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SAFE-iPS: nœud 5 INGESTEM
CHU Montpellier: 750 millions €, 10000 personnes
Obtenir des iPS à usage thérapeutique à moyen et long terme
Disposer des cellules humaines avec toutes les conditions d’éthique
Bénéficier de l’infrastructure lourde du CHU d’assurance qualité et de maintenance


Comité de direction: B. Klein (PU-PH), J De Vos (PU-
PH), JM Lemaître (DR), R Desprat (DR), responsable
organisationnel: valide stratégie
scientifique, investissements, organisation, demande          Charte fonctionnement
prestation. réunion mensuelle
                                                              Contrat de prestation
Plateforme: R Desprat, responsable organisationnel,
L Pichard, AI INSERM, F Becker, Tech CHU, + 2
personnes
Institute of Research in Biotherapy
                                                           Director: Pr B. Klein

                                                       Beta Innov                         Horiba ABX
                                                       Immune molecules                   Rare cells




            INSERM-UM1 , 870 m2                                    Common facilities, 658 m2                      University hospital R&D, 1000 m2
            Multiple Myeloma Cell                                    Administrative & technical staff.
            Plasticity, Stem Cells and Niche. BK                     G Berthaud & M Frei                                Monitoring of Novel Therapeutics
                                                                                                                        Pr Klein, CHRU

             Early Embryonic Development. SH                         Common platforms: TL3,
                                                                                                                        Region Clinical proteomic
                                                                     cryogeny, molecular
                                                                     equipments, laundery, meeting
                                                                                                                        platform. Pr Lehmann, CHRU
            Hepatic differentiation of stem                          rooms
            cells and biotherapy of liver
            diseases. MD                                                                                                Identification of rare cells
                                                                     High density DNA Affymetrix                        Dr Vendrell, CHRU
                                                                     microarray platform. CHRU-
            Immune system control of                                 INSERM
            hematological neoplasias. MV                             , V Pantesco, T Commes                             Diabetes Cellular Therapy
                                                                                                                        Laboratory : Pancreatic Beta Cell
                                                                                                                        Survival and Regeneration. Dr
                                                                     Montpellier Rio Imaging
            Pathophysiology, diagnosis and cell                                                                         Dalle , Pr Renard, dr Wojtusciszyn
                                                                     Cytometry Platform
            therapy of neurodegenerative disorders.                  Dr Duperray, INSERM                                CHRU
            SL
                                                                                                                        Safe Induced pluripotent stem cells
                                                                     Biomathematics and
            Genomic instability of pluripotent stem                  bioinformatics service                             B. Klein, J De Vos, JM lemaitre, CHRU
            cells. JDV                                               Dr Reme, Pr Commes,
                                                                                                                       Ecell France
            Bioinformatics & high speed sequencing.                                                                    C. Jorgensen
            T Commes


Cell Therapy Unit         In vitro fertilization and        Department of Clinical Hematology            Hepatogastroenterology             Endocrinology
Dr De Vos, CHRU           PGD. Pr                           and Oncology. Pr Rossi, CHRU                 Pr Navarro and Pr Blanc,           Pr Bringer and Pr Renard,
                          Hammamah, CHRU                                                                 CHRU                               CHRU
Node 5: Institute of research in Biotherapy, CHU Montpellier

Platform to produce iPS.
Romain Desprat, Objective. Produce iPS for academic and private                                        SAFE-IPS platform
laboratories.
                                                                                               Direction committee: B. Klein
Quality control tests for safe iPSCs (WP4). John De Vos,                                       J De Vos, JM Lemaître,
1. Optimize and develop quality controls for safe iPSC. 2. Quantify recurrent stresses and
consecutive genetic abnormalities during iPSC production to improve production of safe
iPSCs. 3. Provide tools to dissect the nature and cause of genetic abnormalities in iPSCs      R Desprat,
related to early replicative stress.                                                           L Pichard, INSERM assistant
                                                                                               engineer
Non-integrative methodologies for reprogramming.                                               F Becker, CHU technician
Jean Marc Lemaître, Objective. Development of non-integrative
reprogramming methodologies for SAFE-IPS obtaining .                                           Temporary staffs
                                                                                               2 people
Projects promoting SAFE-IPS development
                                                                                             Projects using SAFE IPS platform
 JM Lemaître, INSERM                            B. Klein, CHU-INSERM-UM1 U1040
 Pluripotency to study and revert               Pluripotency to revert oncogene              C Hamel, INSERM-UM1 U1051
 senescence involved in aging and               induced senescence and study cancer          Obtaining pluripotent stem cell from
 genetic diseases                               cell plasticity                              patients with genetic blindness as tools to
                                                                                             monitor gene therapy methodologies
 J De Vos, CHU-INSERM-UM1 U1040                 M Daujat, CHU-INSERM-UM1 U1040
 Identification and mastering the               Pluripotency as a tool to get human
                                                                                             S Lehmann, INSERM-UM1 U1040
 critical steps creating genomic                hepatocyte cells for cell therapy use
                                                                                             Obtaining pluripotent stem cell from
 instability throughout pluripotency                                                         patients with Alzheimer’s disease
 induction and maintenance                      S Hamamah, CHU-INSERM-UM1 U1040
                                                Immortalized human cumulus cells as a        C Jorgensen, INSERM-UM1 U844
                                                tool to induce and maintain full and safe    Obtaining pluripotent stem cell from
                                                pluripotency                                 patients with osteoarthritis
Activité de la platforme

Octobre 2012-Décembre 2013 :

Journée porte ouverte à l’IRB afin de présenter le projet INGESTEM et les services offerts par la plateforme :
Plus de 80 personnes présentes
Mise en place Administrative de la plateforme :
-Ecriture d’une chartre de fonctionnement et de contrats de reprogrammation, (définie le cadre légal de la
prestation apportée)
-Mise à disposition de la totalité du budget INGESTEM dédié à l’IRB-Montpellier via le CHU,
-Signature d’un d’accord de transfert de technologie entre DNAvec (Invitrogen) pour produire le virus Sendai
(OKSM facteurs) sur Montpellier (IRB) grâce aux infrastructures spécifiques de l’IRB (P2/P3).
-Mise en place d’une collaboration technique avec Dr.Roux (Genève) spécialisés sur le virus sendai afin
d’exprimer de nouveaux facteurs (Lin28, …) et de conseils pour résoudre les potentiels problèmes de production
et d’expression
Mise en place Technique : Ecriture des protocoles de routine et de reprogrammation à partir de Fibroblastes :
Feeders SNL, production virus (Lentivirus, rétrovirus non intégratifs, virus sendai…)
Mise en place Pratique : Constitution de stock de feeders (SNL), plasmides, achats milieux, primers, etc …
Mise en place Stratégique : Point de départ Lentivirus/Rétrovirus afin de qualifier le personnel et les protocoles
et les control qualités pour évoluer ensuite sur une stratégie non intégratives.
Mise en Place Organisationnelle : Réunion Comité de direction tous les semaines
Objectifs à court term (1-2 mois) :                            Objectifs
-Qualification de la platforme
-Détermination des meilleures conditions de culture pour reprogrammer
-Création de « custom chips » afin d’analyser l’expression et les changements de CNV/SNP :Sur les
genes définissant l’état fibroblastique et iPS.
-Demande de financement via le CHU

Objectifs à moyen term (1 an) : Mise en place des méthodes de reprogrammation non intégratives
avec une maitrise totale des différents aspects de la production permettant une transition
potentielle clinique plus probable :
-Production du Virus Sendai (DNAvec) sur Montpellier et Production de beta-FGF sur Montpellier:
Permettant une diminution des coûts associes aux milieux -> plus d’utilisateurs
-Production de proteines (oct4,KLF, Sox…)  pour faire des iPS
-Optimisation des conditions de culture pour produires des iPS.
-Création d’un blog/site web (plus de flexibilité) et/ou en utilisant un system déjà existant
(INGESTEM), permettant un partage plus fluide des protocols et publications, photo des cellules,
questions associées à la culture des iPS….
-Collaboration avec ReproCell afin de créer des ateliers ou période d’apprentissage sponsorise par
ReproCell et Ozyme pour les milieux .

Objectifs à long term (3 ans):
- indépendance financière de la plateforme et identifications des facteurs
Contrôle de la qualitée des iPS :Test de pluripotence


                                                                                           Qualité du contrôle
  Test de pluripotence                                  But                                pour démontrer la
                                                                                             pluripotence


Morphologie des colonies     Vérifier que les iPS ont une morphologie similaire au hES           Faible


                           Marquage de la pluripotence:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80,
    Immunostaining                                                                               Moyen
                                                Nanog et SSEA

                           Détecte le niveau et la qualité d'expression des genes :Oct4,
        RT-PCR                                                                                Moyen-Bon
                                      Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA


                                Capacité à se différencier dans les trois feuillets
    Génération d'EB         embryonnaires (ecto,endo, mésoderme et disparition des            Moyen-Bon
                                        marqueurs de la pluripotence)

 Microarray ou RNA-seq                        Comparaison avec hES                            Moyen-Bon

                                 Capacité à se différencier dans les trois feuillets
  Teratoma formation                                                                              Bon
                                embryonnaires (ecto,endo, mésoderme ) IN VIVO
Contrôle des Conditions de culture
             Xvivo configuration :

             -Incubateurs ne peuvent pas être
             contaminés par les manipulateurs ou l’air
             de la pièce.

             -Les cellules ne subissent AUCUN
             changements dans les paramètres de
             culture contrôlé par le Xvivo (atmosphère
             composition hypoxie, température,…) qui
             s’ils ne sont pas maitrise participent à
             l’apparition d’aberration chromosomique.
Pluripotent genes in Multiple Myeloma




                                         malignant plasma cells

   Cancer that develops in the bone marrow
   Invasion by a clone of malignant plasma cells
   Destruction of the bone tissue
   4000 newly-diagnosed patients/year in France
   25000 in Europe and 25000 in USA
   Still fatal disease in 2012
   Median overall survival: 5 years depending on age and treatment
Fixed Somatic mutations
  Germinal            Recombination linked
                      with isotype switching
   Center                                                                        Primary
  reaction                                                                   genetic events
                                     Cell cycle
                                                                   KLF4 expression
                                                                                  IgH@
                                                                              translocations
                                                                              Hyperdiploidy
Normal plasma                                         Quiescent cells?           Deletion.
                                       G0             Long lived: several yearsCyclin D1-3
    cells
                                                                                Loss of Rb
                                                                              Ras mutations
                                                      Block in G1.
                                       GO   G1        Oncogene induced
    MGUS                                              senescence
                 Diffferent Clones

                                                      Block in G1.
 Smouldering                           G              Oncogene induced
                                            G1
   Multiple                            0              senescence
  Myeloma        Diffferent Clones
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                                                      Heterogeneous disease
                                                      Clonal dominance
                                                                                               Copy number
                                                                                                 variations
                                                                   upregulation
                                       G
  Multiple                             0
                                            G1        From 0% to 4% MMCs in S                   Mutations
  Myeloma                                             phase. Median 0.4%. Strong               P53 deletions
                                                                   Sox 2 expression
                 Clonal dominance
                                                      prognosis factor                          NF-Kappa B
                                                                                                    Myc
                                                                                               overexpressi
                                                 S/    Highly proliferating                          on
Extramedullary                              G1   G2
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  • 1. SAFE-iPS: nœud 5 INGESTEM CHU Montpellier: 750 millions €, 10000 personnes Obtenir des iPS à usage thérapeutique à moyen et long terme Disposer des cellules humaines avec toutes les conditions d’éthique Bénéficier de l’infrastructure lourde du CHU d’assurance qualité et de maintenance Comité de direction: B. Klein (PU-PH), J De Vos (PU- PH), JM Lemaître (DR), R Desprat (DR), responsable organisationnel: valide stratégie scientifique, investissements, organisation, demande Charte fonctionnement prestation. réunion mensuelle Contrat de prestation Plateforme: R Desprat, responsable organisationnel, L Pichard, AI INSERM, F Becker, Tech CHU, + 2 personnes
  • 2. Institute of Research in Biotherapy Director: Pr B. Klein Beta Innov Horiba ABX Immune molecules Rare cells INSERM-UM1 , 870 m2 Common facilities, 658 m2 University hospital R&D, 1000 m2 Multiple Myeloma Cell Administrative & technical staff. Plasticity, Stem Cells and Niche. BK G Berthaud & M Frei Monitoring of Novel Therapeutics Pr Klein, CHRU Early Embryonic Development. SH Common platforms: TL3, Region Clinical proteomic cryogeny, molecular equipments, laundery, meeting platform. Pr Lehmann, CHRU Hepatic differentiation of stem rooms cells and biotherapy of liver diseases. MD Identification of rare cells High density DNA Affymetrix Dr Vendrell, CHRU microarray platform. CHRU- Immune system control of INSERM hematological neoplasias. MV , V Pantesco, T Commes Diabetes Cellular Therapy Laboratory : Pancreatic Beta Cell Survival and Regeneration. Dr Montpellier Rio Imaging Pathophysiology, diagnosis and cell Dalle , Pr Renard, dr Wojtusciszyn Cytometry Platform therapy of neurodegenerative disorders. Dr Duperray, INSERM CHRU SL Safe Induced pluripotent stem cells Biomathematics and Genomic instability of pluripotent stem bioinformatics service B. Klein, J De Vos, JM lemaitre, CHRU cells. JDV Dr Reme, Pr Commes, Ecell France Bioinformatics & high speed sequencing. C. Jorgensen T Commes Cell Therapy Unit In vitro fertilization and Department of Clinical Hematology Hepatogastroenterology Endocrinology Dr De Vos, CHRU PGD. Pr and Oncology. Pr Rossi, CHRU Pr Navarro and Pr Blanc, Pr Bringer and Pr Renard, Hammamah, CHRU CHRU CHRU
  • 3. Node 5: Institute of research in Biotherapy, CHU Montpellier Platform to produce iPS. Romain Desprat, Objective. Produce iPS for academic and private SAFE-IPS platform laboratories. Direction committee: B. Klein Quality control tests for safe iPSCs (WP4). John De Vos, J De Vos, JM Lemaître, 1. Optimize and develop quality controls for safe iPSC. 2. Quantify recurrent stresses and consecutive genetic abnormalities during iPSC production to improve production of safe iPSCs. 3. Provide tools to dissect the nature and cause of genetic abnormalities in iPSCs R Desprat, related to early replicative stress. L Pichard, INSERM assistant engineer Non-integrative methodologies for reprogramming. F Becker, CHU technician Jean Marc Lemaître, Objective. Development of non-integrative reprogramming methodologies for SAFE-IPS obtaining . Temporary staffs 2 people Projects promoting SAFE-IPS development Projects using SAFE IPS platform JM Lemaître, INSERM B. Klein, CHU-INSERM-UM1 U1040 Pluripotency to study and revert Pluripotency to revert oncogene C Hamel, INSERM-UM1 U1051 senescence involved in aging and induced senescence and study cancer Obtaining pluripotent stem cell from genetic diseases cell plasticity patients with genetic blindness as tools to monitor gene therapy methodologies J De Vos, CHU-INSERM-UM1 U1040 M Daujat, CHU-INSERM-UM1 U1040 Identification and mastering the Pluripotency as a tool to get human S Lehmann, INSERM-UM1 U1040 critical steps creating genomic hepatocyte cells for cell therapy use Obtaining pluripotent stem cell from instability throughout pluripotency patients with Alzheimer’s disease induction and maintenance S Hamamah, CHU-INSERM-UM1 U1040 Immortalized human cumulus cells as a C Jorgensen, INSERM-UM1 U844 tool to induce and maintain full and safe Obtaining pluripotent stem cell from pluripotency patients with osteoarthritis
  • 4. Activité de la platforme Octobre 2012-Décembre 2013 : Journée porte ouverte à l’IRB afin de présenter le projet INGESTEM et les services offerts par la plateforme : Plus de 80 personnes présentes Mise en place Administrative de la plateforme : -Ecriture d’une chartre de fonctionnement et de contrats de reprogrammation, (définie le cadre légal de la prestation apportée) -Mise à disposition de la totalité du budget INGESTEM dédié à l’IRB-Montpellier via le CHU, -Signature d’un d’accord de transfert de technologie entre DNAvec (Invitrogen) pour produire le virus Sendai (OKSM facteurs) sur Montpellier (IRB) grâce aux infrastructures spécifiques de l’IRB (P2/P3). -Mise en place d’une collaboration technique avec Dr.Roux (Genève) spécialisés sur le virus sendai afin d’exprimer de nouveaux facteurs (Lin28, …) et de conseils pour résoudre les potentiels problèmes de production et d’expression Mise en place Technique : Ecriture des protocoles de routine et de reprogrammation à partir de Fibroblastes : Feeders SNL, production virus (Lentivirus, rétrovirus non intégratifs, virus sendai…) Mise en place Pratique : Constitution de stock de feeders (SNL), plasmides, achats milieux, primers, etc … Mise en place Stratégique : Point de départ Lentivirus/Rétrovirus afin de qualifier le personnel et les protocoles et les control qualités pour évoluer ensuite sur une stratégie non intégratives. Mise en Place Organisationnelle : Réunion Comité de direction tous les semaines
  • 5. Objectifs à court term (1-2 mois) : Objectifs -Qualification de la platforme -Détermination des meilleures conditions de culture pour reprogrammer -Création de « custom chips » afin d’analyser l’expression et les changements de CNV/SNP :Sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. -Demande de financement via le CHU Objectifs à moyen term (1 an) : Mise en place des méthodes de reprogrammation non intégratives avec une maitrise totale des différents aspects de la production permettant une transition potentielle clinique plus probable : -Production du Virus Sendai (DNAvec) sur Montpellier et Production de beta-FGF sur Montpellier: Permettant une diminution des coûts associes aux milieux -> plus d’utilisateurs -Production de proteines (oct4,KLF, Sox…)  pour faire des iPS -Optimisation des conditions de culture pour produires des iPS. -Création d’un blog/site web (plus de flexibilité) et/ou en utilisant un system déjà existant (INGESTEM), permettant un partage plus fluide des protocols et publications, photo des cellules, questions associées à la culture des iPS…. -Collaboration avec ReproCell afin de créer des ateliers ou période d’apprentissage sponsorise par ReproCell et Ozyme pour les milieux . Objectifs à long term (3 ans): - indépendance financière de la plateforme et identifications des facteurs
  • 6. Contrôle de la qualitée des iPS :Test de pluripotence Qualité du contrôle Test de pluripotence But pour démontrer la pluripotence Morphologie des colonies Vérifier que les iPS ont une morphologie similaire au hES Faible Marquage de la pluripotence:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Immunostaining Moyen Nanog et SSEA Détecte le niveau et la qualité d'expression des genes :Oct4, RT-PCR Moyen-Bon Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA Capacité à se différencier dans les trois feuillets Génération d'EB embryonnaires (ecto,endo, mésoderme et disparition des Moyen-Bon marqueurs de la pluripotence) Microarray ou RNA-seq Comparaison avec hES Moyen-Bon Capacité à se différencier dans les trois feuillets Teratoma formation Bon embryonnaires (ecto,endo, mésoderme ) IN VIVO
  • 7. Contrôle des Conditions de culture Xvivo configuration : -Incubateurs ne peuvent pas être contaminés par les manipulateurs ou l’air de la pièce. -Les cellules ne subissent AUCUN changements dans les paramètres de culture contrôlé par le Xvivo (atmosphère composition hypoxie, température,…) qui s’ils ne sont pas maitrise participent à l’apparition d’aberration chromosomique.
  • 8. Pluripotent genes in Multiple Myeloma malignant plasma cells  Cancer that develops in the bone marrow  Invasion by a clone of malignant plasma cells  Destruction of the bone tissue  4000 newly-diagnosed patients/year in France  25000 in Europe and 25000 in USA  Still fatal disease in 2012  Median overall survival: 5 years depending on age and treatment
  • 9. Fixed Somatic mutations Germinal Recombination linked with isotype switching Center Primary reaction genetic events Cell cycle KLF4 expression IgH@ translocations Hyperdiploidy Normal plasma Quiescent cells? Deletion. G0 Long lived: several yearsCyclin D1-3 cells Loss of Rb Ras mutations Block in G1. GO G1 Oncogene induced MGUS senescence Diffferent Clones Block in G1. Smouldering G Oncogene induced G1 Multiple 0 senescence Myeloma Diffferent Clones T(4;14) Myc rarrangement and Heterogeneous disease Clonal dominance Copy number variations upregulation G Multiple 0 G1 From 0% to 4% MMCs in S Mutations Myeloma phase. Median 0.4%. Strong P53 deletions Sox 2 expression Clonal dominance prognosis factor NF-Kappa B Myc overexpressi S/ Highly proliferating on Extramedullary G1 G2 proliferation /M
  • 10. Role of myc, sox2, KLF4, Oct4 to drive self-renewal in a putative myeloma stem cell

Notes de l'éditeur

  1. The ability to differentiate into almost all tissue types is the hallmark of human pluripotent stem cells (hPSCs). However, as we study the biology of hPSCs for future clinical applications – whether they be under the influence of growth factors (1–4), pro-survival cocktails (5,6), genetic modification (7–10), or other manipulations (1) – pluripotency testing remains a fundamental component of every research design. Assays generally used to test such “stemness” include genomic profiling for relative quantification of pluripotency genes, immunocytochemistry to detect pluripotency markers, embryoid body formation to test 3-germ-layer differentiation capability in vitro or in vivo, and teratoma formation to test 3-germ-layer differentiation capability in vivo (Table 1). Notwithstanding the in vitro assays, teratoma formation in vivo is considered the most stringent of pluripotency assays because it provides more reliable and comprehensive confirmation than does testing cells on a simplified, artificial petri dish. This in vivo assay, coupled with noninvasive, longitudinal imaging, have proven to be invaluable not only in the visualization of stem cell survival and migration post-delivery, but also have been crucial in studying the safety and viability of future stem cell applications (11–13).