hydrogène </li></ul><ul><li>Hydrogène peut être substitué par un atome d’oxygène, d’azote, de soufre, d’halogène (chlore, brome ou fluor) </li></ul><ul><li>Ces composés ont une pression de vapeur > 0,01kPa à 293°K </li></ul>
  6. 6. Les COV Effets sur la santé et l’environnement Introduction <ul><li>Effets sur la santé : </li></ul><ul><li>Irritations, troubles cardiaques, digestifs, rénaux, du système nerveux </li></ul><ul><li>Certains sont Cancérigènes, Mutagènes, Reprotoxiques ( CMR ) </li></ul><ul><li>Tous les COV halogénés : phrase de risque R40 (possibles effets irréversibles pour la santé) </li></ul><ul><li>Effets sur l’environnement : </li></ul><ul><li>Impliqués dans l’augmentation de l’effet de serre (O 3 dans la troposphère) </li></ul><ul><li>Toxiques pour les végétaux et l’environnement aquatique </li></ul>
  7. 7. Introduction Les COV Textes Européens et Internationaux 1050 Plafond imposé pour la France en 2010 Émissions annuelles de COV (kt/an) 1972 - Conférence de Stockholm 1979 - Conférence de Genève 1992 - Conférence de Rio Fixer des objectifs de limitation des rejets : Directive 2001/81/CE
  8. 8. Procédés industriels Introduction Les sources de COV halogénés Les COV Sources COV utilisés Dégraissage Perchloroéthylène (PCE) Dichlorométhane (DCM) Tétrachloroéthylène (TCE) Nettoyage de textiles PCE Diluants de colles DCM/TCE Solvants de peinture Chlorobenzène Chimie/ pharmacie mono/multihalogénés Chlorés/bromés Plusieurs halogènes Aliphatiques Chlorés
  9. 9. Introduction Les Composés Organiques Volatils (COV) Traitements et intérêt de la catalyse solide/gaz <ul><li>Définition et caractéristiques </li></ul><ul><li>Réglementation </li></ul><ul><li>Sources </li></ul>
  10. 10. <ul><li>Du type de COV et ses caractéristiques physicochimiques </li></ul><ul><li>Du débit et concentration de l’effluent </li></ul><ul><li>De l’ humidité relative de l’air </li></ul><ul><li>De la présence d’autres molécules et/ou de poussières </li></ul>… dépend : Introduction Les Traitements Le choix de la méthode…
  11. 11. Traitements COV Destruction Récupération Introduction Les Traitements Les grandes familles <ul><li>Convertir en CO 2 /H 2 O </li></ul><ul><li>Séparer le COV de l’effluent </li></ul><ul><li>Concentrer </li></ul><ul><li>Recycler </li></ul>
  12. 12. 100 100 1 000 10 000 100 000 0,1 1 10 Adsorption Oxydation thermique et catalytique Débit Nm 3 .h -1 Concentration g.Nm -3 10 Introduction Les Traitements Traitement des COV halogénés (industrie)
  13. 13. 100 100 1 000 10 000 100 000 0,1 1 10 Adsorption Oxydation thermique et catalytique Débit Nm 3 .h -1 Concentration g.Nm -3 10 Introduction Relativement onéreux (régénérer l’adsorbat) Rentable si récupération et réutilisation du solvant Hydrolyse des COV halogénés Les Traitements Traitement des COV halogénés (industrie)
  14. 14. 100 100 1 000 10 000 100 000 0,1 1 10 Oxydation thermique et catalytique Débit Nm 3 .h -1 Concentration g.Nm -3 10 Introduction Les Traitements Traitement des COV halogénés (industrie) Besoin de procédés complémentaires pour éliminer l’halogène
  15. 15. Alcool Gazeux Biocatalyseur (Cellules entières déshydratées) Solide COV halogéné Gazeux Introduction La catalyse solide/gaz Nouvelle génération de biofiltre (solide/gaz) <ul><li>Polluant dégradé directement sous forme gazeuse </li></ul><ul><li>Procédé continu </li></ul><ul><li>Pas de problème de toxicité (à prouver) </li></ul>
  16. 16. PRESSION TEMPERATURE CPG Introduction La catalyse solide/gaz Le réacteur solide/gaz Formation du gaz pollué Dégradation du gaz pollué Analyse COV EAU (Lamare & Legoy 1993) Activité thermodynamique correspond à la disponibilité d’une molécule pour le catalyseur a x = Pp x Psat x … pour l’eau a w
  17. 17. Introduction Problématique Résultats Conclusions Perspectives
  18. 18. Problématique Stratégie <ul><li>Réaction modèle (substrat/bactérie) </li></ul><ul><li>Conditions (préparation/réaction) </li></ul>Travaux antérieurs Objectifs
  19. 19. Problématique Travaux antérieurs Etude de faisabilité (B. Erable 2002 à 2005)  Rhodococcus erythropolis NCIMB 13064 ( DhaA )  Xanthobacter autotrophicus GJ10 ( DhlA )  Escherichia coli recombinant ( DhaA ou DhlA ) + H 2 O R-OH + H-X halidohydrolase R-X Déhalogénases et souches étudiées Cellules déshydratées ( )
  20. 20. Etude de faisabilité (B. Erable 2002 à 2005) Travaux antérieurs <ul><li>Bactéries déshydratées actives en réacteur solide/gaz </li></ul><ul><li>« Screening » sur de nombreux substrats (mono et multichlorés, bromés) </li></ul><ul><li>Etude de l’effet de différents paramètres physicochimiques (Température/activité thermodynamique de l’eau (a w )/pH) </li></ul>Problématique <ul><li>Problème : biocatalyseur instable </li></ul>
  21. 21. Etude de faisabilité (B. Erable 2002 à 2005) Travaux antérieurs Problématique <ul><li>Problème : biocatalyseur instable </li></ul>Expliquée par l’effet de l’hydrohalogène
  22. 22. Stratégie <ul><li>Réaction modèle (substrat/bactérie) </li></ul><ul><li>Conditions (préparation/réaction) </li></ul>Travaux antérieurs Objectifs Problématique
  23. 23. Objectifs Travaux antérieurs Problématique Déterminer et quantifier les phénomènes responsables de la perte de vitesse catalytique Améliorer la stabilité (plusieurs semaines) Proposer un procédé respectueux de l’environnement
  24. 24. Stratégie <ul><li>Réaction modèle (substrat/bactérie) </li></ul><ul><li>Conditions (préparation/réaction) </li></ul>Travaux antérieurs Objectifs Problématique
  25. 25. Cl + H 2 O OH + HCl 1-chlorobutane 1-butanol La réaction modèle Stratégie Problématique E. coli BL21 DE3 DhaA
  26. 26. Cl + H 2 O OH + HCl 1-chlorobutane 1-butanol La réaction modèle Bien décrite Stratégie Problématique E. coli BL21 DE3 DhaA Facile à cultiver (milieu riche) Production Inductible par l’IPTG
  27. 27. Cl + H 2 O OH + HCl 1-chlorobutane 1-butanol La réaction modèle Stratégie Problématique Substrat référence E. coli BL21 DE3 DhaA
  28. 28. Stratégie Problématique Conditions (préparation/réaction) Tampon Borate (pH 9,0) Culture Lavages Solution mère (SM) Cellules entières Dilution Tampon Borate (pH 9,0)
  29. 29. Conditions (préparation/réaction) Stratégie Problématique Tampon Borate (pH 9,0) 40°C a w 0,7 + 1-chlorobutane Congélation Tampon Borate (pH 9,0) Culture Lavages Solution mère (SM) Cellules entières Dilution Lyophilisation
  30. 30. Introduction Problématique Résultats Conclusions Perspectives
  31. 31. Résultats Paramètres responsables de la perte d’activité Etude du lyophilisat Effets des sels du tampon borate
  32. 32. Résultats (I) Hypothèses Paramètres responsables de la perte d’activité Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme Dénaturations liées au couple Température/a w Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH)
  33. 33. Inhibition par les substrat et produit organiques Cl + H 2 O OH + HCl Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I)
  34. 34. Inhibition par les substrat et produit organiques Cl + H 2 O OH + HCl Après 48 heures de réaction Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Eau (hydrophile) Décane (hydrophobe) Analyse CPG Pas d’accumulation sur le lyophilisat
  35. 35. Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme Dénaturations liées au couple Température/a w Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH) Hypothèses Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I)
  36. 36. Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Viabilité durant la préparation du biocatalyseur Viabilité en fonction du traitement Mortalité > 90% Viabilité en % 0 20 40 60 80 100 120 140 Après récolte Après lavages Congelées (-20°C) Lyophilisées
  37. 37. <ul><li>Pas de lien entre viabilité et activité </li></ul><ul><li>« réservoirs à enzymes » </li></ul>protéases Bactéries toujours actives Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Viabilité durant la réaction 0% bactéries revivifiables
  38. 38. Effet de l’ajout d’antiprotéases Pas d’activité protéolytique significative Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Activité relative en % 0 20 40 60 80 100 120 140 (-) antiprotéases (+) antiprotéases Cellules entières Cellules soniquées Extraits cellulaires 0 20 40 60 80 100 120 140 Activité après 2 heures en phase aqueuse + ou - antiprotéases 40°C; pH 9,0
  39. 39. Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme Dénaturations liées au couple Température/a w Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH) Hypothèses Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol
  40. 40. Effet du couple température/a w Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) 40°C a w 0,7 Mesure de l’activité résiduelle 40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane 0 heure 20 heures 50 heures 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Temps en minutes n(HCl) en µmol 50 heures t0 20 heures
  41. 41. Effet du couple température/a w Dénaturations irréversibles dues au couple Température/a w Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Conditions : 40°C et a w 0,7 Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat Temps d’incubation (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Activité résiduelle (%) 0 20 40 60 80 100 120
  42. 42. Dénaturations liées au couple Température/a w Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH) Hypothèses Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme
  43. 43. Devenir du HCl Cl + H 2 O OH HCl ? + Lyophilisat de E. coli DhaA Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) [ Cl - libre ]
  44. 44. Devenir du HCl La totalité du HCl est retenue sur le biocatalyseur Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Dosage du HCl sur le lyophilisat durant la réaction Calculée par intégration du 1-butanol Temps d’incubation (h) 0 10 20 30 40 50 60 [HCl] en µmol/g 0 500 1000 1500 2000 2500 Quantité totale d’HCl produit Quantité mesurée sur le lyophilisat
  45. 45. Devenir du HCl Cl + H 2 O Gazeux OH Gazeux HCl sorbé pH Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I)
  46. 46. Effet du HCl Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) 40°C a w 0,7 Mesure de l’activité résiduelle 40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane 0 heure 20 heures 50 heures 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Temps en minutes n(HCl) en µmol 50 heures t0 20 heures
  47. 47. Effet du HCl Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) 40°C a w 0,7 + 1-chlorobutane Mesure de l’activité résiduelle 40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane 0 heure 20 heures 50 heures 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Temps en minutes n(HCl) en µmol 50 heures t0 20 heures
  48. 48. 40°C a w 0,7 Effet du HCl Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) + 1-chlorobutane Mesure de l’activité résiduelle 40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane 0 heure 20 heures 50 heures 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Temps en minutes n(HCl) en µmol 50 heures t0 20 heures
  49. 49. Effet du HCl (séparation) Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) (i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi) Mesure d’activité résiduelle
  50. 50. Effet du HCl Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat 40°C/a w 0,7 avec 1-chlorobutane Temps d’incubation (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Activité résiduelle (%) 0 20 40 60 80 100 120
  51. 51. Effet du HCl 40°C/a w 0,7 40°C/a w 0,7 avec 1-chlorobutane Inactivation par le HCl : réversible ? Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat Temps d’incubation (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 Activité résiduelle (%)
  52. 52. Effet du HCl Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) (a) Activité résiduelle (b) Activité en phase gaz
  53. 53. Conclusion (Résultats I) Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) <ul><li>Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol </li></ul><ul><li>Lien entre viabilité et activité des bactéries </li></ul><ul><li>Dénaturations thermiques à 40°C/a w 0,7 </li></ul><ul><li>Inactivation par accumulation du HCl </li></ul>55% 45% Aucun Aucun Irréversible Réversible Effet Hypothèses Quantification
  54. 54. Pourquoi conserve-t-on une partie de l’activité? Hypothèse : 2 environnements pour les DhaA Paramètres responsables de la perte d’activité Résultats (I) Enzymes dénaturées Enzymes protégées 40°C et a w 0,7 Temps (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Activité résiduelle (%) 0 20 40 60 80 100 120
  55. 55. Résultats Paramètres responsables de la perte d’activité Etude du lyophilisat Effets des sels de tampon borate
  56. 56. Observation au MEB Etude du lyophilisat Résultats (II) Photo MEB : bactéries après lyophilisation La structure des bactéries semble conservée après lyophilisation
  57. 57. Observation au MEB Etude du lyophilisat Résultats (II) Tampon borate après lyophilisation X 1500 Sels du tampon borate = Support des bactéries Bactéries + tampon après lyophilisation X 1500 Y a-t-il des échanges au travers des enveloppes bactériennes ? 50 % du lyophilisat est composé de sels
  58. 58. Localisation de l’activité déhalogénase Etude du lyophilisat Une partie des enzymes n’est pas fortement maintenue à l’intérieur des bactéries Résultats (II) Activité spécifique (%) 0 20 40 60 80 100 120 140 Cellules après récolte Cellules congelées (-20°C) Cellules lyophilisées Culot Surnageant Mesure de l’activité en milieu aqueux après différents traitements
  59. 59. Résultats (II) Réhydratation durant la réaction Etude du lyophilisat Echanges probables au travers de l’enveloppe bactérienne Réhydratation du lyophilisat durant la réaction (40°C/a w 0,7) Après 4h de catalyse Avant catalyse Après 100h de catalyse Après 16h de catalyse
  60. 60. Etude du lyophilisat Conclusion <ul><li>Matrice cellulaire </li></ul><ul><li>Sels de tampon borate </li></ul>Quel environnement favorise la stabilité à 40°C et a w 0,7 ? Deux environnements sont possibles pour les DhaA Résultats (II)
  61. 61. Etude du lyophilisat Effet « thermostabilisateur » des sels Quel environnement favorise la stabilité à 40°C et a w 0,7 ? Résultats (II) En solution aqueuse ou en milieu non-conventionnel (disponibilité en eau restreinte) Anderson & Hahn-Hagerdal 1987 Combes et al., 1989 et 2003 Triantafillou et al., 1997 Lindsay et al., 2004 Yu et al., 2005 En réacteur solide/gaz Sels de tampon phosphate (ADH de Thermoanaerobacter) Trivedi et al., 2006
  62. 62. Etude du lyophilisat Première approche Lavages Cellules entières Solution mère (SM) Dilution Culture Résultats (II) Traitement aux ultrasons Cellules soniquées Dilution
  63. 63. Observation du lyophilisat de cellules soniquées (a) X3000 (b) X800 Augmentation de la proportion d’enzymes directement en contact avec les sels de tampon borate Résultats (II) Etude du lyophilisat 75% de lyse après sonication Cellules soniquées
  64. 64. Effet de la sonication et de la quantité de sels Résultats (II) Etude du lyophilisat 50% de sels de tampon 70% de sels de tampon
  65. 65. Effet de la sonication et de la quantité de sels La sonication et l’augmentation de sels semblent stabiliser l’activité Résultats (II) Etude du lyophilisat 40°C/a w 0,7 50% de sels de tampon 70% de sels de tampon
  66. 66. Effet de la sonication et de la quantité de sels Résultats (II) Etude du lyophilisat 40°C/a w 0,7 50% de sels de tampon 70% de sels de tampon ?
  67. 67. Effet de la sonication et de la quantité de sels Réelle amélioration de la stabilité liée à l’augmentation de la proportion de DhaA au contact des sels de tampon borate Résultats (II) Etude du lyophilisat 40°C/a w 0,7 50% de sels de tampon 70% de sels de tampon La totalité recondense = =
  68. 68. Résultats Paramètres responsables de la perte d’activité Etude du lyophilisat Effet des sels de tampon borate
  69. 69. Effets des sels Vis-à-vis des dénaturations thermiques Vis-à-vis du HCl Effet de la proportion de sels Résultats (III) Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure Lyophilisats d’extraits cellulaires
  70. 70. Lyophilisats d’extraits cellulaires Lyophilisat d’extraits cellulaires Lavages Solution mère (SM) Dilution Cellules soniquées Culture Dilution Résultats (III) Traitement aux ultrasons Cellules entières Extrait cellulaire 17000 g 30 minutes 4°C Surnageant
  71. 71. Lyophilisats d’extraits cellulaires Lyophilisat d’extraits cellulaires Résultats (III) DhaA directement au contact des sels de tampon borate Elimination des enveloppes bactériennes et des cellules entières Extrait cellulaire
  72. 72. Effets des sels Vis-à-vis des dénaturations thermiques Vis-à-vis du HCl Effet de la proportion de sels Résultats (III) Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure Lyophilisats d’extraits cellulaires
  73. 73. Lyophilisats d’extraits cellulaires Stabilité thermique (cellules/extraits) Résultats (III) a w 0,7 Activité résiduelle après 150 heures à 40°C Réhydratation ? Aucune perte d’activité Cellules entières Extraits cellulaires Activité résiduelle (%) 0 20 40 60 80 100 120 140
  74. 74. Lyophilisats d’extraits cellulaires Résultats (III) Isotherme de sorption (cellules/extraits) La résistance du lyophilisat d’extrait cellulaire n’est pas liée à une réhydratation inférieure Réhydratation du lyophilisat durant la réaction à 40°C Extrait cellulaire Cellules entières a w 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Hydratation du lyophilisat % 0 10 20 30 40 50
  75. 75. Lyophilisats d’extraits cellulaires Résultats (III) <ul><li>Interactions sels-protéines </li></ul><ul><li>Modification de la disponibilité de l’eau autour de la protéine </li></ul>Effets des sels : protection contre les dénaturations thermiques Le mécanisme exact de l’effet « thermostabilisateur » des sels reste à élucider Explications en milieu non-conventionnel
  76. 76. Lyophilisats d’extraits cellulaires Résultats (III) Stabilité thermique (cellules/extraits) a w 0,65 Cellules entières Extraits cellulaires Activité résiduelle (%) 0 20 40 60 80 100 120 140 a w 0,7 Activité résiduelle après 150 heures à 40°C
  77. 77. Lyophilisats d’extraits cellulaires Stabilité thermique (cellules/extraits) Résultats (III) Limiter au maximum le risque de dénaturations thermiques Cellules entières Extraits cellulaires Activité résiduelle (%) 0 20 40 60 80 100 120 140 a w 0,65 Activité résiduelle après 150 heures à 40°C
  78. 78. Lyophilisats d’extraits cellulaires Effets des sels Vis-à-vis des dénaturations thermiques Vis-à-vis du HCl Effet de la proportion de sels Résultats (III) Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure
  79. 79. Effet des sels : en réacteur solide/gaz Résultats (III) Lyophilisats d’extraits cellulaires Activité déhalogénase en réacteur solide/gaz (40°C/a w 0,65) Temps (h) 0 20 40 60 80 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 50% de sels Activité spécifique (UI/g de protéines)
  80. 80. Lyophilisats d’extraits cellulaires Effets des sels Effet de la proportion des sels Résultats (III) Vis-à-vis des dénaturations thermiques Vis-à-vis du HCl Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure
  81. 81. Effet des sels : en réacteur solide/gaz Résultats (III) Lyophilisats d’extraits cellulaires Activité déhalogénase en réacteur solide/gaz (40°C/a w 0,65) Temps (h) 0 20 40 60 80 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 50% de sels 31% de sels 20% de sels 4% de sels Activité spécifique (UI/g de protéines)
  82. 82. Effet de la proportion de sels Résultats (III) Lyophilisats d’extraits cellulaires % de sels au sein du biofiltre 0 20 40 60 80 Activité résiduelle (%) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Sans 1-chlorobutane Activité résiduelle après 80 heures (40°C/a w 0,65)
  83. 83. Effet de la proportion de sels Résultats (III) Lyophilisats d’extraits cellulaires Activité résiduelle après 80 heures (40°C/a w 0,65) Une proportion de sels inférieure à 50% n’est pas suffisante pour neutraliser le HCl accumulé % de sels au sein du biofiltre 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Avec 1-chlorobutane Sans 1-chlorobutane Activité résiduelle (%)
  84. 84. Lyophilisats d’extraits cellulaires Effets des sels Effet de la proportion des sels Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure Résultats (III) Vis-à-vis des dénaturations thermiques Vis-à-vis du HCl
  85. 85. Effet de la proportion de sels Résultats (III) Lyophilisats d’extraits cellulaires Activité résiduelle après 80 heures (40°C/a w 0,65) % de sels au sein du biofiltre 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Avec 1-chlorobutane Sans 1-chlorobutane Activité résiduelle (%)
  86. 86. Expérience à une échelle supérieure Résultats (III) Les sels semblent tamponner le microenvironnement des DhaA jusqu’à saturation Lyophilisats d’extraits cellulaires Activité déhalogénase en réacteur solide/gaz (40°C/a w 0,65)
  87. 87. Introduction Problématique Résultats Conclusions Perspectives
  88. 88. Conclusions Lyophilisat de cellules entières Stabilité Cellules entières
  89. 89. Viabilité Substrat et produit organiques (1-chlorobutane et 1-butanol) Protéases bactériennes HCl produit Sels du tampon borate Eau Conclusions (+) Participe aux échanges Lyophilisats de cellules entières Stabilité Cellules entières Pas de sorption X Pas d’activité protéolytique X Contact direct avec les DhaA (+) « Réservoir à enzyme » X Sorption importante (20%) (-) 55% Sorption totale (-) 45%
  90. 90. Conclusions Lyophilisats d’ extraits cellulaires Stabilité Extraits cellulaires
  91. 91. Viabilité Protéases bactériennes HCl produit Sels du tampon borate Eau Conclusions Lyophilisats d’ extraits cellulaires Stabilité Extraits cellulaires Contact direct avec les DhaA (+) Sorption importante (20%) Sorption totale (+) X 150 heures (+) X Jusqu’à saturation Pas d’activité protéolytique X Pas de bactéries entières X
  92. 92. Introduction Problématique Résultats Conclusions Perspectives
  93. 93. Introduction Problématique Résultats Conclusions Perspectives
  94. 94. Perspectives Travailler sur des substrats communément utilisés en industrie (TCE/DCM/PCE) Développer l’effet des sels en catalyse solide/gaz Optimiser le système en vue d’une application <ul><li>Déterminer quelle est l’influence du ratio sels/enzyme </li></ul><ul><li>Tester d’autres sels (KCl, LiCl, NaCl) </li></ul><ul><li>Travailler avec des lyophilisats dépourvus totalement de sels </li></ul>Comprendre l’effet des sels pour optimiser l’activité et la stabilité du biocatalyseur Optimiser la géométrie du réacteur Régénérer le biocatalyseur <ul><li>Par évaporation (ne fonctionne pas car le HCl est neutralisé par les sels) </li></ul><ul><li>Dialyse (pas viable économiquement) </li></ul><ul><li>Trouver une autre méthode </li></ul>
  95. 95. Perspectives Développer l’effet des sels en catalyse solide/gaz Tester d’autres sels sur d’autres réactions avec des enzymes sensibles aux dénaturations thermiques Tester des enzymes d’intérêt sensibles à des a w élevées (ADH/Lipase pour des réactions d’hydrolyse) Effet des sels sur les dénaturations thermiques en réacteur solide/gaz Utiliser le réacteur solide/gaz comme outil pour extrapoler aux milieux non-conventionnels Développer l’étude de l’effet des sels en catalyse solide/gaz
  96. 96. Perspectives Développer l’effet des sels en catalyse solide/gaz Publications Marchand P., Lamare S., Legoy M.-D. and Goubet I. Dehalogenation of gaseous 1-chlorobutane by dehydrated whole cells: influence of the microenvironment of the halidohydrolase on the stability of the biocatalyst . Marchand P., Crémont M., Lamare S. and Goubet I. Dehalogenation of a gaseous effluent by dehydrated whole cells in a solid/gas reactor: Study of the catalyst’s stability Marchand P., Rosenfeld E., Lamare S., Maugard T., Erable B., Goubet I. Coupled oxidation–reduction of butanol–hexanal by resting Rhodococcus erythropolis NCIMB 13064 cells in liquid and gas phases ( Volume 43, Issue 6, 6 November 2008, Pages 423-430 )
  97. 97. Remerciement Le Pr Sylvain Lamare : Directeur du laboratoire LIENSs Le Pr Marie-Dominique Legoy : Directeur de thèse Les Pr Stéphane Vuilleumier et Didier Combes : Rapporteurs M me Anne Paillier et Dr Anne-Sophie Lepeuple : Examinatrices Dr Isabelle Goubet : Directeur Scientifique Et tous ceux qui ont participé à ce travail de près ou de loin Développer l’effet des sels en catalyse solide/gaz Remerciements

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