!

              "
      #

! !
                       "   #

                  !
          $       "$

              %

  !
!                        " ! !
#   !       $                % &'( )           *                    +%

,               -       % &'.                       /

0                   1          2           % &'34       *   ! !      +     /
        5)

6 7 8        /%                6               0                  % 4994
  ! :       7           !                  "        ;             <
                         !                 =

        !                      5       !                             7
6        7                                            4               5
                                      5

          $ >%
        ? $                    !




                                                              &'

                               ( )'       *




4                3                                                +
                                                  -
                                                                      ,


                                                              ∆               45
                 3
                                                  .   /



                                              8



                     ' 01 02




                               .
9
/# :   +               ;
   4               !
-# 9                       +
           !
'# 9


               !
.                ;

/8 8 < = >             "

       +           "
               "



           "
? #@
4                                    4                              !



            trophozoites       chloroquine   camptothecine   daunomycine




.
    "



                                                                    A   =B   -CC-



.       "

                           !      "          #     $
.                    4


             D   "           . 6 B E> F B @ :G
        @+
    A
                         ?
                     4
@         A

1) TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labelling): Fragmentation
  internucléosomale de l’ADN

                 5 µm




               ,B ?              A   !   C4 9 D




                   <    C4 9 D           <    C4 E D
@+
             .            +       0 4H
           trophozoïtes            schizontes
    SSC




                                                FSC




7 4A H    10%             24%     25%




          5%              14%     39%


                                                  PI
               C              '      <3
@+
                  .      +       0 4H

3) Marquage par l’Annexine V:
Exposition phosphatidylsérines




           %       &


                                        6 #D   ,= B   -CC<
A
                 EI   /G

    7 4A H

                           -   0 12
                           ,
             4             +
                           *
                           )
                           (



                           '

                               .      /
Stratégie de Recherche
 Approche bioinformatique
      •   Recherche d’un gène candidat
      •   Recherche de site catalytique
      •   Recherche de domaines
 Approche biochimique in vitro
      •   Synthèse de protéine recombinante
      •   Tests d’activité enzymatique avec substrat luminescent
 Approche in vivo dans cellule eucaryotes
      •   Test de surexpression et d’induction d’apoptose
      •   Test de clivage
 Approche in vivo chez P.falciparum
      •   Test d’activité enzymatique et de clivage après induction d’apoptose!
      •   Test de survie du parasite en présence d’inhibiteurs de Caspase
Approche bioinformatique

 Métacaspase inactivée

                                                  Site de clivage potentiel

                                                              DD

                                                       H C
                           75   106
                 DD         CARD       DED             P20          P10
                26    72              211   242



                     Domaines régulateurs         Domaine catalytique C14




                                                             P20
                      Métacaspase activée                     P10
.                              "
                   +
                                # ! "# !
                                   &


 ! +"- -
    #!
 .. "                                            !#
                                                  "   $
                                                 !#
                                                  "   %
+          !#
            "
+   /0 1    #" 2
              ,"
                   '   (   ('

                                                 !#
                                                  "   $
3 " !
 0 . 1
  4                '   (   ('

                                                $
                                               )* ,
                                                +
9                                                                                                     +
                                                                         !


                  etoposide sur 3d7 48 h                                       etoposide sur 7g8 48 h

 120                                                          120
 100                                                          100
  80                                            ring           80                                                ring
                                                tropho                                                           tropho
% 60                                                         % 60
                                                schizontes                                                       schizontes
  40                                            pycno          40                                                pycno
  20                                                           20
   0                                                            0
       0   3,75      7,5    15        30   60                       0   3,75      7,5    15        30   60
                  etoposide (µg.mL)                                            etoposide (µg.mL)
.                         "


       +3, 4       5+




'- 6
-+     #0      6   1    $
9
    !
" 0
        1                 !-

                  .       "       5

-! .   " #! #
       #                  0 1 .. "
-   - " "
     !#      1"       6       !-& ! 0
                                    !
       - "
        !#    &       1       "
"#
'            7           8       #               #
    7    9                   #       :


    2#           # ; 8                               # #       #7
                                             7
    8    2
         #            7 8        #                         #            <
             !       =           ##
    8    > #         #       #           #                 #        #
                 7


    ?                !           # ! 7       #       ##         #
'         .""
                           #/'        2
7     1    .""          9 0
7 '   +'           :.    -"
                          #       # " ! " 6- ;
                                    # -# "#
    & ";
      #        ;1!      ;#-   "   <
7         ..       -0     1 # 0   # # 1"
                                   "
'         "
                            #           & "
                                          #
7 1 < # #                       8
    8 $           #              #            7   7
                      # #       #@
7 >               #8
    8 ?   #                 #       #   7         #
          @
7 0           7             8
    8 $               7         'A B '
                                 $2 C
    8 $                     !      #   # 6?B@
7         # #                                         #
          ##
6 1 F0                                                  E                                 5
                                                 =                JG




                                        A BG         A BG A BG
B= 7             1      1
                                        8 A BG % ?B           9 H F-
?B     &9.   !                            I & 4 9 @ ?F


           9                                 E                         .           3   &E   4&   J9


                 I .9                    B                %,               7           %

                            I&4                  6        , 1          :

                                  I&4                 6       5                5:

                                  IJ9                 G                    : K 7
"0
#    -1"         ! "
#    '




           !    "
                  -
         !I G =G G & .
"0
                  #    -1"     ! "
           . #"    # ! -# 0
                    0 #"

    - #. " 1"
     "              - #9 "
                     "         - # -& -
                                "
"
#    -& 9 # + 4   & 9 # + 4=    & 9 # + 4=
      = 0-             3>
                       $          ? 3>
                                    $
8B "   7      3 !   5

       & !1   :     !#


#




'




                         7   499 H
'       +'        +    .     + .
                 1         :.   "#

E                                           E




3                                           3




E                                           E



3                                           3




        C    7       D " A BG          C7   - 7   D
6# 1
 "     :.   "#" & "
              #   #

            #



                '



            #


                '
" " :-
                              "

         NS

18                       18

16                       16
                                      NS
14                       14

12                       12

10                       10

 8                        8
 6                        6
 4                        4

 2                        2
 0                        0

                  A BG                     A BG
     5                        5

              :                   6
( 11
                 !
? '
 3   -  -   01    & 1 " " 1! " 1 -
                        #    #
 3 ' -    & " "0 11
             ##        .#  "0 "#/
                            #                    ;
    ; 2
3 ' . #    1      "
                  # & "
                      #
                          >         #
                          7   D #                #
                                        5 # ##   *



       !
?3         # 0 1! " 1 -
                  #
 3     . . "& #
 3      # 1" - #
         - @       - ""
                      #   "
 3        0   1 #
.. " 0 1 ". @ #     ; 1 -! &
                                                                "1     " . "
                                                                       5     &
                                      1  # 1 0 " " " # " 0"0 "#"
                                          "     1" # #      #    # 1   ! 3 +
                                                                        "
                                         #    ; #3 3
                                                  A . " ? +?
                                                         ?   ?




    B    (     ? A; 4 5% + %
                ; ?         3
    C'        ; " ': 11 ? 4? ? $ 3
                 # .        5$ +? 4
              A ; 4? +% 3 -
                 ? 5       '#     "




                                                       .. "    -        !#
                                                                         "
                                                       #" " 0
                                                         "       ! #1 " . "
                                                                  1
                                                                . 13 " ? % ;
                                                        1 -! 0 " !
                                                           "1            %4
                                                        #3 3 3 .
                                                             (      3 -  $ +
                                                                          %
                                                      $?
                                                       %3


G
G            F J9
             F J9
.
    "
B
 B                       ! !
                         ! !                                 !
                                                             !                           L
                                                                                         L
                                                                 6
                                                     6       M
              A1 J3J4
              A1 J3J4
##                           BB
                                            1            "           6
         $$
                                             0                   $                   /
                                                         7           6
                                                 1                   A -

                                        $                <                       7
         @ ,
         @ ,             ,
                         ,                                       6
 NN,
  ,    :: 77   %%   77             <<

        !!     !!             77
                                                                      A

                                                     #                   6
                                                 1                           :

Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

  • 3.
    ! " # ! ! " # ! $ "$ % !
  • 4.
    ! " ! ! # ! $ % &'( ) * +% , - % &'. / 0 1 2 % &'34 * ! ! + / 5) 6 7 8 /% 6 0 % 4994 ! : 7 ! " ; < ! = ! 5 ! 7
  • 5.
    6 7 4 5 5 $ >% ? $ ! &' ( )' * 4 3 + - , ∆ 45 3 . / 8 ' 01 02 .
  • 6.
    9 /# : + ; 4 ! -# 9 + ! '# 9 !
  • 7.
    . ; /8 8 < = > " + " " " ? #@
  • 8.
    4 4 ! trophozoites chloroquine camptothecine daunomycine . " A =B -CC- . " ! " # $
  • 9.
    . 4 D " . 6 B E> F B @ :G @+ A ? 4
  • 10.
    @ A 1) TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labelling): Fragmentation internucléosomale de l’ADN 5 µm ,B ? A ! C4 9 D < C4 9 D < C4 E D
  • 11.
    @+ . + 0 4H trophozoïtes schizontes SSC FSC 7 4A H 10% 24% 25% 5% 14% 39% PI C ' <3
  • 12.
    @+ . + 0 4H 3) Marquage par l’Annexine V: Exposition phosphatidylsérines % & 6 #D ,= B -CC<
  • 13.
    A EI /G 7 4A H - 0 12 , 4 + * ) ( ' . /
  • 17.
    Stratégie de Recherche Approche bioinformatique • Recherche d’un gène candidat • Recherche de site catalytique • Recherche de domaines Approche biochimique in vitro • Synthèse de protéine recombinante • Tests d’activité enzymatique avec substrat luminescent Approche in vivo dans cellule eucaryotes • Test de surexpression et d’induction d’apoptose • Test de clivage Approche in vivo chez P.falciparum • Test d’activité enzymatique et de clivage après induction d’apoptose! • Test de survie du parasite en présence d’inhibiteurs de Caspase
  • 18.
    Approche bioinformatique Métacaspaseinactivée Site de clivage potentiel DD H C 75 106 DD CARD DED P20 P10 26 72 211 242 Domaines régulateurs Domaine catalytique C14 P20 Métacaspase activée P10
  • 19.
    . " + # ! "# ! & ! +"- - #! .. " !# " $ !# " % + !# " + /0 1 #" 2 ," ' ( (' !# " $ 3 " ! 0 . 1 4 ' ( (' $ )* , +
  • 20.
    9 + ! etoposide sur 3d7 48 h etoposide sur 7g8 48 h 120 120 100 100 80 ring 80 ring tropho tropho % 60 % 60 schizontes schizontes 40 pycno 40 pycno 20 20 0 0 0 3,75 7,5 15 30 60 0 3,75 7,5 15 30 60 etoposide (µg.mL) etoposide (µg.mL)
  • 22.
    . " +3, 4 5+ '- 6 -+ #0 6 1 $
  • 23.
    9 !
  • 26.
    " 0 1 !- . " 5 -! . " #! # # 0 1 .. " - - " " !# 1" 6 !-& ! 0 ! - " !# & 1 "
  • 27.
    "# ' 7 8 # # 7 9 # : 2# # ; 8 # # #7 7 8 2 # 7 8 # # < ! = ## 8 > # # # # # # 7 ? ! # ! 7 # ## #
  • 28.
    ' ."" #/' 2 7 1 ."" 9 0 7 ' +' :. -" # # " ! " 6- ; # -# "# & "; # ;1! ;#- " < 7 .. -0 1 # 0 # # 1" "
  • 29.
    ' " # & " # 7 1 < # # 8 8 $ # # 7 7 # # #@ 7 > #8 8 ? # # # 7 # @ 7 0 7 8 8 $ 7 'A B ' $2 C 8 $ ! # # 6?B@ 7 # # # ##
  • 30.
    6 1 F0 E 5 = JG A BG A BG A BG B= 7 1 1 8 A BG % ?B 9 H F- ?B &9. ! I & 4 9 @ ?F 9 E . 3 &E 4& J9 I .9 B %, 7 % I&4 6 , 1 : I&4 6 5 5: IJ9 G : K 7
  • 31.
    "0 # -1" ! " # ' ! " - !I G =G G & .
  • 32.
    "0 # -1" ! " . #" # ! -# 0 0 #" - #. " 1" " - #9 " " - # -& - " " # -& 9 # + 4 & 9 # + 4= & 9 # + 4= = 0- 3> $ ? 3> $
  • 33.
    8B " 7 3 ! 5 & !1 : !# # ' 7 499 H
  • 34.
    ' +' + . + . 1 :. "# E E 3 3 E E 3 3 C 7 D " A BG C7 - 7 D
  • 35.
    6# 1 " :. "#" & " # # # ' # '
  • 36.
    " " :- " NS 18 18 16 16 NS 14 14 12 12 10 10 8 8 6 6 4 4 2 2 0 0 A BG A BG 5 5 : 6
  • 37.
    ( 11 ! ? ' 3 - - 01 & 1 " " 1! " 1 - # # 3 ' - & " "0 11 ## .# "0 "#/ # ; ; 2 3 ' . # 1 " # & " # > # 7 D # # 5 # ## * ! ?3 # 0 1! " 1 - # 3 . . "& # 3 # 1" - # - @ - "" # " 3 0 1 #
  • 38.
    .. " 01 ". @ # ; 1 -! & "1 " . " 5 & 1 # 1 0 " " " # " 0"0 "#" " 1" # # # # 1 ! 3 + " # ; #3 3 A . " ? +? ? ? B ( ? A; 4 5% + % ; ? 3 C' ; " ': 11 ? 4? ? $ 3 # . 5$ +? 4 A ; 4? +% 3 - ? 5 '# " .. " - !# " #" " 0 " ! #1 " . " 1 . 13 " ? % ; 1 -! 0 " ! "1 %4 #3 3 3 . ( 3 - $ + % $? %3 G G F J9 F J9
  • 39.
    . "
  • 40.
    B B ! ! ! ! ! ! L L 6 6 M A1 J3J4 A1 J3J4 ## BB 1 " 6 $$ 0 $ / 7 6 1 A - $ < 7 @ , @ , , , 6 NN, , :: 77 %% 77 << !! !! 77 A # 6 1 :