Stress Oxydatif : Techniques de mise en évidence de ses causes, de ses conséquences et de son atténuation
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La coexistence de systèmes générateurs d'ERO et de mécanismes antioxydants implique que les forces pro- et anti-oxydantes suivent un équilibre subtil. Lors d’un stress abiotique ou biotique, cet équilibre peut être rompu en faveur des forces pro-oxydantes ; c’est ainsi qu’est défini le stress oxydant. Ce déséquilibre survient lorsque la production de radicaux libres est excessive et que les mécanismes de prise en charge ne peuvent pas faire face, ou bien lorsque ces défenses anti-oxydantes sont altérées et que les ERO ne peuvent être évités ou éliminés. Lorsqu'un stress oxydatif s'est installé, la influence des ERO s'exprime par de nombreux aspects, et en particulier par la perturbation de nombreux processus physiologiques, biochimiques et moléculaires. Les ERO ont tendance, par leurs propriétés oxydantes, à arracher des électrons des macromolécules telles que les lipides membranaires, les protéines ou l'ADN des chromosomes aboutissant à la destruction des constituants cellulaires essentiels (Ramel, 2009). Les ERO altèrent la composition lipidique des membranes plasmiques ce qui est à l'origine d'une peroxydation membranaire. Ils sont à l'origine d'une activation ou une désactivation de plusieurs enzymes telles que les enzymes intervenant dans le métaboliquement oxydant. Au niveau du noyau, les ERO entraînent des dommages au niveau de l'ADN d'où une stimulation de la synthèse des poly (ADP-ribose) et une modification de l'expression de gènes. Il peut en résulter une altération des fonctions vitales de la cellule, conduisant parfois à sa mort.
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- 1. Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene (U.S.T.H.B) Faculté des Sciences Biologiques Laboratoire de Biologie et Physiologie des Organismes Equipe de Physiologie Végétale Dr Lilya BOUCELHA Pr Réda DJEBBAR Stress Oxydatif : Techniques de mise en évidence de ses causes, de ses conséquences et de son atténuation 29 Novembre 2023 liliaboucelha@yahoo.fr reda_djebbar@yahoo.fr
- 2. INTRODUCTION
- 3. INTRODUCTION Seuls ces organismes savaient survivre dans de telles conditions. Il y a 3,5 milliards d’années, les bactéries régnaient en maître sur la Terre, pratiquant la fermentation pour produire de l’énergie, sans oxygène. Quelques millions d’années plus tard, les bactéries se voyaient menacées par un véritable poison qui s’accumulait progressivement dans leur environnement qui est l’Oxygène. D’où vient cet Oxygène ?
- 4. Origine de l’oxygène Quelques végétaux, issus de bactéries avaient trouvé le moyen de fabriquer leur énergie à partir des rayons du soleil. Photosynthèse Accumulation de l’oxygène Aujourd’hui, l’air est composé de plus de 20 % de ce gaz.
- 5. Rôles de l’oxygène Photosynthèse L’oxygène a joué un rôle extraordinaire dans l’évolution des formes vivantes. Son absence, l’anoxie, est mortelle à court terme. A l'exception des organismes anaérobies, l’oxygène est indispensable à la survie du reste des êtres vivants. Il permet aux mitochondries, les centrales énergétiques des cellules, d’arracher des électrons à la matière organique pour fabriquer de l’énergie.
- 6. Toxicité de l’oxygène Vieillissement cellulaire Cependant, ce même oxygène peut devenir un Poison Maladies chroniques Disparition de l’être vivant Comment ? Il est à l’origine de molécules extrêmement agressives et toxiques pour l’organisme. ESPECES REACTIVES D’OXYGENE
- 8. Espèces réactives d’Oxygène Les ERO regroupent l'ensemble des composés issus de la réduction de l'oxygène moléculaire, ainsi que les radicaux libres. Un électron non apparié est un électron qui occupe seul, une orbitale atomique ou moléculaire. Le terme de radical libre renvoie à n’importe quelle espèce capable d’une existence indépendante (d’où le terme de libre) contenant un ou plusieurs électrons non appariés.
- 9. Espèces réactives d’Oxygène Les radicaux libres ne sont pas forcément associés à des espèces dérivant de l’oxygène. La notion de réactivité n’est pas forcément relative aux radicaux. Tous les radicaux oxygénés sont des ERO, mais toutes les ERO ne sont pas des radicaux. Les ERO regroupent les dérivés radicalaires de l’oxygène et non radicalaires.
- 10. Sources Endogènes des ERO Chez les plantes, les ERO sont continuellement produites par différentes voies métaboliques. « Mitochondrie » ❖La Respiration « Chloroplaste » ❖La Photosynthèse « Peroxysome » ❖La Photorespiration ❖La chaîne de transport des électrons « Glyoxysome » ❖La β-oxydation « Enzymes » ❖Oxydases/Oxygénase « Réticulum endoplasmique » ❖Détoxication cellulaire
- 11. Double Rôle des ROS Ces molécules jouent, en fait, un double rôle dans la physiologie de l’organisme. Bénéfique pour l’organismes Néfaste pour l’organisme Acteurs des voies de signalisation cellulaire Produits toxiques s’accumulant sous conditions de stress
- 12. Rôles Bénéfiques des ERO Les ERO, à condition que leur niveau d’accumulation soit finement régulé par un équilibre entre production et élimination, sont indispensables pour que l’organisme puisse assurer certaines fonctions physiologiques fondamentales. « FACE Dr JEKKYL » Capacité de leur élimination Production des ERO Équilibre Redox Homéostasie cellulaire
- 13. Rôles Bénéfiques des ERO ERO Régulation des hormones et mouvements stomates Germination et levée de la dormance Signalisation et réponse cellulaire Défense contre les pathogènes Contrôle Redox des gènes Messagers intra et extracellulaire Croissance et développement Équilibre Redox
- 14. ERO et Germination Faible concentration de ROS Quiescence ou Dormance des graines Concentration optimale de ROS Germination ROS ROS ROS Forte concentration de ROS Dommages oxydatifs « Vieillissement des graines » Une germination ne peut avoir lieu que si la quantité de ROS est comprise entre deux limites inferieure et supérieure Fenêtre Oxydative
- 15. Stress Oxydatif
- 16. Stress Oxydatif ❖ Excès des espèces réactives de O2, N2 ou Cl2 ❖ Défenses insuffisantes (antioxydants) ❖ Mécanismes de réparation insuffisants « FACE Dr HYDE » Capacité de leur élimination Suraccumulation des ERO Stress Oxydatif Un état de stress oxydant existe lorsque ces conditions existent:
- 17. Causes du stress Oxydatif Chez les Plantes Stress Biotiques Virus Insectes phytophages Compétiteurs végétaux Parasites végétaux Microorganismes pathogènes Domaine d’étude « Phytopathologie »
- 19. Comment s’installe-t-il ? DEFICIT HYDRIQUE Dissipation de l’excès d’énergie lumineuse Stress Oxydatif Fermeture des stomates Pas de CO2 Intracellulaire Déséquilibre entre la lumière captée et son utilisation Formation des ERO dans les chloroplastes Entre la génération et l’utilisation des électrons
- 20. Dommages Oxydatifs Alteration et mutation des gènes Protéines ADN Alteration des protéines Inactivation des enzymes Oxydation des acides nucléiques Lipides Alteration de l’intégrité membranaire Peroxydation lipidique Oxydation des groupements soufrés Alteration des structures cellulaires
- 22. Équilibre Redox Cellulaire Incitant à activer les systèmes de défense Collaboration entre le cytosol et les organites Systèmes de signalisation « Signaux rétrogrades » Systèmes Antioxydants Chloroplastes et mitochondries alertent le noyau
- 23. Dans des conditions optimales, les feuilles sont dotées d’enzymes et de métabolites antioxydants suffisants pour faire face aux ERO et éviter, ainsi, un stress oxydatif. Empêcher la formation des ROS Éliminer l’excès de ROS Réparation tissulaires et cellulaires Enzymatiques 1 Non Enzymatiques 2 Systèmes Antioxydants
- 25. Systèmes non enzymatiques Glutathion Ascorbate (Vitamine C) α-tocophérol (Vitamine E) Caroténoïdes Composés phénoliques Thiorédoxines Résidus Méthionine Polyamines Proline Polyols Sucres
- 26. Étude du Stress Oxydatif En pratique comment peut-on mesurer ce stress ?
- 27. 1 Comment évaluer un stress oxydatif ? 01 02 03 La production de ROS Mise en évidence du H2O2 ou du O2 - par une technique cytochimique ou quantitative Le stress oxydatif doit être étudié à travers trois aspects afin de comprendre ses mécanismes et ses manifestations. Les effets délétères (conséquences) Peroxydation des lipides membranaires et Oxydation / Carbonylation des protéines Les systèmes de défense Mesure des activités antioxydantes enzymatiques et non enzymatiques.
- 28. 1 Analyses cytochimiques des ERO Par le DAB Thordal-Christensen et al.(1997) En plus du dosage par spectrométrie, les ERO peuvent être mis en évidence et localisés au niveau des tissus par une technique cytochimique.
- 29. 1 Immerger l’organe végétal frais dans la solution du DAB préparée dans l’eau distillée à 1mg.ml-1 Incubation pendant 12 heures à l’obscurité sous agitation Rinçage l’éthanol à 60 % jusqu’à la dépigmentation totale de la chlorophylle (cas des feuilles ou tiges) Observation sous loupe binoculaire Blé dur
- 30. 1 Priming – Fenêtre Oxydative-Vigna unguiculata
- 31. 1 Priming – Fenêtre Oxydative-Fenugrec Témoin Imbib AG Hydro Hormo Gueridi Sabrina et al. En cours de publication
- 33. 1 Immerger l’organe végétal frais dans la solution du NBT préparée dans un tampon phosphate (0,1 M pH 6,8) à 0,5 mg.ml-1 Incubation pendant 2 heures à l’obscurité sous agitation Rinçage l’éthanol à 60 % jusqu’à la dépigmentation totale de la chlorophylle (cas des feuilles ou tiges) Observation sous loupe binoculaire Détection de l’anion superoxyde (O2 -) Blé dur
- 34. 1 Priming – Fenêtre Oxydative-Vigna unguiculata Détection de l’anion superoxyde (O2 -) PEG 30 %
- 35. 1 Priming – Fenêtre Oxydative-Fenugrec Détection de l’anion superoxyde (O2 -) Gueridi Sabrina et al. En cours de publication
- 36. 1 Priming – Ageing Détection de l’anion superoxyde (O2 -)
- 37. 1 Effets délétères (conséquences) Alteration des membranes Intégrité membranaire Peroxydation lipidique Teneur en malondialdéhyde (MDA) Fuite des électrolytes Méthode Physiologique Méthode Biochimique
- 38. 1 Effets délétères (conséquences) Intégrité membranaire
- 40. 1 1ère étape: Sur le matériel végétal frais (première mesure de la conductivité, E) 2ème étape: Sur le matériel végétal détruit par ébullition ce qui permet d’obtenir la conductivité totale de tout le contenu cellulaire (deuxième mesure de la conductivité, Et) Calcul de la fuite d’électrolytes Par le conductimètre Mesure de la Fuite des électrolytes % fuite électrolytes = E * 100 / Et
- 41. 1 Peroxydation lipidique Teneur en malondialdéhyde (MDA) Extraction dans le TCA à 1% Lecture de la D.O à 532 et à 600 nm Dosage avec l’acide thiobarbiturique (TBA)
- 42. 1 Effets délétères (conséquences) Oxydation des Protéines Produits de l’oxydation des protéines (AOPP) Dosage par le 2,4- dinitrophenylhydrazine et la Guanidine Dosage par l’iodure de potassium (KI) Levine et al. (1990) Witko-Sarsat et al. (1996) Protéines carbonylées
- 43. 1 Étude qualitative des protéines Apparition des protéines de stress Approche électrophorétique Activation des enzymes antioxydantes
- 44. 1 Systèmes de défense Activités antioxydantes enzymatiques Catalase Ascorbate peroxydase Gaiacol peroxydase peroxydase Superoxyde dismutase Dégradation du H2O2 Oxydation de l’ascorbate Formation du tetragaicol Inhibition de l’autoxydation du pyrogallol Anderson et al. (1995) H2O2 H2O2 + Ascorbate réduit H2O2 + Gaïacol réduit O2 - + Pyrogallol réduit MacAdam et al. (1992) Nakano et Asada (1981) Marklund et Marklund (1974)
- 45. 1 Systèmes de défense Activités antioxydantes enzymatiques Catalase Gaïacol peroxydase peroxydase APX cytosolique Ascorbate peroxydase APX Chloroplastique APX Totale Extraction avec Ascorbate Extraction sans Ascorbate Soustraction des deux activités H2O2 + 2 ascorbate 2 H2O + monodéhydroascorbate
- 46. 1 Systèmes de défense Activités antioxydantes enzymatiques Superoxyde dismutase
- 47. 1 Systèmes de défense Activités antioxydantes non enzymatiques Glutathion total (GSH) Capacité antioxydante non enzymatique totale (CANET) Oxydo/réduction Moron et al. (1979). 5,5’-dithiobis-2- nitrobenzoic acid Molybdate (Oxydant) DPPH Hanato et al. (1988) Prieto et al. (1999) Composés phénoliques Singleton and Rossi (1995) Folin- Ciocalteu Oxydo/réduction Oxydo/réduction Oxydo/réduction Activité antiradicalaire
- 48. 1 Systèmes de défense Activités antioxydantes non enzymatiques Caroténoïdes Photoprotecteurs Chl* excité Lichtenthaller (1987) bêta-carotène Lycopène
- 49. Conclusion
- 50. 1 L’étude du stress oxydatif, généré par les stress abiotiques tels que la sécheresse ou la salinité Mieux connaître les mécanismes mis en jeu dans la résistance ou la tolérance à ces stress Partant de là, on a pu obtenir, par transgénèse, des génotypes tolérants par surexpression (over-expression) des gènes codants pour les enzymes anti-oxydantes Conclusion
- 51. 1 La surexpression de l’APX des chloroplastes Tabac Tolérance à la salinité et au déficit hydrique. La surexpression de l’APX des chloroplastes Arabidopsis Tolérance à la salinité La surexpression de Cu-Zn SOD Tolérance à la salinité et à la sècheresse. Patate Conclusion Une approche intéressante afin d’obtenir des plantes tolérantes à la sécheresse ou à la salinité.
- 52. 1 Booste les systèmes anti-oxydatifs chez les espèces adaptées et extrêmophiles Plantes à intérêt médicinal Utilisation thérapeutique pour traiter certaines maladies Conclusion
- 53. Perspectives
- 54. 1 Perspectives 4 3 1 2 Mesure d’autres enzymes antioxydantes Dosage d’autres molécules antioxydantes ainsi que le ratio oxydé / réduit Électrophorèse bidimensionnelle Analyses transcriptomiques et génomiques
- 55. 1 Travaux
- 56. 1 Travaux