Le document traite de l'évolution de la résistance de Plasmodium falciparum aux médicaments antipaludiques, en mettant en lumière divers gènes de résistance et leurs mécanismes. Il explore également les origines de cette résistance, notamment la résistance à la pyriméthamine et à l'atovaquone-proguanil, ainsi que les implications de la sélection naturelle sur les allèles de résistance. Enfin, il souligne l'importance de l'analyse génétique pour comprendre la dynamique de la résistance aux traitements antipaludiques.

1. évolution de la résistance de Plasmodium falciparum
aux médicaments antipaludiques
jerome.clain@parisdescartes.fr
UMR216 ‘Santé de la mère et de l’enfant face aux infections tropicales’
Institut Pasteur de Madagascar, 29 mars 2011

2. histoire de la résistance aux antipaludiques
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
adapted from Ekland & Fidock, 2008

3. principaux gènes de résistance aux médicaments antipaludiques
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
• pfcrt (3 SNPs) • pdhfr (3-4 SNPs)
• pfmdr1 (SNPs) • pfmdr1 (CNVs) • pfcytb (1 SNP)
• dhps (1-3 SNPs)
• vacuole digestive • cytoplasme • mitochondrie
• fonction inconnue • synthèse d’ADN • transfert d’e-

4. • comment évoluent les allèles (gènes) de chimiorésistance ?
• combien d’origines de chimiorésistance ?

5. 1- brefs rappels de génétique des populations
2- gène pfdhfr et origine de la résistance à la pyriméthamine
3- gène pfcytb et résistance à la Malarone (atovaquone-proguanil)

6. les 2 échelles de l’évolution
• au sein d’1 espèce • entre plusieurs espèces
• au sein/entre populations • échelle : temps géologiques
• échelle : générations mutation
migration
dérive génétique
sélection naturelle

7. évolution des populations
changement des fréquences alléliques au sein d’une population
N individus diploïdes
2 allèles
0.75 génération 1
0.25
♀ ♂ Évolution si :
• mutation
urne des gamètes
effectifs infinis • migration
2N tirages
• dérive génétique
• sélection naturelle
N individus diploïdes
0.75
0.25
génération 2

8. marqueurs du polymorphisme génétique (1)
SNP : single nucleotide polymorphism
allèle sauvage : 5’-ATAACATGA-3’
allèles mutants :
ATAAAATGA 5’-ATAATATGA-3’ ATAAGATGA
« bénéfique » « délétère »
« neutre »
« avantageux » « désavantageux »
• ~ 1 SNP / 300 pdb
• ~ 100 000 SNPs (objectif : 350 000)
Mu et al. 2006

9. marqueurs moléculaires du polymorphisme (2)
• polymorphismes de séquences répétées en tandem : microsatellites
5’-ATCTAGCACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)8
5’-ATCTAGCACACACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)10
- très polymorphes : nombreux allèles différents dans une population
- neutres le plus souvent

10. diversité génétique et origine des mutations
: microsatellite
: séquence codante
kb -5.3 -4.4 -0.1
dhfr
(TA)n (TAA)n (CG)n phénotype
13 12 10 sensible
12 7 8 S
10 8 9 S
9 9 9 S
7 7 6 S
8 10 12 S
11 11 11 S

11. apparition d’un allèle de résistance par mutation
: séquences répétées en tandem (microsatellite)
: séquence codante
kb -5.3 -4.4 -0.1
dhfr
(TA)n (TAA)n (CG)n 51 59 108 phénotype
13 12 10 résistant
12 7 8 sensible
10 8 9 S
9 9 9 S
7 7 6 S
8 10 12 S
11 11 11 S

12. sélection de l’allèle de résistance
1. fréquence de l’allèle de résistance  : sélection directionnelle positive
2. effet « auto-stop » ou hitchhiking
3. déséquilibre de liaison 13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10 13 12 10
12 7 8 12 7 8
10 8 9 10 8 9
9 9 9 traitement 9 9 9
7 7 6 = 7 7 6
8 10 12 sélection 8 10 12
11 11 11 11 11 11

13. diversité réduite à proximité de l’allèle sélectionné
12 7 8
10 8 9
9 9 9
7 7 6
8 10 12
11 11 11
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10

14. application 1 :
recherche de locus sélectionnés par approche genome-scan
identification du gène pfcrt, déterminant de la résistance à la chloroquine
Réduction de la diversité allélique
chromosomes
parasites résistants à la chloroquine
parasites sensibles à la chloroquine
Wooton 2001, Nature

15. application 2 :
origine de la résistance à la pyrimethamine en Afrique
> base génétique : 3 SNPs dans le gène dihydrofolate reductase
dhfr ts
51 59 108
wild type N C S
triple mutant I R N
> probabilité élevée d’échec thérapeutique
> origine unique en Asie du Sud Est 1978
> triple mutant asiatique importé dans le sud
et l’est de l’Afrique
? généralisation à l’ensemble du continent africain ? 15

16. stratégie
allèles dhfr
• sauvage (WT) n = 75
• triple mutant n = 204
: microsatellite
: séquence codante
dhfr ts
-3.9 -0.1 51 59 108 +0.5 +1.5 kb
WT - - N C S - -
triple mutant - - I R N - -

17. FCM29 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5
FCM29 194 147 IRN 105 202 196 - IRN - - - - IRN - - 185 140 NCS 99 -
ThaïTHAI -
-
-
139
IRN
IRN
-
-
-
-
-
-
150
-
IRN
IRN
-
107
-
-
-
-
-
-
IRN
IRN
-
-
-
-
192
187
166
145
NCS
NCS
99
109
-
-
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 190 127 NCS 93
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 191 127 NCS 109 -
- - IRN 107 - - - IRN - - - - IRN - - 191 136 NCS 107 204
- - IRN 109 - - - IRN - - - - IRN - - 192 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 136 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 196 127 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 139 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 151 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 158 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 140 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 154 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 224 142 NCS 95
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 141 NCS 93 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 163 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 197 - NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 150 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 160 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 137 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 127 NCS 109 204
- - IRN - - 189 - IRN - - - IRN - - 207 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 210 150 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 191 153 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 95 - 201 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 146 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 156 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 147 NCS 85 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 140 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 152 IRN 103 204 189 153 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - 196 - IRN - - 189 154 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 204 192 135 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS - 204
- - IRN - - 200 - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - 202 - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 102 -
- 154 IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 154 NCS 103 204
- 154 IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 - NCS 101
- - IRN 103 - - - IRN - - - - IRN - - 202 139 NCS - 204
- - IRN - 204 - - IRN - - - - IRN - - 202 143 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 141 NCS 97 195
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 143 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 139 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 - IRN - - 206 146 NCS 99 -
- - IRN 103 - - - IRN - - 202 - IRN - - 206 151 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 - 208 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 210 137 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 127 NCS 111 205
- - IRN - - 151 IRN - - - - IRN - - - 139 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 143 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 162 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 149 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 144 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 149 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 127 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - - 150 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 190 142 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 111 204
resistant wild-type
Maïga, 2007, J Infect Dis

18. application 3 :
origine de la résistance à l’atovaquone + proguanil
(Ato-PG ou Malarone®)
• traitement et prévention des infections à P. falciparum
• Ato : inhibe le complexe mitochondriale : cytochrome bc1
• proguanil (PG) : augmente l’activité de l’atovaquone (Ato)

19. résistance à Ato-PG
• résistance à Ato
- base génétique simple
- 1 SNP mitochondrial : pfcytbY268S/C/N
0 2000 4000 6000 (pb)
cox I cytb
coding
cox III
4294a>c → Tyr268Ser
4294a>g → Tyr268Cys
- sensibilité in vitro à Ato :  x102-103
- perte de la synergie entre Ato et PG synergy
Musset 2007, Microb Inf

20. paradoxe de la résistance à Ato-PG
• traitement cher (35-60 €)
- pas/peu utilisé dans les zones d’endémies
• allèle de résistance pfcytb268 extrêmement rare dans populations naturelles
- donc probablement non transmis par le moustique
• échecs thérapeutiques chez les voyageurs : 0,1 - 1 % !!
- résistance du parasite
- allèle mutant non détecté au début du traitement
? ces échecs sont-ils dus à un seul ou différents allèles de
résistance pfcytb268 ?

21. stratégie expérimentale
échantillon : CNR Paludisme (Paris, France)
• 7 isolats provenant d’échecs thérapeutiques (portant l’allèle mutée pfcytb268)
- Ato-PG (6)
- atovaquone seule (1)
• 28 isolats appariés provenant de succès thérapeutiques par Ato-PG (portant
l’allèle mutée pfcytbY268)
analyses :
• séquençage du génome mitochondrial : analyse de la diversité
moléculaire autour du locus pfcytb268
• génotypage de polymorphes nucléaires (microsatellites)
0 2000 4000 6000 (pb)
cox I cytb
cox III

22. Mitochondrial genome nucleotide position
cox3 cox1 cytb
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4
r r r n n s r i i i s s n n n s s i i r
Haplotype Origin n A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
R1 IVC 1 . - - . . . . . . . . . . G . . . . . -
R2 IVC 1 . - - T . . T . . . . . . C . . . . T T
R3 UPV 1 . - - . . . . . . . . T . C . . . . . -
R4 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . -
R5 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . C . . . . . -
R6 GUI 1 . - - . . A . T . . . . . C . . G . . -
R7 THA 1 . - - . . . . . C . . . . C . . . . . -
S1 IVC/UPV/GUI 13 . - - . . . . . . . . . . . . . . . . -
S2 IVC/UPV/GUI 9 . - - . . . . A . . . . . . . . . . . -
S3 IVC 1 . - - . . . . C . . . . T . . . . . . -
S4 UPV 1 . - - . C . . A . . . . . . . . . . . -
S5 UPV 1 . - - . . . . A . . T . . . . T . . . -
S6 GUI 1 . - - . . . . A . . . . . . . . . T . -
S7 GUI 1 . A T . . . . A . . . . . . . . . . . -
S8 GUI 1 G - - . . . . . . T . . . . . . . . . -
Musset , Mol Biol Evol 2007

23. relations entre les haplotypes mitochondriaux
minimum-spanning network
R2 R4
R3
R7
R : pfcytbY268C
S1
R : pfcytbY268S R1 R5 S8
S3
S2
• diversité génétique des sauvages et R6
des résistants comparables S4 S6
• pas compatible avec une origine
unique et récente de la résistance
S5 S7

24. variations de séquence avant et après traitement
Ato-PG
D0 Déchéc
(length, bp)
Mitochondrial genome nucleotide position Microsatellite
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
T T A P T
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4 A A f A
R
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5 A A A P A
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4 8 6 K 8
2
7 0 2 1
Time Hap A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
D22 R4 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . - 80 71 98 165 175
D0 . - - . . . . . . . . . . . A . . . . - 80 71 98 165 175
• 5 patients : identité moléculaire parfaite entre D0 et Déchec
• 1 patient : séquence D0 incomplète, identité nucléaire
• 1 patient : D0 non collecté

25. interprétation des données
mutation
~ 105
*
reproduction
*
asexuée
*
traitement ~ 108-1012
*
*
*
*
*
*
*
• mutation se produit et est sélectionnée
chez les patients indépendamment

26. conclusions sur la résistance à Ato-PG
• multiples origines de l’allèle de résistance à Ato-PG
• cas unique : observer en situation naturelle la phase initiale de
l’évolution la résistance, avant la transmission de l’allèle mutant
par le moustique
• Ato-PG non recommandé pour un usage massif en zone
d’endémie

27. évolution de la résistance aux antipaludiques
• origines rares pour SP et CQ (≥ 3 SNPs)
• sélection intense sur les populations
• migrations intra et intercontinentales
• échecs thérapeutiques liés à la transmission de parasites
chimiorésistants
• origines multiples pour Ato-PG
• échecs thérapeutiques liés à la sélection de mutations de
novo (SP, CQ)
• signatures de sélection naturelle peuvent être recherchées
dans les génomes de populations
- diminution de la diversité génétique
- différenciation génétique entre populations

28. UMR216
Collaborateurs
• Pr Jacques Le Bras
• Dr Abdoulaye Djimdé (MRTC, Bamako)
• Dr Oumou Maïga
• Dr Milijaona Randrianarivelojosia (IPM)
• Dr Lise Musset
• Dr JF Lepère (Bandraboua, Mayotte)
• Emmanuelle Renard
• Dr Agnès Aubouy (Gabon)
• Dr Jérôme Clain
• Dr Sabah Omar (Kenya)
CNR Paludisme
• Pr Jacques Le Bras
• Véronique Hubert
• Dr Sandrine Houzé