SlideShare une entreprise Scribd logo
1  sur  53
Télécharger pour lire hors ligne
UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI
ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI
SUPPORT DE COURS DE GENETIQUE MOLECULAIRE
LICENCE PROFESSIONNELLE EN GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE
NIVEAU LP2
ELABORE PAR Dr. (MC) Camus M. ADOLIGBE
ANNEE UNIVERSITAIRE 2023-2024
1
UNITE D’ENSEIGNEMENT(UE) : GENETIQUE MOLECULAIRE
CODE UE (GEM 1300)
SOMMAIRE
DEFINITION
OBJECTIF GENERAL
OBJECTIF SPECIFIQUES
MODALITES D’ENSEIGNEMENT-APPRENTISSAGE
METHODES D’EVALUATION
BIBLIOGRAPHIE & WEBOGRAPHIE
PLAN DE COURS
CHAPITRE 1 : NATURE CHIMIQUE, STRUCTURE ET FONCTIONNEMENT DU MATERIEL
GENETIQUE
- Nature chimique du matériel génétique
- Structure du matériel génétique
- Fonctionnement du matériel génétique
CHAPITRE 2 : LES MUTATIONS
- Propriétés des mutations
- Notion de mutation germinale et de mutation somatique
- Les agents mutagènes et leurs modes d’action
- Notion d’épigénétique
- Les différents types de mutations et leurs conséquences
2
CHAPITRE 3 : REGULATION DE L’EXPRESSION DU GENE
- Les procaryotes
- Les eucaryotes
CHAPITRE 4 : THERAPIE GENIQUE
- Réalisations cliniques
- Perspectives futures
CHAPITRE 5 : REALISATION DE LA PCR ET DE L’ELECTROPHORESE SUR GEL
D’AGAROSE
- Travaux pratiques de réalisation de PCR
- Travaux pratiques de réalisation de l’électrophorèse sur gel
d’agarose
3
DEFINITION
La génétique moléculaire est une branche de la biologie et de la génétique, qui consiste en l'analyse
de la structure et de la fonction des gènes, normaux ou mutants, au niveau moléculaire.
Dans le contexte de la biologie médicale, elle fait partie de la génétique biologique, et consiste en
l'analyse du matériel génétique humain directement au niveau des acides nucléiques à partir de
liquides biologiques dans le but de caractériser l'origine génétique d'une maladie.
OBJECTIF GENERAL
A l’issu du cours l'étudiant doit être capable de décrire les connaissances de base en génétique
moléculaire et d’en retenir les applications potentielles en sciences biomédicales
OBJECTIFS SPECIFIQUES
À la fin du cours, les étudiants seront capables de :
• décrire la structure des gènes et leur fonctionnement ;
• expliquer les mécanismes qui modulent l'expression des gènes ;
• identifier les techniques d'analyse des acides nucléiques ;
• expliquer la thérapie génique ;
• manipuler un thermocycleur et un dispositif d’électrophorèse sur gel d’agarose
MODALITES D’ENSEIGNEMENT-APPRENTISSAGE
Cours magistral effectué sur la base du support de cours, des vidéos et MOOC appuyés par des
travaux dirigés, des travaux pratiques et des travaux personnels.
METHODES D’EVALUATION
• Evaluation formative
• Evaluation sommative
• Travaux pratiques
BIBLIOGRAPHIE
4
CHAPITRE 1 : NATURE CHIMIQUE, STRUCTURE ET FONCTIONNEMENT DU MATERIEL
GENETIQUE
- Nature chimique du matériel génétique
- Structure du matériel génétique
- Fonctionnement du matériel génétique
5
CHAPITRE 1 : NATURE CHIMIQUE, CHARACTERISTIQUES ET FONCTIONNEMENT DU
MATERIEL GENETIQUE
I-NATURE CHIMIQUE
Historique de la découverte de l’ADN
Expérience de Fred Griffith & de Oswald Avery
Le premier phénomène qui allait permettre de progresser dans l'identification du support de l'hérédité
est celui de la transformation bactérienne, rapporté en 1928 par l'anglais Fred Griffith (1877 - 1941).
Celui-ci travaille alors au laboratoire de pathologie du ministère de la santé du Royaume Uni.
Griffith décrit deux souches de pneumocoques Diplococcus pneumomiae: la souche R (rough, car
lorsque cette souche est cultivée sur milieu de culture artificiel, les colonies obtenues ont un aspect
rugueux) et la souche S (smooth, car les colonies ont au contraire un aspect lisse). La souche S doit
son aspect à une capsule polysaccharidique qu'elle synthétise autour d'elle. Cette souche est
mortelle pour la souris lorsqu'elle lui est injectée. A l'inverse, la souche R ne synthétise pas une telle
capsule, et elle n'est pas nocive lorsqu'elle est injectée à une souris (Fig.1). On sait aujourd'hui que
cette différence entre les deux souches est due à une mutation, chez la bactérie R, du gène codant
l'enzyme responsable de la synthèse de la capsule.
Griffith observe tout d'abord que l'injection de bactéries S, si elles ont été préalablement tuées par la
chaleur, n'est plus létale pour la souris. Pour une raison qui nous est toujours inconnue, Griffith décide
alors d'injecter conjointement des bactéries S chauffées mélangées à des bactéries R vivantes. Cette
fois, les souris meurent de septicémie. Les bactéries R, au contact des bactéries S tuées, ont donc
acquis un caractère pathogène qu'elles ne possédaient pas précédemment. Ce phénomène a été
appelé transformation bactérienne, et il a été par la suite reproduit chez plusieurs autres espèces
bactériennes. Il existe en fait plusieurs souches de pneumocoques (types I, II, ou III), discernables
6
grâce à des tests immunologiques. Lorsque qu'une souche R de type III est injectée avec une souche
S de type II inactivée, la bactérie virulente qui est ré-isolée de la souris tuée est toujours du type II.
Ce changement est stable et définitif. Ceci suggère donc qu'il existe chez les cellules un "facteur
transformant", probablement libéré par la chaleur, susceptible d'être intégré par d'autres bactéries,
et qui leur confère de façon héréditaire de nouvelles propriétés génétiques. Ce phénomène
représentait un test d'activité biologique, grâce auquel on pouvait envisager de déterminer la nature
du matériel génétique responsable de la transformation de bactérie du type R en bactérie de type S.
Griffith ne sut pas en tirer lui-même avantage, et la nature du "facteur transformant" sera élucidée
plus de 10 ans plus tard par Avery et ses collègues.
La nature biochimique du matériel génétique mis en évidence par Griffith est élucidée en 1944 par
les travaux de Oswald Avery, et de ses collègues (Colin McLeod, et McLyn McCarthy), qu'ils mènent
à l'Institut Rockfeller de New-York. Ils reprennent les expériences de Griffith sur la transformation
bactérienne, et cherchent à purifier le facteur transformant du pneumocoque. Cette caractérisation
prendra 10 ans, elle les conduit à montrer que ce facteur n'est autre que l'ADN : en effet, l'ADN extrait
d'une souche S suffit à lui seul pour transformer une souche non virulente en souche virulente. La
transformation des bactéries R s'effectue par incorporation de fragments d'ADN provenant des
bactéries S tuées. On sait aujourd'hui que de tels fragments sont capables de rentrer dans une
bactérie vivante, et de s'intégrer au chromosome de celle-ci en lieu et place de la région homologue.
L'identification de l'ADN comme principe transformant est à l'époque suffisamment extraordinaire
pour nécessiter qu'une telle découverte soit étayée par des arguments indiscutables. Aussi Avery et
ses collègues effectuent-ils leurs analyses avec un soin particulièrement méticuleux. Tous les
contrôles alors disponibles sont testés : l'absence de protéine dans les préparations est testée par
divers réactifs chimiques, leur composition chimique est analysée par des moyens chimiques ou
spectrophotométrique. Enfin, l'utilisation d'enzymes montre que le pouvoir transformant réside bien
dans l'ADN, puisque la DNAse anéantit ce pouvoir, alors que la RNAse ou des protéinases le laisse
intact (Fig.2).
7
Fig 1 : Expérience de Griffith
8
Fig.2 : Expérience d’Avery et collaborateurs
La difficulté à accepter l'ADN comme support de l'hérédité
Malgré une accumulation croissante de preuves jusqu'au début des années 50, la communauté
scientifique n'a pas accepté facilement que l'ADN puisse être le support de l'hérédité. Selon les
thèses alors les plus largement acceptées, l'ADN n'est qu'une molécule simple, et donc incapable de
véhiculer une information complexe. La théorie tétranucléotidique proposée par Phoebus Aaron
Levene (1869 - 1940), stipulait que la structure de l'ADN est régulière et monotone, comprenant un
enchaînement répétitif des 4 bases azotées.
Levene était alors un des plus grands spécialistes des acides nucléiques, c'est lui qui avait identifié
le désoxyribose comme un des constituants de l'ADN. Les protéines, dont on avait perçu l'immense
diversité, semblaient de bien meilleurs candidats pour véhiculer une information génétique.
La découverte de Avery a été accueillie avec beaucoup de scepticisme, ils furent interprétés par
beaucoup comme le résultat d'une contamination des préparations d'ADN par de faible quantité de
9
protéines ou d'une autre substance. Et même si ces préparations d'ADN étaient absolument pures,
il était possible d'envisager que cette molécule ne soit pas elle-même porteuse d'information, mais
qu'elle joue simplement un rôle de commutateur : toutes les informations nécessaires à la transition
de la forme R vers la forme S auraient déjà été présentes dans chacune des souches, et l'ADN
n'aurait alors contribué qu'à la transition d'un type vers l'autre. Avery lui-même n'a pas véritablement
cherché à imposer ses conclusions. Ainsi, l'importance fondamentale de ces travaux ne sera
reconnue que tardivement, et le comité Nobel ne le retiendra pas pour l'attribution d'un prix. Lorsqu’en
1953 Watson et Crick décriront la structure de l'ADN, ils ne prendront même pas la peine de citer ces
travaux dans leur article.
Certains scientifiques ont cependant saisi immédiatement la portée immense des travaux d'Avery.
Ce fut en particulier le cas de E. Chargaff, J. Lederberg, G. Beadle, ou de A. Lwoff. Chargaff est un
biochimiste d'origine autrichienne ayant émigré aux USA en 1934. Il fait partie des
scientifiques qui saisissent immédiatement la portée immense des travaux d' Avery sur la
transformation bactérienne. Lorsque Avery publie ses résultats, Chargaff dirige un laboratoire de
biochimie à l'université de Columbia. Le thème central en est alors la biochimie des lipoprotéines.
Quand il prend connaissance des travaux d'Avery, Chargaff comprend aussitôt que l'ADN occupe
une place centrale dans les mécanismes héréditaires, et il décide de consacrer désormais les
activités de son laboratoire à l'étude des acides nucléiques. En 1950, il publie ses travaux sur le
contenu en bases azotées de l'ADN chez diverses espèces, réalisés grâce aux progrès de la
chromatographie sur papier. Il montre alors que le rapport A+T/C+G est variable selon les espèces,
mais constant pour tous les membres d'une espèce donnée. L'ADN est donc porteur d'une certaine
spécificité, cette molécule n'a pas une structure polymérique monotone, elle est donc susceptible de
contenir une information. Ces travaux contribuent à répandre l'idée que l'ADN puisse être une
molécule porteuse de l'information génétique. Chargaff montre par ailleurs que le rapport C/G ou A/T
est à l'inverse constant et quasiment égal à un chez toutes les espèces étudiées. Cette dernière
observation sera déterminante pour l'élaboration du modèle de la structure de l'ADN par Watson et
Crick quelques années plus tard.
A la suite du succès remporté par ce modèle, Chargaff est très réticent à en reconnaître l'entière
paternité à ses auteurs, pour lesquels il n'a jamais eu grande estime (à la suite de sa première
10
rencontre avec Watson et Crick, il les avait comparés à deux clowns). Il continuera à revendiquer
pour son propre compte le modèle d'appariement des bases, alors qu'il n'y avait lui-même jamais
pensé, et n'ayant mis en évidence que les rapports égaux d'adénine et de thymine, de cytosine et de
guanine.
Composition chimique de l'ADN
Les travaux de Kornberg révélèrent que les précurseurs de l'ADN étaient des nucléotides riches en
énergie (dNTP, dCTP, dTTP, dGTP). Chaque nucléotide est composé d'acide phosphoriques (3),
base azotée (A, T, C, G) et un pentose(2'-désoxy-β-D-Ribose). La liaison formée entre deux
phosphates donne un anhydride avec une liaison très riche en énergie, et la liaison entre le
groupement acide du phosphate et l'hydroxyle du sucre donne une liaison ester. La liaison formée
entre le sucre et la base est une liaison osidique de type β-Nglycosidique (Fig. 3, 4, 5 et 6).
Fig.3: Formes du phosphate et les liaisons formées.
11
Fig.4: Nucléoside. Le sucre se lie à la base azotée par une liaison impliquant un des azotes (l’azote
n°1 des pyrimidines ou azote n°9 des purines) et le carbone 1' de l’ose (carbone réducteur ou
fonction semi-acétalique). C'est une liaison N-osidique.
Fig.5 : A- Les pentoses qui rentrent dans la composition des acides nucléiques (ADN, ARN).B-
Numérotation d'un sucre, le prime (') est ajouté dans la numérotation pour la distinguer à celle des
bases.
12
Figure 6: Les cinq bases azotées de l'ADN et l'ARN (Purines [A et G], Pyrimidines [C, T et U])
Activité
Consigne : à l’aide de la note de cours, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-
après
1-Décrivez les résultats de l’expérience de Griffith
2-Formulez une hypothèse pouvant expliquer l’apparition de bactéries S vivantes dans le corps des
souris mortes
3-Déduisez la nature de l’information génétique
4- Décrivez la composition chimique de l’ADN
5-Qu’est-ce qui différencie les bases purines des bases pyrimidines ?
6-Quel type de liaison lie la base au sucre ?
Durée : 45mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe)
13
II- CHARACTERISTIQUES
1-STRUCTURE
L’ADN n’est pas une molécule simple brin mais une molécule double brin faite par deux chaînes
antiparallèles complémentaires qui s'emboîtent. L’association des deux brins d’ADN est permise
grâce aux liaisons hydrogène qui peuvent s’établir entre les bases purines et pyrimidique.
L’appariement spécifique d’une adénine avec une thymine et d’une Guanine et d’une cytosine induit
une complémentarité entre les deux brins. La complémentarité de séquences explique l’équimolarité
observé par Chargaff qui montre dans les années 50 une relation d’équimolarité entre certaines
bases Azotées ([A]=[T] et[G]=[C]). Dans une molécule d’ADN :
-le nombre d’adénine = au nombre de thymine
-le nombre de cytosine = au nombre de guanine
Grâce à la complémentarité de séquence si on ne connaît que la séquence d’un des brins de
l’ADN on peut en déduire la séquence de l’autre. Watson et Crick en 1953 décrivent la structure
tridimensionnelle de l’ADN. Dans l’espace, les deux chaînes présentent une configuration
hélicoïdale. Elles s’enroulent autour d’un axe imaginaire pour constituer une double hélice à
rotation droite. Le pas de l’hélice est de environ 10 nucléotides. L’ADN forme deux sillons: le petit
sillon et le grand sillon. Les paires de bases sont perpendiculaires au plan de l'axe de l’hélice
(Fig.7, 8). Les liaisons hydrogènes entre les bases complémentaires sont l'une des
caractéristiques fondamentales de la double hélice, car elles assurent la stabilité
thermodynamique de l'hélice et la spécificité de l'appariement. Une liaison hydrogène est formée
entre un atome ou groupement donneur d'hydrogène chargé positivement et un autre accepteur
chargé négativement (fig.9). Dans l'ADN, les liaisons hydrogènes stabilisent les paires de base de
la double hélice. La complémentarité entre les bases repose sur des raisons stériques.
L'appariement de base entre deux purines, deux pyrimidines ou des bases non complémentaires
A-C ou G-T est défavorisé, parce que les liaisons hydrogènes appropriées ne peuvent se former
sous peine de rompre la géométrie de l'hélice. Une conséquence de cette règle d'appariement des
bases est que la séquence d'un brin définit la séquence des bases de l'autre brin.
14
Fig.7 : Structure détaillée de la double hélice de l'ADN (forme B). Un tour d'hélice recouvre
environ 10.5 pb (34 Å). Le squelette de chaque brin est formé de sucre et de phosphate. Les
bases azotées sont projetées vers l'intérieur de la molécule mais restent accessibles au solvant
par les deux sillons (petit et grand sillon).
Fig.8 : Interactions entre C-G et A-T
Deux types de paires de bases, souvent appelées paires de bases complémentaires
prédominants dans la plupart des ADN A-T et C-G. La paire de base A-T est associée par deux
15
liaisons hydrogènes et le G-C par trois.
Fig.9: Mise en évidence des groupements impliqués dans les liaisons H
2-Formes de l'ADN
Dans l'espace les deux chaines présentent une configuration hélicoïdale. Elles s'enroulent autour
d'un axe imaginaire pour constituer une double hélice à rotation droite (Ex. Forme A et B) ou bien à
rotation gauche (Ex. Forme Z). Il existe plusieurs structures hélicoïdales de l'ADN. Jusqu' à présent,
six formes ont été décrites (A, B, C, D, E et Z), mais la plupart d'entre elles ont été trouvées dans
des conditions expérimentales contrôlées. La forme B de l'ADN est la forme biologique la plus
importante, elle correspond à la forme décrite par Watson et Crick en 1953. Cette forme est
caractérisée par un pas (tour) d'hélice de 10.5 pb (34 Å) et un diamètre de 2,37nm (fig. 7). La forme
B de l'ADN est caractérisée aussi par la présence de deux sillons, le petit sillon et le grand sillon.
Les différentes formes de l'ADN se distinguent par : 1- le nombre de paires de bases dans chaque
tour d'hélice ; 2- la longueur de l'hélice ; 3- le diamètre hélicoïdal de la molécule ; 4- le sens de la
double hélice (droit, gauche).
3- Propriétés physico-chimiques de l'ADN
Les liaisons hydrogènes et les interactions hydrophobes qui maintiennent la structure en double
hélice sont des forces faibles et des quantités relativement petites d'énergie peuvent séparer les
deux brins par un processus appelé dénaturation.
16
3-1- Température de fusion
Si une solution d'ADN est chauffée, à une certaine température, les liaisons hydrogènes qui assurent
la cohésion des 2 brins appariés se rompent. On parle de fusion de l'ADN caractérisée par la
température de fusion (Tm : melting temperature) (fig. 10). La dénaturation et la renaturation des
brins d'ADN en solution sont des reconstitutions critiques pour diverses fonctions biologiques
normales (réplication ; transcription …etc.). La température de fusion est influencée par plusieurs
facteurs :
- C + G % : la Tm augmente avec l'augmentation du% CG (fig.10). Pour les petites séquences
comme les amorces (17 à 31) Tm= 4(C+G) + 2(A+T) ;
- les cations (mono ou divalent) ;
- les polyamines ;
-les protéines.
La propriété d'absorption des purines et pyrimidines dans l'UV à 260nm, et les protéines à 280nm
permet de doser les acides nucléiques (C: concentration), et aussi bien d'estimer la contamination
par les protéines lors de la purification des acides nucléiques. C = A260*DF*100 (unité: µg/µl A:
Absorbance, DF: facteur de dilution) P(pureté) = A260 /A280 (Une solution d'ADN est considérée
pure si 1.7 ≤ P ≤ 2).
17
Fig.10: La séparation des brins d'ADN en fonction de la température. Tm est la température pour
parvenir à 50% de séparation des deux brins. Les régions riches en A et T s'ouvrent plus rapidement
à celles riches en C et G (Clark, 2005).
4- L'ADN mitochondrial
L'ADN mitochondrial (ou ADNmt) est une molécule d'ADN circulaire que l'on retrouve dans la
mitochondrie. Cette molécule d'ADN code pour une partie des protéines et des ARN spécifiques au
fonctionnement de la mitochondrie. Le génome mitochondrial est circulaire, chez l'homme, il est
composé de 16 569 paires de bases et est associé à des protéines. L'organisation est comparable
au chromosome bactérien. La transmission de cet ADN est généralement dite non mendélienne car,
dans la plupart des cas, il est transmis par la mère. Mais il existe de nombreuses exceptions chez
les plantes, les champignons et même chez les animaux(fig.11).
18
Fig.11: ADN mitochondrial
Activité
Consigne : à l’aide de la note de cours et de la figure ci-dessous, répondez individuellement puis en
groupe aux questions ci-après
1-Répérez le sucre, la base et l’acide phosphorique d’un nucléotide
2-Expliquez la complémentarité entre les deux brins de l’ADN et déduisez en les implications
3-Que désigne pb? Une pb équivaut à combien de nucléotides?
4- Répérez la forme B de l’ADN sur la figure ci-dessous
19
5-Que signifie Tm?
6-En quoi consiste la dénaturation de l’ADN? Citez une fonction biologique où elle est
indispensable
7- Pourquoi la Tm augmente avec l'augmentation du pourcentage de CG?
8-Quelles sont les charactéristiques du génome mitochondrial ?
Durée : 45mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe)
III-FONCTIONNEMENT DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE
1-Notion de gène
Un gène est une séquence d’ADN qui permet la fabrication d’une protéine (grande molécule
biologique) spécifique ou d’un ARN fonctionnel. On dit qu’un "gène code pour" la fabrication de telle
ou telle protéine. Chaque chromosome contient des milliers de gènes qui vont donc permettre la
synthèse de milliers de protéines. Ces protéines assurent l’essentiel des fonctions de la cellule. Elles
ont différentes dénominations selon leur fonction : enzymes, neurotransmetteurs, hormones, etc., et
ont un temps d’utilisation défini.
20
2- Le concept de gène
C'est un fragment défini du chromosome occupant un emplacement fixe ; le locus et gouvernant une
fonction précise, identifiable au niveau du phénotype. Les allèles représentent les différentes formes
du même gène, dérivant les uns des autres par mutation et conditionnant les différents caractères
pouvant se manifester dans le cadre de cette fonction. Des allèles portés par deux gènes distincts
peuvent être échangés à la suite de recombinaisons. Cette notion classique du gène recouvre donc
en fait trois aspects distincts : le gène est à la fois l'unité de fonction, l'unité de mutation, et l'unité de
recombinaison.
2.1. La fonction
2.1.1. Phénotype.
Le programme génétique de la cellule sert à la synthèse des enzymes responsables du
métabolisme. Les enzymes de nature protéique sont constituées par un ou plusieurs polymères
d'acides aminés : les polypeptides. Le phénotype résulte de l'existence et du développement de
divers assemblages polypeptidiques, il en résulte qu'on peut considérer que l'unité de phénotype est
le polypeptide, et que la fonction primordiale du matériel génétique est la synthèse d'un polypeptide
2.1.2. L'unité génétique de fonction.
a) Le matériel génétique.
Les travaux d'Avery, McLeod, McCarty (1944) sur la transformation bactérienne ont permis d'établir
que la substance porteuse de l'information génétique est un acide nucléique: ADN. Le programme
fonctionnel de la cellule est inscrit sous forme codée dans la séquence de bases successives des
deux chaînes.
b) Le cistron.
L'ADN détermine la séquence des AA dans les polypeptides à partir des triplets de bases: les codons
(Khorana et Niremberg 1968). On peut obtenir 64 codons (codons-sens) dont 61 correspondent aux
20AA qui entrent dans la constitution des polypeptides. Trois codons sont dit "non-sens" et servent
à marquer une ponctuation: (codon stop: UAA, UAG, UGA appelés aussi respectivement ocre, ambre
21
et opale). Le polypeptide étant défini comme l'unité biochimique de phénotype, on peut lui faire
correspondre une unité génétique de fonction: le cistron.
2.2. Mutation et recombinaison.
2.2.1. L'unité de mutation.
C'est le plus petit fragment de la séquence nucléotidique dont l'altération peut empêcher ou modifier
l'expression phénotypique du cistron. L'unité de mutation peut varier d'un nucléotide à un ou plusieurs
codons.
2.2.2 L'unité de recombinaison.
C'est la plus petite partie du génome qui puisse être échangée contre une autre ; l'unité de
recombinaison correspond donc à un nucléotide. Deux nucléotides adjacents peuvent être séparés
par recombinaison.
Activité
Consigne : à l’aide de la note de cours, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-
après
1- Pourquoi dit-on que le gène est une séquence d’ADN qui permet la fabrication d’une protéine
spécifique ou d’un ARN fonctionnel?
2- Que comprenez-vous par cette phrase: le gène est à la fois l'unité de fonction, l'unité de mutation,
et l'unité de recombinaison.?
Durée : 20mn (travail individuel) ; 10mn (travail en groupe)
3.Activité des gènes
3.1. Nombre de gènes dans la cellule.
Le nombre d'unité de fonction du génome d'une cellule est difficile à déterminer. Un cistron
comporte quelques centaines de codons, un millier de nucléotides. Par ailleurs la quantité d'ADN
22
(nombre de nucléotides) constituant le génome d'une cellule peut être déterminée et une simple
division permet alors d'obtenir le nombre approximatif de cistrons. Les valeurs obtenues par cette
méthode sont très élevées: 10 000 unités de fonction pour une bactérie, plusieurs dizaines de milliers
pour une cellule humaine (3 milliards de paires de nucléotides pour les 46 chromosomes humains).
Ces chiffres sont sûrement surestimés puisque la totalité de l'ADN du génome n'a pas une activité
génétique, et l'activité génétique ne s'exprime pas dans tous les cas par la synthèse d'un polypeptide,
enfin l'estimation ne tient pas compte des phénomènes de redondance (un même cistron pouvant
être répété plusieurs fois sur un génome). Il est plus raisonnable d'admettre que le génome bactérien
comporte de 1000 à 4000 gènes et le génome humain quelques dizaines ou centaines de milliers.
3.2. Fonctionnement
Il diffère selon que la cellule est eucaryote nucléée ou procaryote bactérienne. Chez la cellule
eucaryote l'ADN se trouve dans le noyau protégé par des protéines histones alors que la synthèse
des polypeptides s'effectue dans le cytoplasme. l'ARNm passe donc du noyau au cytoplasme pour
la synthèse protéique. Chez les bactéries le chromosome est constitué par de l'ADN non lié aux
protéines et directement au contact du cytoplasme.
3.2.1. Cellule procaryote (bactérie)
a-Transcription
Chez les procaryotes, dénués de noyau, la transcription se déroule au contact du cytoplasme
et c'est la même ARN polymérase qui assure la synthèse des trois classes d'ARN (ARN
ribosomiques, ARN de transfert et ARN messagers). La transcription correcte d'une séquence
d'ADN en une molécule d'ARN représentative d'une unité d'information, repose sur une
détermination correcte du point de départ, le site d'initiation, et du point d'arrivée, le site de
terminaison. Ce sont les séquences du promoteur, situé en amont du point de démarrage de la
transcription, et celles du site de terminaison, en fin d'unité de transcription, qui contiennent les
informations nécessaires à la détermination des deux extrémités de la portion d'ADN à transcrire.
La transcription d'un même fragment d'ADN peut débuter à plusieurs reprises en un court laps
23
de temps. Ce fragment peut donc être transcrit en plusieurs molécules d'ARN qui, s'il s'agit d'une
séquence codante, sont elles-mêmes traduites en polypeptides "dans la foulée" : on dit que,
chez les procaryotes, la traduction est couplée à la transcription.
Fig.12 : Principe de la transcription chez la cellule procaryote
b-Traduction
Le terme traduction désigne l'ensemble des mécanismes qui transforment l'information portée
par la séquence d'un ARN messager en une séquence polypeptidique. Ainsi, le flux d'information
va passer de la forme acide nucléique (alphabet à 4 lettres) à la forme protéine (alphabet à 20
lettres) selon un code "universel". Le code génétique permet d'attribuer une signification (acide
aminé ou arrêt de traduction) à chaque triplet de bases nucléiques de l'ARNm. Chez les
procaryotes, la transcription et la traduction sont couplées : les ARNm sont traduits en
polypeptides au fur et à mesure de leur synthèse.
3.2.2. Cellule Eucaryote
A-Transcription
 Le principe de la transcription est toujours le même : il s'agit de transcrire un code d'un
système à quatre lettres (les bases nucléiques) dans un autre "langage" à 4 lettres, mais les
modalités diffèrent par rapport aux procaryotes.
24
Localisation de la transcription
La synthèse des ARN a lieu là où se trouve l'ADN, c'est-à dire principalement dans le noyau des
eucaryotes, mais aussi dans le nucléoïdes des mitochondries ou des chloroplastes. De plus, l'ARN
messager des eucaryotes qui est transcrit dans le noyau, subit ensuite une maturation, puis il est
transféré dans le cytoplasme avant d'y être traduit.
Les ARN polymérases
Alors qu'une seule enzyme synthétise toutes les catégories d'ARN des procaryotes, dans la cellule
eucaryotique, trois ARN polymérases sont mises en jeu dans la transcription d'ensembles de
cistrons différents.
• L'ARN polymérase A transcrit les cistrons ribosomiques, elle assure la synthèse des plus
grands ARN des ribosomes. Son lieu d'action est le nucléole, en effet, les très nombreux
cistrons ribosomiques répétés (c'est une de leur caractéristique), sont groupés au niveau de
loci précis : les organisateurs nucléolaires. A l'interphase, la transcription active de ces
cistrons se manifeste sous forme de structures cytologiques : les nucléoles.
• L'ARN polymérase B réalise la synthèse de tous les ARN messagers nucléaires, qui seront
traduits en protéines.
• L'ARN polymérase C assure la synthèse des petits ARN nucléaires (ARN de transfert et ARN
ribosomique 5S) et la transcription des gènes cytoplasmiques, c'est à dire, ceux qui sont
portés par les chromosomes des mitochondries et des plastes des végétaux.
Toutes ces polymérases sont des édifices protéiques complexes composés de quatre sous unités,
rappelant celles des procaryotes, auxquelles s'ajoutent jusqu'à une douzaine de protomères. De
plus, ces complexes ne fonctionnent in vivo que grâce à l'interaction de nombreux autres facteurs
protéiques établissant des relations temporaires avec le cœur de l'enzyme.Ce que l'on connaît de la
transcription des cistrons ribosomiques rappelle la transcription de l'ADN procaryotique .
25
La transcription des cistrons exprimés en protéines
La transcription des séquences codantes, les cistrons exprimés en protéines, est assurée par la
polymérase B. Parmi ceux-ci, on distingue plusieurs types d'organisation : quelques rares gènes
présentent des unités de transcription semblables à celles des procaryotes, cependant la plupart
des gènes eucaryotes sont structurés en mosaïque de portions codantes (les exons) et de
portions n'ayant pas de signification protéique (les introns). La synthèse d'ARN chez les
eucaryotes donne généralement naissance à un produit de transcription "primaire" (ou
prémessager) qui devra subir une maturation pour fournir le messager cytoplasmique
fonctionnel. Nous allons donc distinguer les deux étapes dans la "fabrication" d'un ARN
messager fonctionnel : la transcription proprement dite et la maturation.
Fig.13 : Transcription chez la cellule procaryote
 Mécanisme de la transcription : l'étape d'initiation de la transcription est cruciale, bien plus
que l'élongation et à la terminaison, elle présente des caractéristiques propres aux
eucaryotes, elle est décrite ci-dessous. La transcription des séquences codantes est assurée
26
par la polymérase B, mais d'autres facteurs protéiques (appartenant au groupe des TF II)
sont nécessaires pour certaines étapes particulières, notamment pour le démarrage
(l'initiation). La formation du complexe d'initiation nécessaire à la fixation précise de l'ARN
polymérase B est résumée dans la figure ci-contre. Un premier complexe, TFII-D reconnait
le promoteur et permet la fixation de TFII-A puis des interactions protéiques entre cet
assemblage, TFII-B et la polymérase B permettent la fixation de celle-ci, son maintien est
assuré par TFII-E. D'autres facteurs (TFII-H et J) participent à la modification de la topologie
de l’ADN. C’est au prix de cette complexité que la transcription est correctement initiée. Ici
encore, tout repose sur l'interaction de protéines spécifiques avec des séquences
déterminées, les promoteurs.
Fig.14 : Initiation de la transcription chez la cellule Eucaryote
27
Les promoteurs des cellules eucaryotes, reconnus par l'ARN polymérase B (ou II), ont été
étudiés à l'aide des outils les plus performants de la génétique moléculaire. Des expériences ont
permis l'analyse systématique de l'effet de mutations dans les régions situées en amont du site
de démarrage de la transcription. Leurs résultats ont mis en évidence le rôle déterminant de trois
'modules', positionnés à des distances d'environ -30, -75 et -100 du point de démarrage de la
transcription :
• La cassette TATA, vers -30, est probablement la seule séquence consensus située à une
position fixe présente dans la quasi-totalité des gènes de la classe II, elle semble jouer
un rôle dans la précision du premier nucléotide transcrit.
• La cassette CAAT est située à -80 dans l'exemple du gène de la globine mais sa position
peut varier selon les gènes, séquence consensus : GGCCAATCT.
• La cassette GC (consensus : GGGCGG) est souvent en plusieurs copies et dans les deux
orientations.
Ces modules de base représentent donc un signal pour le complexe d'initiation de la polymérase
B mais leur assemblage en différentes combinaisons possibles permet déjà une diversification
qui va intervenir dans la régulation de la transcription. D'autres modules, parfois très éloignés
du promoteur "de base", jouent également un rôle dans la régulation. Les signaux de
terminaison sont moins bien connus que chez les procaryotes, par contre on connait des signaux
de polyadénylation (l'ajout d'une séquence polyadénylée en 3' OH des messagers eucaryotiques
fait partie de la maturation).
 La maturation
La maturation de la plupart des transcrits primaires porte sur 3 points:
• la formation d'une structure particulière en 5' : la coiffe,
• l'adjonction d'une séquence polyadénylée en 3',
• l'épissage : excision des introns et jonction des exons.
28
La coiffe est formée par addition d'une guanosine triphosphate: le premier nucléotide du
messager est généralement une purine, A ou G et représente théoriquement l'extrémité 5'
triphosphorylée de la molécule : 5'pppA-pN-pN-pN-pN-pN ...En fait, une guanine est ajoutée par
une liaison inhabituelle 5'-5' : Gppp + pppA-pN-pN-pN-pN-pN → Gp-ppA-pN-pN-pN-pN-pN
...Diverses méthylations peuvent se produire ensuite, notamment une en position 7 de la guanine
et sur le ribose pour compléter cette structure que l'on retrouve dans tous les messagers
eucaryotiques. L'adjonction de la coiffe se fait au cours de la synthèse du transcrit primaire. La
coiffe joue un rôle pour le démarrage de la traduction : elle permet la reconnaissance, par les
ribosomes, de l'extrémité 5' de l'ARN messager.
La polyadénylation est un ajout post-transcriptionnel de nucléotides adényliques au niveau
d'un site de polyadénylation du transcrit primaire. Le site est reconnu par un complexe protéique
comportant une poly-A polymérase. Cette structure va former l'extrémité 3' du messager, elle
peut aller jusqu'à 200 nucléotides. Elle semble assurer la protection de l'ARNm contre les
dégradations enzymatiques et jouerait un rôle dans l'adressage du messager vers le
cytoplasme.
La maturation des gènes mosaïques, qui sont transcrits depuis le point d'initiation jusqu'au
signal de terminaison, assure l'élimination des introns du transcrit primaire, ou pré-messager,
et la jonction des exons qui doit se faire avec une grande précision. L'ensemble se fait
simultanément par un mécanisme d' "épissage". Il existe plusieurs mécanismes d'épissage,
qui diffèrent selon les unités de transcription. Tous font intervenir des molécules d'ARN autres
que le transcrit primaire. Dans certains cas, c'est même un ARN qui catalyse la réaction : un
ribozyme. Le mécanisme décrit ici est celui utilisé pour la plupart des messagers nucléaires, il
fait appel à des ribonucléoprotéines au sein desquels, la molécule d'ARN joue certainement
un rôle prépondérant.
29
Fig.15 : Phénomène de maturation chez la cellule procaryote
Activité
Consigne : à l’aide de la note de cours, des Moocs et supports vidéo reçus et de vos recherches
personnelles sur internet, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-après
1- Définir : gène, locus, allèle, polypeptide, cistron, histone
2- Comparez le génome bactérien au génome humain
3- Comparez la transcription chez les cellules eucaryotes et procaryotes
30
4- Quels sont les complexes d'initiation nécessaires à la transcription de l'ARN polymérase B chez
la cellule eucaryote
5- Citez, décrivez puis donnez le rôle des différents phénomènes de maturation de l'ARNm chez la
cellule eucaryote
6- Quels sont les trois modules déterminant du promoteur chez la cellule eucaryote ?
Durée : 90mn (travail individuel) ; 45mn (travail en groupe)
b-La traduction
Chez les eucaryotes, l'ARN messager, transcrit et maturé dans le noyau, est transféré dans le
cytoplasme avant d'être traduit. La traduction se déroule au sein des ribosomes, complexes
ribonucléiques, qui servent de support à l'assemblage ordonné des acides aminés du polypeptide
codé par l'ARNm. Cette synthèse s'effectue en présence de différents types de facteurs protéiques.
L'hydrolyse des nucléosides triphosphates, ATP ou GTP en nucléosides diphosphates, ADP ou
GDP, fournit l'énergie nécessaire aux différentes étapes de la biosynthèse des protéines.
Les acteurs de la transmission du message génétique à travers la traduction du code:
• l'ARN messager (ARNm) porte la séquence informative, succession des codons spécifiant
chaque acide aminé de la protéine;
• les ARN de transfert (ARNt) sont capables d'établir la correspondance entre un codon et un
acide aminé précis;
• les aminoacyl-ARNt synthétases assurent la fixation d'un acide aminé aux ARNt
correspondants. Elles assurent la spécificité de la liaison entre un ARN de transfert donné et
l'acide aminé correspondant.
31
Les principales étapes de la traduction
Démarrage ou initiation
Les deux sous-unités du ribosome sont indispensables à la traduction et vont se mettre en place
au moment de la phase d'initiation de ce processus. Dans le cytoplasme, en absence de
traduction, l'association d'une protéine supplémentaire, le "facteur d'initiation" IF3, avec la petite
sous unité empêche l'assemblage spontané des ribosomes. La petite sous-unité du ribosome
reconnaît l'ARN messager et s'y fixe. Les modalités de la reconnaissance du site de démarrage
de la traduction sur l'ARNm diffèrent chez les procaryotes et chez les eucaryotes :
La grande sous-unité vient compléter le ribosome, elle présente deux sites de reconnaissance
et de traitement de chaque ARN de transfert chargé en acide aminé, les sites A et P qui
permettent de recevoir des ARN de transfert avec un espacement correspondant exactement à
deux triplets successifs. Au départ, le site P (par lequel la Protéine naissante sort du complexe
de traduction) ne peut être reconnu que par un ARN de transfert caractéristique de l'initiation
(ARNti) systématiquement chargé en méthionine (chez les eucaryotes) ou en formyl-méthionine
(chez les procaryotes). Cet ARN chargé est différent de celui qui sera utilisé en cours de
synthèse pour apporter une méthionine là où le code le demande bien que le codon spécifiant
la méthionine (A U G) soit unique, du fait des structures tertiaires de l'ARNt d'initiation (ARNtimet)
et des autres. Des facteurs protéiques d'initiation (IF), formant un complexe avec l'ARNti chargé
(en méthionine ou en formyl methionine) jouent un rôle essentiel dans la reconnaissance du site
32
P. Lorsque cet assemblage est effectué, un second ARNt chargé vient occuper le site A (sur
lequel arrivent les Acides Aminés). La sélection de cet ARNt repose sur l'appariement codon-
anticodon de telle sorte que l'acide aminé spécifié par le deuxième codon est en contact avec la
méthionine d'initiation, une liaison peptidique peut s'établir entre les deux acides aminés. C'est
une aminoacyl peptidyl-transférase qui catalyse l'établissement de cette liaison.
Fig.16 : Initiation de la traduction
Allongement ou élongation
L'élongation nécessite la translocation du ribosome qui se décale exactement d'un triplet de
nucléotides. Il en résulte que : le site P contient maintenant le second ARNt chargé s'un dipeptide
et le site A est maintenant libre de recevoir un troisième ARNt chargé d'un troisième acide aminé
(spécifié par le codon "en cours" face au site A) ce qui entraîne une deuxième liaison peptidique, les
ARNt amont (côté site P) sont libérés. Ici encore, des facteurs protéiques, spécifiques de l'élongation
(EF) forment des complexes avec les ARNt chargés pour assurer l'installation dans le site A. Les
translocations du ribosome se poursuivent avec adjonction séquentielle d'acides aminés à la chaîne
peptidique en cours jusqu'à la terminaison. De nouveaux ribosomes démarrent de nouvelles
séquences d'initiation - élongation... avant que les précédents aient terminé
33
Fig.17: Elongation des chaînes polypeptidiques
Arrêt ou terminaison
L'arrêt de la traduction est indiqué dans l'ARN messager par un des trois codons stop : UAG ou
codon "ambre", UAA ou "ochre" et UGA ou "opale" (terminologie liée à l'historique de leur
découverte). Aucun ARN de transfert ne possède d'anticodon correspondant à ces triplets 'non-
sens', un facteur protéique de relargarge ("Release Factor" en anglais, d'où l'abréviation RF) vient
occuper le site A, la translocation du ribosome s'arrête, la protéine est relachée ainsi que le dernier
ARNt et les deux sous-inités du ribosome se séparent.
Fig.18: Terminaison de la traduction
Activité
Consigne : à l’aide de la note de cours, des Moocs et supports vidéo reçus et de vos recherches
personnelles sur internet, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-après
1- Comparez la traduction chez la cellule eucaryote et la cellule procaryote
2- Décrivez les différentes étapes de la traduction chez la cellule procaryote
Durée : 45mn (travail individuel) ; 20mn (travail en groupe)
34
4-Regulation
4-1Régulation de l'expression des gènes chez les procaryotes
Les micro-organismes sont capables de contrôler l’expression de leurs gènes. Ce contrôle permet
essentiellement à la cellule d’ajuster ses synthèses en fonction des besoins nutritionnels, face à un
environnement changeant, de façon à assumer la croissance et la division cellulaire. Le contrôle de
l’expression des enzymes permet un ajustement rapide des activités métaboliques en réponse aux
fluctuations des niveaux intracellulaires des sucres, d’acides aminés ou de nucléotides.
Certaines enzymes ne sont synthétisées que lorsque leurs substrats sont présents dans la cellule,
ces enzymes sont dites inductibles. D’autres enzymes ne sont synthétisées que lorsque leur produit
final est absent, elles sont dites répressibles. Enfin, certaines enzymes sont produites par des gènes
qui ne sont pas régulés, elles sont donc produites continuellement, que leur substrat soit présent ou
pas. Ces enzymes sont dites constitutives. Les enzymes constitutives sont généralement celles dont
la cellule a continuellement besoin, comme celles du métabolisme du glucose.
Chez les procaryotes les gènes sont groupés en unités fonctionnelles appelées opérons. L’opéron
est une unité de régulation d’un ensemble de gènes adjacents qui seront transcrits à l’aide d’un
même promoteur sous forme d’un seul ARNm (polycistronique), puis traduit en plusieurs protéines
différentes. Cette unité comprend des gènes de structure (CISTRONS), un ou plusieurs gènes
régulateurs codant pour des protéines régulatrices et des éléments de contrôle présent dans la
séquence d’ADN. Il existe deux grands types d'opérons : les opérons inductibles qui codent pour
des enzymes de la voie catabolique (dégradation) tel que l’opéron lactose et les opérons répressibles
qui codent pour des enzymes de la voie anabolique (biosynthèse) tel que l’opéron tryptophane.
4-1-1 Régulation de l'expression de l'opéron lactose (lac ZYA)
Structure de l'opéron lactose :
L’opéron lactose est constitué des éléments suivants :
1. Trois gènes de structure représentés par : le gène lac Z qui code pour la bêta galactosidase
qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose, le gène lac Y qui code pour une perméase
35
qui permet le passage du lactose à travers la membrane cellulaire et le gène lac A qui code
pour la transacétylase ;
2. Un gène régulateur (gène I) qui code pour une protéine appelée répresseur ;
3. Un promoteur des gènes de structures qui permet la fixation de l'ARN polymérase ou le
répresseur ;
4. Un opérateur.
Figure 18 : Structure de l’Opéron lactose
Caractéristiques de l'opéron lactose
Les gènes de l'opéron lac ont un fort niveau d'expression seulement en présence du lactose, et en
absence du glucose (la source de carbone et d'énergie préférée).
L'opéron lac ne possède pas un promoteur fort pour cette raison la fixation de l'ARN polymérase doit
être stimulée par une protéine d'activation spécifique, appelé protéine réceptrice d'AMPc (CRP) ou
protéine activatrice du catabolisme (CAP) qui se fixe sur le site CAP.
Régulation de l'opéron lactose
En présence de glucose et absence de lactose :
36
Le gène I code pour une protéine, le répresseur qui se lie à l'opérateur (sous une forme
tétramèrique), ce qui empêche l'ARN polymérase (fixée au promoteur) de progresser pour effectuer
la transcription. Donc les trois enzymes ne sont pas produites car leurs gènes correspondants ne
s'expriment pas, ils sont réprimés.
37
Fig 19 : Fonctionnement de l’opéron lac en présence de glucose et absence de lactose
En présence de lactose et absence de glucose
En présence de lactose une molécule inductrice est synthétisée par un réaction de
transglycosylation à partir du lactose (β, 1-4), il s‘agit de l'allolactose (β-Dgalactopyranosyl– (1-6)- β-
glucopyranose). Cette molécule va se fixer sur le répresseur et l'inactive de sorte qu'il ne puisse plus
se fixer à la séquence de l'opérateur. Permettant ainsi à l’ARN polymérase activée d’initier la
synthèse de l'ARN (la synthèse des enzymes).
En absence du glucose, les niveaux d'AMPc (synthétisée à partir de l'ATP par l'adénylate cyclase)
augmentent, aboutissant à la fixation de la CAP à l'AMPc. Le complexe CAP-AMPc se fixe sur le site
CAP. Induisant une forte fixation de l'ARN polymérase au promoteur pour augmenter le taux de la
transcription (x50 fois).
38
Fig 20 : Fonctionnement de l’opéron lac en présence de lactose et en absence de glucose
En présence de glucose et lactose
La présence du lactose induit la synthèse de l'allolactose qui se fixe au répresseur induisant sont
inactivation donc il se détache de la séquence de l'opérateur permettant à l’ARN polymérase activée
d’initier la synthèse de l'ARN et des enzymes.
Cependant, en présence de glucose les niveaux d'AMPc diminuent et le complexe CAP-
AMPc ne se forme pas et il ne se fixe pas sur le site CAP. Et donc la transcription n’est pas accélérée
(faible taux de transcription).
39
4-1-2 Régulation de l'expression de l'opéron Tryptophane
Structure de l'opéron Tryptophane
L’ensemble des gènes qui codent pour les enzymes de la voie de synthèse de tryptophane constitue
l’opéron trp.
L’opéron Tryptophane est constitué des éléments suivants :
1-Gènes de structure : cinq gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse du
tryptophane (TrpE, TrpD, TrpC, TrpB et TrpA) ;
2-Gène régulateur TrpR, très éloigné de l’opéron trp et codant pour un aporépresseur (répresseur
Trp). (Lorsque le gène trpR est transcrit, il y a production d’un répresseur sous forme inactive qui n’a
pas d’affinité pour l’opérateur trp. Il ne prend sa forme active que s’il s’unit à une molécule de
tryptophane) ;
3. Un promoteur ;
4. Un opérateur (la région de l’opérateur se situe à l’intérieur du promoteur).
Fig 21 : Structure de l'opéron Tryptophane
Régulation de l'opéron Tryptophane
Régulation par répression
40
Les gènes de l'opéron Trp sont contrôlés par un répresseur et ne s'expriment qu'à l'épuisement de
tryptophane (l'absence du tryptophane qui arrête la répression).
En absence du tryptophane
Le répresseur est incapable de se fixer sur l’opérateur trp, l’ARN polymérase peut se lier au
promoteur et transcrire les 5 gènes de structure.
Fig 21 : Fonctionnement de l'opéron Tryptophane en absence du tryptophane
En présence du tryptophane
Lorsqu’il y a du tryptophane dans la cellule, il se fixe au répresseur Trp, cela forme un
complexe répresseur fonctionnel qui se lie à l’opérateur trp et réprime la transcription des cinq gènes
de structure de l’opéron. Le tryptophane, (le produit final des enzymes codées par l’opéron trp) agit
ainsi comme un co-répresseur, c’est ce qui fait que lorsqu’on fournit à la bactérie du tryptophane, elle
s’arrête d’en produire. Si la concentration en tryptophane dans le milieu diminue, le tryptophane se
dissocie du répresseur Trp, celui-ci quitte l’opérateur trp et la transcription des gènes de structure de
l’opéron trp reprend. Les enzymes de la voie de synthèse du tryptophane constituent donc un
exemple d’enzymes répressibles, c'est-à-dire que leur synthèse est inhibée par la présence du
tryptophane.
41
Fig 22 : Fonctionnement de l'opéron Tryptophane en présence du tryptophane
Régulation par atténuation
L'atténuation est un mécanisme de régulation de l'expression des gènes présent en particulier chez
les bactéries. Elle consiste en une terminaison prématurée de la transcription, en amont des gènes
de structure. Il n'y a alors pas de synthèse d'un ARN messager complet et donc pas d'expression.
L'atténuation dépond de la capacité de l'ARN à former des structures secondaires entre des régions
complémentaires Si les taux de tryptophane sont élevés, la plupart des transcrits terminent leur
synthèse de façon prématurée (incomplète). Au contraire, si les taux sont insuffisants, la polymérase
transcrit les gènes en entier.
4-2Régulation de l'expression des gènes chez les eucaryotes
La régulation de la synthèse des protéines chez les eucaryotes est beaucoup plus complexe que
chez les procaryotes. Chez les eucaryotes supérieurs, les cellules sont spécialisées pourtant, elles
contiennent toutes les mêmes chromosomes et donc le même ADN et les mêmes gènes. En effet, la
cellule n’exprime pas tous ces gènes en même temps, cette expression est strictement contrôlée, et
elle diffère d’un type cellulaire à un autre, ceci constitue la base du développement embryonnaire et
de la différenciation cellulaire.
Structure des gènes eucaryotes
1-Les gènes eucaryotes sont constitués de segments d’ADN codants (exons ) et non codants
(introns).
42
2-La présence d’introns intercalés le long de la séquence codante constitue la différence la plus
frappante entre un gène eucaryote et un gène procaryote. L’ARN polymérase reconnaît et se lie à
une séquence qui se trouve en amont du gène appelée promoteur.
Ce promoteur donne le signal à l’ARN polymérase qui transcrit alors les introns en même temps que
les séquences exons. Les introns seront enlevés plus tard au cours de la maturation de l’ARN-pré-
messager.
3-Une autre caractéristique propre aux gènes eucaryotes est la présence de séquences régulatrices
non codantes supplémentaires qui peuvent se trouver à des milliers de bases à distances du
promoteur. Ces séquences appelées amplificateurs (ou ENHANCERS) exercent une forte influence
et permettent d’amplifier la transcription du gène.
Régulation de l’expression des gènes eucaryotes
Il n’y a pas de modèle général de régulation génétique chez les eucaryotes comme c’est le cas chez
les procaryotes. La régulation de l’expression des gènes eucaryotes peut se faire à plusieurs niveaux
à savoir : au niveau chromatinien, au niveau transcriptionnel (Maturation de l’ARN pré-messager ;
Transport de l’ARNm du noyau vers le cytoplasme), au niveau traductionnel et au niveau post-
traductionnelle.
Chez les cellules eucaryotes :
• de nombreuses protéines sont fixées sur l'ADN. C’est le cas des histones qui participent à la
formation de la chromatine. Seule une petite partie de l'ADN est nue ;
• une grande partie des séquences d'ADN n'est pas traduite du fait que le gène est discontinu
(fragmenté) en exons (traduits et transcrits) et en introns (transcrits mais non traduits) ;
• Il existe des mécanismes qui permettent le réarrangement de segments d'ADN de manière
contrôlée ; processus de réparation (coupure, réunion et excision, épissage) ;
• les régions régulatrices sont beaucoup plus grandes et peuvent être situées à une centaine
de paires de bases des promoteurs. Les protéines régulatrices se fixent au niveau de ces
régions, mais à une distance trop grande pour interagir directement sur le promoteur ;
43
• les ARNm sont synthétisés dans le noyau et doivent être transportés à travers la membrane
nucléaire vers le cytoplasme pour y être traduits. Une telle compartimentation n'existe pas
chez les procaryotes ;
• la région 5' en amont du site d'initiation de la transcription est une région de contrôle de la
transcription très complexe. Elle est formée de divers motifs de nucléotides dits "cis-
régulateurs" qui serviront de cibles à des facteurs dits "trans-régulateurs" ;
• la fixation de ces facteurs trans-régulateurs (protéines et diverses autres substances non
protidiques) provoquera selon les cas un démarrage, une activation (quelques rares fois une
diminution) de la transcription ;
• différents éléments cis-régulateurs (séquences nucléotidiques) sont maintenant connus. Ils
sont retrouvés dans plusieurs gènes, mais chaque gène, dans une cellule animale, possède
une combinaison particulière d'éléments cis-régulateurs uniques dans leur type, leur nombre
et leur localisation
Activité
Consigne : à l’aide de la note de cours et de vos recherches personnelles, répondez individuellement
puis en groupe aux questions ci-après
1- Qu’est-ce qu’une enzyme ?
2- Décrivez les différentes enzymes retrouvées chez les procaryotes en tenant compte de leur
mode de fonctionnement
3- Qu’est-ce qu’un opéron ?
4- Décrivez la structure et le fonctionnement des opérons lactose et tryptophane
Durée : 60mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe)
44
CHAPITRE 2 : LES MUTATIONS
- Propriétés des mutations
- Notion de mutation germinale et de mutation somatique
- Les agents mutagènes et leurs modes d’action
- Notion d’épigénétique
- Les différents types de mutations et leurs conséquences
45
CHAPITRE 2 : LES MUTATIONS
2-1-Notion de mutation génétique
Une mutation génétique est une modification rare, accidentelle ou provoquée, de l'information
génétique (séquence d’ADN ou d’ARN) dans le génome. Selon la partie du génome touchée, les
conséquences d'une mutation peuvent varier.
2-2- Notion de mutation germinale et de mutation somatique
On parle de mutation germinale ou mutation de novo, quand la mutation porte sur l'ADN des cellules
souches d'un gamète. Dans ce cas, l'embryon sera porteur de la mutation alors qu'aucun de ses
parents ne la possédait dans son patrimoine génétique. Ce type de mutation survient lors de la
formation ou de la vie des gamètes d'un des deux parents (ovule ou spermatozoïde).
Dans ce cas, il semblerait que les mutations apportées par le spermatozoïde prédominent ; selon
une étude, environ 80 % des aberrations chromosomiques des chromosomes des descendants
proviendraient du matériel chromosomique apporté par le spermatozoïde et la proportion de
spermatozoïdes anormaux serait corrélée à l'âge du parent mâle. Toutefois, les anomalies apportées
par la mère restent fréquentes et tendent également à augmenter avec l'âge.
Les mutations somatiques ne touchent pas les cellules destinées à la reproduction, elles ne sont
donc jamais héréditaires :
les mutations post-zygotiques sont les mutations qui apparaissent dans l'œuf après sa fécondation.
Elles sont plus rares et s'expriment sous forme de mosaïque chez l'individu concerné. Des mutations
peuvent apparaître tout au long de la vie sur l'ADN de n'importe quelle cellule ; elles sont alors
transmises à la lignée des cellules filles. Ces dernières peuvent, dans certains cas, devenir
des cellules tumorales puis former un cancer.
46
Chez les animaux pluricellulaires, les mutations de la lignée germinale peuvent être transmises à la
descendance, contrairement aux mutations somatiques.
2-3-Origine des mutations
Les mutations naturelles sont aléatoires, mais leur fréquence d'apparition peut être augmentée par
des mutagènes, parfois qualifiés d’agents ou de facteurs mutagènes. Ces agents peuvent être
physiques (rayonnements ionisants), chimiques (agents alkylants, dérivés réactifs de l'oxygène...)
ou biologiques(Virus en général).Des procédés permettent aujourd'hui de provoquer des mutations
non aléatoires et contrôlées (Type et Nature de la mutation). Ces procédés sont notamment
fortement utilisés dans l'étude du vivant, par exemple pour comprendre les fonctions d'un gène.
2-3-1-Les mutagènes chimiques
On les distingue par leur mode d’action. Certains agissent par des mécanismes semblables aux
mécanismes spontanés, d’autres agissent davantage comme les radiations.
1 - Les analogues des bases :
Leur structure chimique rappelle les purines et pyrimidines. Ils peuvent être incorporés à l’ADN lors
de la réplication. Le bromo-uracile (BU), semblable à T (Br remplace CH3), s’apparie à A. Il a une
forte tendance à se tautomériser en « enol ». Elle s'apparie alors à G. L’aminopurine, analogue de
A s’apparie avec T et cause des transitions de A-T en G-C ou l’inverse.
2 - Les substances chimiques altérant la structure et l’appariement des bases :
L’acide nitreux provient de la digestion des nitrites (conservateurs des aliments). Il est à l’origine
de déaminations(= perte d'un groupe NH3)(ex : C ->U ; meC->T ; A-> hypoxanthine). La
nitrosoguanidine, le methyl-methanesulfonate, l’ethyl- methanesulfonate réagissent avec les bases
en ajoutant des groupements methyl ou ethyl. La dégradation peut aller jusqu’à la production de
sites sans bases ce qui, à la réplication, est générateur de mutations.
3 - Les agents intercalants :
Acridine, proflavine, bromide d’ethidium sont des molécules qui s’insèrent entre les bases de l’ADN.
47
Ceci entraîne un étirement de l’ADN. La polymérase insère alors une base surnuméraire en face de
la molécule étrangère.
4 - Les agents qui altèrent la structure de l’ADN :
Certaines grosses molécules se lient aux bases et qui deviennent ainsi « non codantes » (ex :
NAAAF). D'autres agents causent des liaisons intra et inter brins (ex : le psoralène trouvé dans les
végétaux et utilisé dans les traitements de la peau). Des produits chimiques causent des ruptures
dans l’ADN ( ex : peroxydes). Ces agents n’induisent sans doute pas directement les mutations
mais induisent des processus de réparation qui sont mutagéniques.
2-3-2 Les radiations :
Elles sont le principal agent mutagène.
1 - Le spectre électromagnétique :
La lumière visible et les autres formes de radiations sont des radiations électromagnétiques. Leur
longueur d'onde varie et est inversement proportionnelle à leur énergie. Parmi les courtes
longueurs d'onde, l'énergie est croissante dans cet ordre : ondes FM, TV, micro-ondes, Infrarouge,
visible, UV, rayons X et gamma. La fraction biologiquement active est constituée par les UV, les
rayons X et gamma.
2 - Les radiations ionisantes
Les rayons X et gamma sont assez énergétiques pour produire des ions réactifs (atomes chargés
ou molécules) quand ils interagissent avec les molécules biologiques. On parle ainsi de radiations
ionisantes. On regroupe également sous ce terme les radiations corpusculaires, flux de particules
atomiques et subatomiques émises par les éléments radioactifs. Elles sont de deux types : les
particules alpha (noyau de l'hélium 2H+ + 2 neutrons) et les particules bêta (des électrons).
Les UV ne sont pas ionisants mais peuvent réagir avec l'ADN ou d'autres molécules biologiques.
L'unité utilisée pour évaluer les radiations ionisantes est le rem (roentgen equivalent man) : 1 rem
de n'importe quelle radiation ionisante produit le même effet biologique.
48
3 - Les sources de radiations :
Les sources naturelles produisent des radiations "d'arrière-plan". Ce sont les rayons cosmiques
(incluant le rayonnement solaire), les éléments radioactifs du sol ou des produits du sol (bois,
pierre) et de l'atmosphère (radon). Les autres sources sont artificielles : rayons X pour le
diagnostic, essais nucléaires, TV, etc. Dans l'ensemble, le taux moyen d'exposition est de 350
mrem/an, l'essentiel étant dû au radon.
4 - Effets biologiques des radiations :
Les dégâts causés aux cellules par les radiations sont le résultat de la production de radicaux
libres issus de l'eau (le radical OH ou hydroxyl). Les radicaux libres possèdent des électrons non
appariés et sont chimiquement très réactifs. Ils interagissent avec l'ADN, les protéines et les lipides
des membranes. Les dégâts causés ont pour conséquences l'atteinte d'organelles, le blocage de la
division cellulaire ou la mort de la cellule. Les cellules à cycle cellulaire court (cellules souches de
la moelle osseuse, lignée du tractus gastro-intestinal) sont les plus touchées. La sévérité des effets
dépend de la dose reçue.
5 - Les effets génétiques des radiations ionisantes :
Les radiations ionisantes ont de nombreux effets sur l'ADN à la fois par les radicaux libres qu'elles
créent et par action directe :
• ruptures dans l'un ou les deux brins (qui peuvent conduire à des réarrangements,
délétions, perte de fragments de chromosome, ou la mort de la cellule en l'absence de
réparation) ;
• altération ou perte de bases (mutations) ;
• enchevêtrement de l'ADN avec lui-même ou avec des protéines
Il y a une relation entre la dose de rayonnement et le taux de mutations, l'effet des radiations étant
cumulatif.
49
6 - Les effets des UV :
Ils ne sont pas parmi les plus énergétiques et ne sont pas ionisants, mais leurs longueurs d'onde
sont absorbées préférentiellement par des bases de l'ADN et par les acides aminés aromatiques
des protéines. La plupart des lésions létales sont des dimères entre bases pyrimidiques ( T-
T ou T-C) dans l'ADN, résultat de l'établissement d'une liaison covalente entre pyrimidines
adjacentes sur un brin. Ces dimères comme la majeure partie des lésions d'origine chimique,
bloquent la transcription et la réplication. Elles sont létales si elles ne sont pas réparées. Elles
genérent aussi des mutations et des réarrangements chromosomiques.
2-3-3-Les mutagènes biologiques
Les sources possibles d'agents mutagènes biologiques peuvent être toutes les préparations de
nature biologique utilisées en médecine prophylactique ou thérapeutique, telles
que vaccins, antitoxines, sang, sérum et antigènes. Les agents biologiques mutagènes potentiels
peuvent être des micro-organismes, en particulier des virus.
Dans le cas des virus, il a été démontré qu'ils peuvent produire des anomalies chromosomiques, de
la simple casse à la pulvérisation des chromosomes, de sorte que la vaccination avec des virus
vivants peut impliquer un risque potentiel. La contamination virale résultant de transfusions, telle que
l'hépatite, provoque des déchirures chromosomiques dans le sang et la moelle osseuse de patients
atteints d'hépatite. Les molécules d'ADN recombinantes présentent un risque potentiel, car de
nombreux types d'ADN de cellules animales contiennent des séquences communes aux virus
tumoraux.
2-4Notion d’épigénétique
L'épigénétique est l'étude de la relation entre génotype (l'information du génome d'un individu) et le
phénotype (l'ensemble des caractéristiques observables de l'organisme de l'individu).
Le génotype représente l'ensemble de la composition génétique d'un individu. Le génotypage est
donc la discipline qui vise à déterminer la nature d'une variation génétique à une position spécifique
dans le génome, pour un individu donné. On estime que les différences entre deux êtres humains
50
sont d'environ 3 millions de nucléotides sur les 3 milliards constituant leur génome. Le phénotype est
l'ensemble des caractéristiques observables d'un organisme (anatomiques, morphologiques,
moléculaires ou physiologiques). Il est déterminé à la fois par les gènes et par l'environnement. Le
terme épigénétique a été proposé pour la première fois par Conrad Hal Waddington dans les années
1940 comme "la branche de la biologie qui étudie les relations de cause à effet entre les gènes et
leurs produits, lesquelles donnent naissance au phénotype". Aujourd'hui, la définition la plus courante
de l'épigénétique est "l'étude des changements héréditaires dans la fonction des gènes, ayant lieu
sans altération de la séquence de l'ADN". Pour prendre une métaphore, la génétique renvoie à
l'écriture des gènes, l'épigénétique à leur lecture. L'accessibilité d'un gène dans le noyau d'une
cellule, et donc sa capacité à être transcrit puis traduit en une protéine, va dépendre de modifications
chimiques de l'ADN (par exemple, la méthylation) et de protéines qui entourent l'ADN. L'épigénome
est l'ensemble des modifications épigénétiques d'une cellule. L'hérédité épigénétique est
fondamentale au niveau cellulaire, car elle contribue dans l'organisme à la mémoire de l'identité des
cellules. Les modifications épigénétiques sont influencées par l'environnement intrinsèque ou
extrinsèque. Notre mode de vie pourrait ainsi laisser dans nos cellules une "trace épigénétique"
éventuellement transmissible d'une génération à l'autre.
2-5 Les différents types de mutations et leurs conséquences
Il existe plusieurs types de mutations.
2-5-1-Les mutations par substitution
Dans cette mutation, l’anomalie est provoquée par le remplacement d’un nucléotide par un autre.
Imaginons un gène de 36 nucléotides ou TOP designe le codon initiateur et OUT le codon
stop:
TOP CET ADO FOU TUA TON AMI QUI FUT TON PSY OUT
51
 Mutation faux-sens
A la position 16, le simple fait de mettre un « M » à la place d’un « T » modifie une partie du sens de
la phrase. La phrase garde un sens mais il est différent de l’original. … TOP CET ADO FOU TUA
MON AMI QUI FUT TON PSY OUT. En génétique, on parle de mutation « faux-sens ». Le codon
modifié « MON » produit un acide aminé (un sens) différent de celui produit par « TON » donc la
protéine sera modifiée. Ainsi une des mutations du gène OPA1 s’écrit : c.1334 G>A ce qu’on lit : le
nucléotide G (guanine) qui était à la 1334ème position sur le gène a été remplacée par le nucléotide
A (adénine).
 Mutation non-sens
A la position 25, le remplacement de la lettre « F » par la lettre « O » introduit donc un signal
d’arrêt. On parle de mutation « non-sens ».
TOP CET ADO FOU TUA TON AMI QUI OUT/ TON PSY OUT/
En cas de mutation non-sens, la lecture s’arrête et la protéine produite est incomplète.
En génétique, on représente les coodns d’arrêt par la lettre "X". Dans ce cas on note la mutation en
comptant des codons (groupe de 3 nucléotides) et non des nucléotides isolés.
On note l’acide aminé produit par le codon concerné.
 Mutation silencieuse
TOP CET ADO FOU TUE TON AMI QUI FUT TON PSY OUT
A la position 15, nous mettons un « E » à la place d’un « A ». Le temps de la phrase change mais le
passage du passé simple au présent ne modifie pas le sens général. De même, en génétique,
certaines modifications sont sans effet sur la qualité des protéines produites. On parle de mutation
silencieuse.
2-5-2-Les mutations par insertion
Cette mutation est provoquée par l’ajout d’une ou plusieurs lettres dans la phrase. La phrase n’a plus
aucun sens. Une insertion décale la lecture vers la droite, la découpe des mots n’a plus de sens.
Dans notre exemple ci-dessous, nous avons inséré les lettres « VI » aux positions 10 et 11
52
TIN DEN /TOP CET ADO VIF OUT /UAT ONA MIQ UIF UTT ONP SYO. On écrira, par exemple,
546_547insT qui se lit : « insertion d’un nucléotide T (thymine) entre les positions 546 et 547 »
2-5-3-Les mutations par délétion
Dans notre exemple ci-dessous, nous avons ôté la lettre "F" qui était à la position 10. Comme dans
le cas de l’insertion la lecture est décalée mais vers la gauche. On écrira, par exemple, 586_591del
qui se lit : « six nucléotides manquent entre les positions 586 et 591 inclues
/TOP CET ADO OUT /UAT ONA MIQ UIF
Activité
Consigne : à l’aide de la note de cours et de vos recherches personnelles répondez individuellement
puis en groupe aux questions ci-après
1- Mutation : définition et propriétés
2- Quelle différence faites-vous entre mutation germinale et somatique
3- Quel est le mode d'action des agents mutagènes
4- Donnez les différents types de mutation et leur conséquence
5- Qu’avez-vous compris de la notion d’épigénétique ?
Durée : 60mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe)

Contenu connexe

Similaire à COURS DE GENETIQUE MOLECULAIRE_Document etudiant.pdf

Origine de la vie
Origine de la vieOrigine de la vie
Origine de la vie
Aya299
 
ConfEvolutionPrecoceGouy
ConfEvolutionPrecoceGouyConfEvolutionPrecoceGouy
ConfEvolutionPrecoceGouy
vguili
 
Génie génétique
Génie génétiqueGénie génétique
Génie génétique
PierreComeau
 
Chevaliez Du 2009
Chevaliez Du 2009Chevaliez Du 2009
Chevaliez Du 2009
odeckmyn
 
François Brial Biologiste cv
François Brial Biologiste cvFrançois Brial Biologiste cv
François Brial Biologiste cv
François Brial
 
Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012
Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012
Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012
jamal sh
 
1cours virologie généralités (1)
1cours virologie généralités (1)1cours virologie généralités (1)
1cours virologie généralités (1)
imlen gan
 
HDR_Titre_et_travaux_-_Gael_Nicolas
HDR_Titre_et_travaux_-_Gael_NicolasHDR_Titre_et_travaux_-_Gael_Nicolas
HDR_Titre_et_travaux_-_Gael_Nicolas
Gaël NICOLAS
 
Thèse biophysique elhasnaoui khalid &
Thèse biophysique elhasnaoui khalid &Thèse biophysique elhasnaoui khalid &
Thèse biophysique elhasnaoui khalid &
Khalid El Hasnaoui
 
IRCM - Qui sommes-nous?
IRCM - Qui sommes-nous?IRCM - Qui sommes-nous?
IRCM - Qui sommes-nous?
IRCM
 

Similaire à COURS DE GENETIQUE MOLECULAIRE_Document etudiant.pdf (20)

Origine de la vie
Origine de la vieOrigine de la vie
Origine de la vie
 
ConfEvolutionPrecoceGouy
ConfEvolutionPrecoceGouyConfEvolutionPrecoceGouy
ConfEvolutionPrecoceGouy
 
Génie génétique
Génie génétiqueGénie génétique
Génie génétique
 
Chevaliez Du 2009
Chevaliez Du 2009Chevaliez Du 2009
Chevaliez Du 2009
 
BCH205 ACIDE NUCLEIQUE ET SYNTHESE.pdf
BCH205 ACIDE NUCLEIQUE ET   SYNTHESE.pdfBCH205 ACIDE NUCLEIQUE ET   SYNTHESE.pdf
BCH205 ACIDE NUCLEIQUE ET SYNTHESE.pdf
 
Epidémiologie moléculaire
Epidémiologie moléculaireEpidémiologie moléculaire
Epidémiologie moléculaire
 
François Brial Biologiste cv
François Brial Biologiste cvFrançois Brial Biologiste cv
François Brial Biologiste cv
 
Ontologie des virus : choses, êtres, processus ou information ?
Ontologie des virus : choses, êtres, processus ou information ?Ontologie des virus : choses, êtres, processus ou information ?
Ontologie des virus : choses, êtres, processus ou information ?
 
Bioécologie des anophèles et capacité vectorielle
Bioécologie des anophèles et capacité vectorielleBioécologie des anophèles et capacité vectorielle
Bioécologie des anophèles et capacité vectorielle
 
Revue des recommandations éthiques dans le contexte des études génomiques
Revue des recommandations éthiques dans le contexte des études génomiquesRevue des recommandations éthiques dans le contexte des études génomiques
Revue des recommandations éthiques dans le contexte des études génomiques
 
Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012
Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012
Upl8972466076474595746 intranet pk_16_01_2012
 
1cours virologie généralités (1)
1cours virologie généralités (1)1cours virologie généralités (1)
1cours virologie généralités (1)
 
HDR_Titre_et_travaux_-_Gael_Nicolas
HDR_Titre_et_travaux_-_Gael_NicolasHDR_Titre_et_travaux_-_Gael_Nicolas
HDR_Titre_et_travaux_-_Gael_Nicolas
 
Thèse biophysique elhasnaoui khalid &
Thèse biophysique elhasnaoui khalid &Thèse biophysique elhasnaoui khalid &
Thèse biophysique elhasnaoui khalid &
 
Rendement parasitaire chez l'anophèle
Rendement parasitaire chez l'anophèleRendement parasitaire chez l'anophèle
Rendement parasitaire chez l'anophèle
 
CV MA
CV MA CV MA
CV MA
 
IRCM - Qui sommes-nous?
IRCM - Qui sommes-nous?IRCM - Qui sommes-nous?
IRCM - Qui sommes-nous?
 
Presentation mémoires 2012
Presentation mémoires 2012Presentation mémoires 2012
Presentation mémoires 2012
 
Réponse immunitaire et accès pernicieux
Réponse immunitaire et accès pernicieuxRéponse immunitaire et accès pernicieux
Réponse immunitaire et accès pernicieux
 
The Catalyst November 2016 Issue
The Catalyst November 2016 IssueThe Catalyst November 2016 Issue
The Catalyst November 2016 Issue
 

COURS DE GENETIQUE MOLECULAIRE_Document etudiant.pdf

  • 1. UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI SUPPORT DE COURS DE GENETIQUE MOLECULAIRE LICENCE PROFESSIONNELLE EN GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE NIVEAU LP2 ELABORE PAR Dr. (MC) Camus M. ADOLIGBE ANNEE UNIVERSITAIRE 2023-2024
  • 2. 1 UNITE D’ENSEIGNEMENT(UE) : GENETIQUE MOLECULAIRE CODE UE (GEM 1300) SOMMAIRE DEFINITION OBJECTIF GENERAL OBJECTIF SPECIFIQUES MODALITES D’ENSEIGNEMENT-APPRENTISSAGE METHODES D’EVALUATION BIBLIOGRAPHIE & WEBOGRAPHIE PLAN DE COURS CHAPITRE 1 : NATURE CHIMIQUE, STRUCTURE ET FONCTIONNEMENT DU MATERIEL GENETIQUE - Nature chimique du matériel génétique - Structure du matériel génétique - Fonctionnement du matériel génétique CHAPITRE 2 : LES MUTATIONS - Propriétés des mutations - Notion de mutation germinale et de mutation somatique - Les agents mutagènes et leurs modes d’action - Notion d’épigénétique - Les différents types de mutations et leurs conséquences
  • 3. 2 CHAPITRE 3 : REGULATION DE L’EXPRESSION DU GENE - Les procaryotes - Les eucaryotes CHAPITRE 4 : THERAPIE GENIQUE - Réalisations cliniques - Perspectives futures CHAPITRE 5 : REALISATION DE LA PCR ET DE L’ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE - Travaux pratiques de réalisation de PCR - Travaux pratiques de réalisation de l’électrophorèse sur gel d’agarose
  • 4. 3 DEFINITION La génétique moléculaire est une branche de la biologie et de la génétique, qui consiste en l'analyse de la structure et de la fonction des gènes, normaux ou mutants, au niveau moléculaire. Dans le contexte de la biologie médicale, elle fait partie de la génétique biologique, et consiste en l'analyse du matériel génétique humain directement au niveau des acides nucléiques à partir de liquides biologiques dans le but de caractériser l'origine génétique d'une maladie. OBJECTIF GENERAL A l’issu du cours l'étudiant doit être capable de décrire les connaissances de base en génétique moléculaire et d’en retenir les applications potentielles en sciences biomédicales OBJECTIFS SPECIFIQUES À la fin du cours, les étudiants seront capables de : • décrire la structure des gènes et leur fonctionnement ; • expliquer les mécanismes qui modulent l'expression des gènes ; • identifier les techniques d'analyse des acides nucléiques ; • expliquer la thérapie génique ; • manipuler un thermocycleur et un dispositif d’électrophorèse sur gel d’agarose MODALITES D’ENSEIGNEMENT-APPRENTISSAGE Cours magistral effectué sur la base du support de cours, des vidéos et MOOC appuyés par des travaux dirigés, des travaux pratiques et des travaux personnels. METHODES D’EVALUATION • Evaluation formative • Evaluation sommative • Travaux pratiques BIBLIOGRAPHIE
  • 5. 4 CHAPITRE 1 : NATURE CHIMIQUE, STRUCTURE ET FONCTIONNEMENT DU MATERIEL GENETIQUE - Nature chimique du matériel génétique - Structure du matériel génétique - Fonctionnement du matériel génétique
  • 6. 5 CHAPITRE 1 : NATURE CHIMIQUE, CHARACTERISTIQUES ET FONCTIONNEMENT DU MATERIEL GENETIQUE I-NATURE CHIMIQUE Historique de la découverte de l’ADN Expérience de Fred Griffith & de Oswald Avery Le premier phénomène qui allait permettre de progresser dans l'identification du support de l'hérédité est celui de la transformation bactérienne, rapporté en 1928 par l'anglais Fred Griffith (1877 - 1941). Celui-ci travaille alors au laboratoire de pathologie du ministère de la santé du Royaume Uni. Griffith décrit deux souches de pneumocoques Diplococcus pneumomiae: la souche R (rough, car lorsque cette souche est cultivée sur milieu de culture artificiel, les colonies obtenues ont un aspect rugueux) et la souche S (smooth, car les colonies ont au contraire un aspect lisse). La souche S doit son aspect à une capsule polysaccharidique qu'elle synthétise autour d'elle. Cette souche est mortelle pour la souris lorsqu'elle lui est injectée. A l'inverse, la souche R ne synthétise pas une telle capsule, et elle n'est pas nocive lorsqu'elle est injectée à une souris (Fig.1). On sait aujourd'hui que cette différence entre les deux souches est due à une mutation, chez la bactérie R, du gène codant l'enzyme responsable de la synthèse de la capsule. Griffith observe tout d'abord que l'injection de bactéries S, si elles ont été préalablement tuées par la chaleur, n'est plus létale pour la souris. Pour une raison qui nous est toujours inconnue, Griffith décide alors d'injecter conjointement des bactéries S chauffées mélangées à des bactéries R vivantes. Cette fois, les souris meurent de septicémie. Les bactéries R, au contact des bactéries S tuées, ont donc acquis un caractère pathogène qu'elles ne possédaient pas précédemment. Ce phénomène a été appelé transformation bactérienne, et il a été par la suite reproduit chez plusieurs autres espèces bactériennes. Il existe en fait plusieurs souches de pneumocoques (types I, II, ou III), discernables
  • 7. 6 grâce à des tests immunologiques. Lorsque qu'une souche R de type III est injectée avec une souche S de type II inactivée, la bactérie virulente qui est ré-isolée de la souris tuée est toujours du type II. Ce changement est stable et définitif. Ceci suggère donc qu'il existe chez les cellules un "facteur transformant", probablement libéré par la chaleur, susceptible d'être intégré par d'autres bactéries, et qui leur confère de façon héréditaire de nouvelles propriétés génétiques. Ce phénomène représentait un test d'activité biologique, grâce auquel on pouvait envisager de déterminer la nature du matériel génétique responsable de la transformation de bactérie du type R en bactérie de type S. Griffith ne sut pas en tirer lui-même avantage, et la nature du "facteur transformant" sera élucidée plus de 10 ans plus tard par Avery et ses collègues. La nature biochimique du matériel génétique mis en évidence par Griffith est élucidée en 1944 par les travaux de Oswald Avery, et de ses collègues (Colin McLeod, et McLyn McCarthy), qu'ils mènent à l'Institut Rockfeller de New-York. Ils reprennent les expériences de Griffith sur la transformation bactérienne, et cherchent à purifier le facteur transformant du pneumocoque. Cette caractérisation prendra 10 ans, elle les conduit à montrer que ce facteur n'est autre que l'ADN : en effet, l'ADN extrait d'une souche S suffit à lui seul pour transformer une souche non virulente en souche virulente. La transformation des bactéries R s'effectue par incorporation de fragments d'ADN provenant des bactéries S tuées. On sait aujourd'hui que de tels fragments sont capables de rentrer dans une bactérie vivante, et de s'intégrer au chromosome de celle-ci en lieu et place de la région homologue. L'identification de l'ADN comme principe transformant est à l'époque suffisamment extraordinaire pour nécessiter qu'une telle découverte soit étayée par des arguments indiscutables. Aussi Avery et ses collègues effectuent-ils leurs analyses avec un soin particulièrement méticuleux. Tous les contrôles alors disponibles sont testés : l'absence de protéine dans les préparations est testée par divers réactifs chimiques, leur composition chimique est analysée par des moyens chimiques ou spectrophotométrique. Enfin, l'utilisation d'enzymes montre que le pouvoir transformant réside bien dans l'ADN, puisque la DNAse anéantit ce pouvoir, alors que la RNAse ou des protéinases le laisse intact (Fig.2).
  • 8. 7 Fig 1 : Expérience de Griffith
  • 9. 8 Fig.2 : Expérience d’Avery et collaborateurs La difficulté à accepter l'ADN comme support de l'hérédité Malgré une accumulation croissante de preuves jusqu'au début des années 50, la communauté scientifique n'a pas accepté facilement que l'ADN puisse être le support de l'hérédité. Selon les thèses alors les plus largement acceptées, l'ADN n'est qu'une molécule simple, et donc incapable de véhiculer une information complexe. La théorie tétranucléotidique proposée par Phoebus Aaron Levene (1869 - 1940), stipulait que la structure de l'ADN est régulière et monotone, comprenant un enchaînement répétitif des 4 bases azotées. Levene était alors un des plus grands spécialistes des acides nucléiques, c'est lui qui avait identifié le désoxyribose comme un des constituants de l'ADN. Les protéines, dont on avait perçu l'immense diversité, semblaient de bien meilleurs candidats pour véhiculer une information génétique. La découverte de Avery a été accueillie avec beaucoup de scepticisme, ils furent interprétés par beaucoup comme le résultat d'une contamination des préparations d'ADN par de faible quantité de
  • 10. 9 protéines ou d'une autre substance. Et même si ces préparations d'ADN étaient absolument pures, il était possible d'envisager que cette molécule ne soit pas elle-même porteuse d'information, mais qu'elle joue simplement un rôle de commutateur : toutes les informations nécessaires à la transition de la forme R vers la forme S auraient déjà été présentes dans chacune des souches, et l'ADN n'aurait alors contribué qu'à la transition d'un type vers l'autre. Avery lui-même n'a pas véritablement cherché à imposer ses conclusions. Ainsi, l'importance fondamentale de ces travaux ne sera reconnue que tardivement, et le comité Nobel ne le retiendra pas pour l'attribution d'un prix. Lorsqu’en 1953 Watson et Crick décriront la structure de l'ADN, ils ne prendront même pas la peine de citer ces travaux dans leur article. Certains scientifiques ont cependant saisi immédiatement la portée immense des travaux d'Avery. Ce fut en particulier le cas de E. Chargaff, J. Lederberg, G. Beadle, ou de A. Lwoff. Chargaff est un biochimiste d'origine autrichienne ayant émigré aux USA en 1934. Il fait partie des scientifiques qui saisissent immédiatement la portée immense des travaux d' Avery sur la transformation bactérienne. Lorsque Avery publie ses résultats, Chargaff dirige un laboratoire de biochimie à l'université de Columbia. Le thème central en est alors la biochimie des lipoprotéines. Quand il prend connaissance des travaux d'Avery, Chargaff comprend aussitôt que l'ADN occupe une place centrale dans les mécanismes héréditaires, et il décide de consacrer désormais les activités de son laboratoire à l'étude des acides nucléiques. En 1950, il publie ses travaux sur le contenu en bases azotées de l'ADN chez diverses espèces, réalisés grâce aux progrès de la chromatographie sur papier. Il montre alors que le rapport A+T/C+G est variable selon les espèces, mais constant pour tous les membres d'une espèce donnée. L'ADN est donc porteur d'une certaine spécificité, cette molécule n'a pas une structure polymérique monotone, elle est donc susceptible de contenir une information. Ces travaux contribuent à répandre l'idée que l'ADN puisse être une molécule porteuse de l'information génétique. Chargaff montre par ailleurs que le rapport C/G ou A/T est à l'inverse constant et quasiment égal à un chez toutes les espèces étudiées. Cette dernière observation sera déterminante pour l'élaboration du modèle de la structure de l'ADN par Watson et Crick quelques années plus tard. A la suite du succès remporté par ce modèle, Chargaff est très réticent à en reconnaître l'entière paternité à ses auteurs, pour lesquels il n'a jamais eu grande estime (à la suite de sa première
  • 11. 10 rencontre avec Watson et Crick, il les avait comparés à deux clowns). Il continuera à revendiquer pour son propre compte le modèle d'appariement des bases, alors qu'il n'y avait lui-même jamais pensé, et n'ayant mis en évidence que les rapports égaux d'adénine et de thymine, de cytosine et de guanine. Composition chimique de l'ADN Les travaux de Kornberg révélèrent que les précurseurs de l'ADN étaient des nucléotides riches en énergie (dNTP, dCTP, dTTP, dGTP). Chaque nucléotide est composé d'acide phosphoriques (3), base azotée (A, T, C, G) et un pentose(2'-désoxy-β-D-Ribose). La liaison formée entre deux phosphates donne un anhydride avec une liaison très riche en énergie, et la liaison entre le groupement acide du phosphate et l'hydroxyle du sucre donne une liaison ester. La liaison formée entre le sucre et la base est une liaison osidique de type β-Nglycosidique (Fig. 3, 4, 5 et 6). Fig.3: Formes du phosphate et les liaisons formées.
  • 12. 11 Fig.4: Nucléoside. Le sucre se lie à la base azotée par une liaison impliquant un des azotes (l’azote n°1 des pyrimidines ou azote n°9 des purines) et le carbone 1' de l’ose (carbone réducteur ou fonction semi-acétalique). C'est une liaison N-osidique. Fig.5 : A- Les pentoses qui rentrent dans la composition des acides nucléiques (ADN, ARN).B- Numérotation d'un sucre, le prime (') est ajouté dans la numérotation pour la distinguer à celle des bases.
  • 13. 12 Figure 6: Les cinq bases azotées de l'ADN et l'ARN (Purines [A et G], Pyrimidines [C, T et U]) Activité Consigne : à l’aide de la note de cours, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci- après 1-Décrivez les résultats de l’expérience de Griffith 2-Formulez une hypothèse pouvant expliquer l’apparition de bactéries S vivantes dans le corps des souris mortes 3-Déduisez la nature de l’information génétique 4- Décrivez la composition chimique de l’ADN 5-Qu’est-ce qui différencie les bases purines des bases pyrimidines ? 6-Quel type de liaison lie la base au sucre ? Durée : 45mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe)
  • 14. 13 II- CHARACTERISTIQUES 1-STRUCTURE L’ADN n’est pas une molécule simple brin mais une molécule double brin faite par deux chaînes antiparallèles complémentaires qui s'emboîtent. L’association des deux brins d’ADN est permise grâce aux liaisons hydrogène qui peuvent s’établir entre les bases purines et pyrimidique. L’appariement spécifique d’une adénine avec une thymine et d’une Guanine et d’une cytosine induit une complémentarité entre les deux brins. La complémentarité de séquences explique l’équimolarité observé par Chargaff qui montre dans les années 50 une relation d’équimolarité entre certaines bases Azotées ([A]=[T] et[G]=[C]). Dans une molécule d’ADN : -le nombre d’adénine = au nombre de thymine -le nombre de cytosine = au nombre de guanine Grâce à la complémentarité de séquence si on ne connaît que la séquence d’un des brins de l’ADN on peut en déduire la séquence de l’autre. Watson et Crick en 1953 décrivent la structure tridimensionnelle de l’ADN. Dans l’espace, les deux chaînes présentent une configuration hélicoïdale. Elles s’enroulent autour d’un axe imaginaire pour constituer une double hélice à rotation droite. Le pas de l’hélice est de environ 10 nucléotides. L’ADN forme deux sillons: le petit sillon et le grand sillon. Les paires de bases sont perpendiculaires au plan de l'axe de l’hélice (Fig.7, 8). Les liaisons hydrogènes entre les bases complémentaires sont l'une des caractéristiques fondamentales de la double hélice, car elles assurent la stabilité thermodynamique de l'hélice et la spécificité de l'appariement. Une liaison hydrogène est formée entre un atome ou groupement donneur d'hydrogène chargé positivement et un autre accepteur chargé négativement (fig.9). Dans l'ADN, les liaisons hydrogènes stabilisent les paires de base de la double hélice. La complémentarité entre les bases repose sur des raisons stériques. L'appariement de base entre deux purines, deux pyrimidines ou des bases non complémentaires A-C ou G-T est défavorisé, parce que les liaisons hydrogènes appropriées ne peuvent se former sous peine de rompre la géométrie de l'hélice. Une conséquence de cette règle d'appariement des bases est que la séquence d'un brin définit la séquence des bases de l'autre brin.
  • 15. 14 Fig.7 : Structure détaillée de la double hélice de l'ADN (forme B). Un tour d'hélice recouvre environ 10.5 pb (34 Å). Le squelette de chaque brin est formé de sucre et de phosphate. Les bases azotées sont projetées vers l'intérieur de la molécule mais restent accessibles au solvant par les deux sillons (petit et grand sillon). Fig.8 : Interactions entre C-G et A-T Deux types de paires de bases, souvent appelées paires de bases complémentaires prédominants dans la plupart des ADN A-T et C-G. La paire de base A-T est associée par deux
  • 16. 15 liaisons hydrogènes et le G-C par trois. Fig.9: Mise en évidence des groupements impliqués dans les liaisons H 2-Formes de l'ADN Dans l'espace les deux chaines présentent une configuration hélicoïdale. Elles s'enroulent autour d'un axe imaginaire pour constituer une double hélice à rotation droite (Ex. Forme A et B) ou bien à rotation gauche (Ex. Forme Z). Il existe plusieurs structures hélicoïdales de l'ADN. Jusqu' à présent, six formes ont été décrites (A, B, C, D, E et Z), mais la plupart d'entre elles ont été trouvées dans des conditions expérimentales contrôlées. La forme B de l'ADN est la forme biologique la plus importante, elle correspond à la forme décrite par Watson et Crick en 1953. Cette forme est caractérisée par un pas (tour) d'hélice de 10.5 pb (34 Å) et un diamètre de 2,37nm (fig. 7). La forme B de l'ADN est caractérisée aussi par la présence de deux sillons, le petit sillon et le grand sillon. Les différentes formes de l'ADN se distinguent par : 1- le nombre de paires de bases dans chaque tour d'hélice ; 2- la longueur de l'hélice ; 3- le diamètre hélicoïdal de la molécule ; 4- le sens de la double hélice (droit, gauche). 3- Propriétés physico-chimiques de l'ADN Les liaisons hydrogènes et les interactions hydrophobes qui maintiennent la structure en double hélice sont des forces faibles et des quantités relativement petites d'énergie peuvent séparer les deux brins par un processus appelé dénaturation.
  • 17. 16 3-1- Température de fusion Si une solution d'ADN est chauffée, à une certaine température, les liaisons hydrogènes qui assurent la cohésion des 2 brins appariés se rompent. On parle de fusion de l'ADN caractérisée par la température de fusion (Tm : melting temperature) (fig. 10). La dénaturation et la renaturation des brins d'ADN en solution sont des reconstitutions critiques pour diverses fonctions biologiques normales (réplication ; transcription …etc.). La température de fusion est influencée par plusieurs facteurs : - C + G % : la Tm augmente avec l'augmentation du% CG (fig.10). Pour les petites séquences comme les amorces (17 à 31) Tm= 4(C+G) + 2(A+T) ; - les cations (mono ou divalent) ; - les polyamines ; -les protéines. La propriété d'absorption des purines et pyrimidines dans l'UV à 260nm, et les protéines à 280nm permet de doser les acides nucléiques (C: concentration), et aussi bien d'estimer la contamination par les protéines lors de la purification des acides nucléiques. C = A260*DF*100 (unité: µg/µl A: Absorbance, DF: facteur de dilution) P(pureté) = A260 /A280 (Une solution d'ADN est considérée pure si 1.7 ≤ P ≤ 2).
  • 18. 17 Fig.10: La séparation des brins d'ADN en fonction de la température. Tm est la température pour parvenir à 50% de séparation des deux brins. Les régions riches en A et T s'ouvrent plus rapidement à celles riches en C et G (Clark, 2005). 4- L'ADN mitochondrial L'ADN mitochondrial (ou ADNmt) est une molécule d'ADN circulaire que l'on retrouve dans la mitochondrie. Cette molécule d'ADN code pour une partie des protéines et des ARN spécifiques au fonctionnement de la mitochondrie. Le génome mitochondrial est circulaire, chez l'homme, il est composé de 16 569 paires de bases et est associé à des protéines. L'organisation est comparable au chromosome bactérien. La transmission de cet ADN est généralement dite non mendélienne car, dans la plupart des cas, il est transmis par la mère. Mais il existe de nombreuses exceptions chez les plantes, les champignons et même chez les animaux(fig.11).
  • 19. 18 Fig.11: ADN mitochondrial Activité Consigne : à l’aide de la note de cours et de la figure ci-dessous, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-après 1-Répérez le sucre, la base et l’acide phosphorique d’un nucléotide 2-Expliquez la complémentarité entre les deux brins de l’ADN et déduisez en les implications 3-Que désigne pb? Une pb équivaut à combien de nucléotides? 4- Répérez la forme B de l’ADN sur la figure ci-dessous
  • 20. 19 5-Que signifie Tm? 6-En quoi consiste la dénaturation de l’ADN? Citez une fonction biologique où elle est indispensable 7- Pourquoi la Tm augmente avec l'augmentation du pourcentage de CG? 8-Quelles sont les charactéristiques du génome mitochondrial ? Durée : 45mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe) III-FONCTIONNEMENT DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE 1-Notion de gène Un gène est une séquence d’ADN qui permet la fabrication d’une protéine (grande molécule biologique) spécifique ou d’un ARN fonctionnel. On dit qu’un "gène code pour" la fabrication de telle ou telle protéine. Chaque chromosome contient des milliers de gènes qui vont donc permettre la synthèse de milliers de protéines. Ces protéines assurent l’essentiel des fonctions de la cellule. Elles ont différentes dénominations selon leur fonction : enzymes, neurotransmetteurs, hormones, etc., et ont un temps d’utilisation défini.
  • 21. 20 2- Le concept de gène C'est un fragment défini du chromosome occupant un emplacement fixe ; le locus et gouvernant une fonction précise, identifiable au niveau du phénotype. Les allèles représentent les différentes formes du même gène, dérivant les uns des autres par mutation et conditionnant les différents caractères pouvant se manifester dans le cadre de cette fonction. Des allèles portés par deux gènes distincts peuvent être échangés à la suite de recombinaisons. Cette notion classique du gène recouvre donc en fait trois aspects distincts : le gène est à la fois l'unité de fonction, l'unité de mutation, et l'unité de recombinaison. 2.1. La fonction 2.1.1. Phénotype. Le programme génétique de la cellule sert à la synthèse des enzymes responsables du métabolisme. Les enzymes de nature protéique sont constituées par un ou plusieurs polymères d'acides aminés : les polypeptides. Le phénotype résulte de l'existence et du développement de divers assemblages polypeptidiques, il en résulte qu'on peut considérer que l'unité de phénotype est le polypeptide, et que la fonction primordiale du matériel génétique est la synthèse d'un polypeptide 2.1.2. L'unité génétique de fonction. a) Le matériel génétique. Les travaux d'Avery, McLeod, McCarty (1944) sur la transformation bactérienne ont permis d'établir que la substance porteuse de l'information génétique est un acide nucléique: ADN. Le programme fonctionnel de la cellule est inscrit sous forme codée dans la séquence de bases successives des deux chaînes. b) Le cistron. L'ADN détermine la séquence des AA dans les polypeptides à partir des triplets de bases: les codons (Khorana et Niremberg 1968). On peut obtenir 64 codons (codons-sens) dont 61 correspondent aux 20AA qui entrent dans la constitution des polypeptides. Trois codons sont dit "non-sens" et servent à marquer une ponctuation: (codon stop: UAA, UAG, UGA appelés aussi respectivement ocre, ambre
  • 22. 21 et opale). Le polypeptide étant défini comme l'unité biochimique de phénotype, on peut lui faire correspondre une unité génétique de fonction: le cistron. 2.2. Mutation et recombinaison. 2.2.1. L'unité de mutation. C'est le plus petit fragment de la séquence nucléotidique dont l'altération peut empêcher ou modifier l'expression phénotypique du cistron. L'unité de mutation peut varier d'un nucléotide à un ou plusieurs codons. 2.2.2 L'unité de recombinaison. C'est la plus petite partie du génome qui puisse être échangée contre une autre ; l'unité de recombinaison correspond donc à un nucléotide. Deux nucléotides adjacents peuvent être séparés par recombinaison. Activité Consigne : à l’aide de la note de cours, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci- après 1- Pourquoi dit-on que le gène est une séquence d’ADN qui permet la fabrication d’une protéine spécifique ou d’un ARN fonctionnel? 2- Que comprenez-vous par cette phrase: le gène est à la fois l'unité de fonction, l'unité de mutation, et l'unité de recombinaison.? Durée : 20mn (travail individuel) ; 10mn (travail en groupe) 3.Activité des gènes 3.1. Nombre de gènes dans la cellule. Le nombre d'unité de fonction du génome d'une cellule est difficile à déterminer. Un cistron comporte quelques centaines de codons, un millier de nucléotides. Par ailleurs la quantité d'ADN
  • 23. 22 (nombre de nucléotides) constituant le génome d'une cellule peut être déterminée et une simple division permet alors d'obtenir le nombre approximatif de cistrons. Les valeurs obtenues par cette méthode sont très élevées: 10 000 unités de fonction pour une bactérie, plusieurs dizaines de milliers pour une cellule humaine (3 milliards de paires de nucléotides pour les 46 chromosomes humains). Ces chiffres sont sûrement surestimés puisque la totalité de l'ADN du génome n'a pas une activité génétique, et l'activité génétique ne s'exprime pas dans tous les cas par la synthèse d'un polypeptide, enfin l'estimation ne tient pas compte des phénomènes de redondance (un même cistron pouvant être répété plusieurs fois sur un génome). Il est plus raisonnable d'admettre que le génome bactérien comporte de 1000 à 4000 gènes et le génome humain quelques dizaines ou centaines de milliers. 3.2. Fonctionnement Il diffère selon que la cellule est eucaryote nucléée ou procaryote bactérienne. Chez la cellule eucaryote l'ADN se trouve dans le noyau protégé par des protéines histones alors que la synthèse des polypeptides s'effectue dans le cytoplasme. l'ARNm passe donc du noyau au cytoplasme pour la synthèse protéique. Chez les bactéries le chromosome est constitué par de l'ADN non lié aux protéines et directement au contact du cytoplasme. 3.2.1. Cellule procaryote (bactérie) a-Transcription Chez les procaryotes, dénués de noyau, la transcription se déroule au contact du cytoplasme et c'est la même ARN polymérase qui assure la synthèse des trois classes d'ARN (ARN ribosomiques, ARN de transfert et ARN messagers). La transcription correcte d'une séquence d'ADN en une molécule d'ARN représentative d'une unité d'information, repose sur une détermination correcte du point de départ, le site d'initiation, et du point d'arrivée, le site de terminaison. Ce sont les séquences du promoteur, situé en amont du point de démarrage de la transcription, et celles du site de terminaison, en fin d'unité de transcription, qui contiennent les informations nécessaires à la détermination des deux extrémités de la portion d'ADN à transcrire. La transcription d'un même fragment d'ADN peut débuter à plusieurs reprises en un court laps
  • 24. 23 de temps. Ce fragment peut donc être transcrit en plusieurs molécules d'ARN qui, s'il s'agit d'une séquence codante, sont elles-mêmes traduites en polypeptides "dans la foulée" : on dit que, chez les procaryotes, la traduction est couplée à la transcription. Fig.12 : Principe de la transcription chez la cellule procaryote b-Traduction Le terme traduction désigne l'ensemble des mécanismes qui transforment l'information portée par la séquence d'un ARN messager en une séquence polypeptidique. Ainsi, le flux d'information va passer de la forme acide nucléique (alphabet à 4 lettres) à la forme protéine (alphabet à 20 lettres) selon un code "universel". Le code génétique permet d'attribuer une signification (acide aminé ou arrêt de traduction) à chaque triplet de bases nucléiques de l'ARNm. Chez les procaryotes, la transcription et la traduction sont couplées : les ARNm sont traduits en polypeptides au fur et à mesure de leur synthèse. 3.2.2. Cellule Eucaryote A-Transcription  Le principe de la transcription est toujours le même : il s'agit de transcrire un code d'un système à quatre lettres (les bases nucléiques) dans un autre "langage" à 4 lettres, mais les modalités diffèrent par rapport aux procaryotes.
  • 25. 24 Localisation de la transcription La synthèse des ARN a lieu là où se trouve l'ADN, c'est-à dire principalement dans le noyau des eucaryotes, mais aussi dans le nucléoïdes des mitochondries ou des chloroplastes. De plus, l'ARN messager des eucaryotes qui est transcrit dans le noyau, subit ensuite une maturation, puis il est transféré dans le cytoplasme avant d'y être traduit. Les ARN polymérases Alors qu'une seule enzyme synthétise toutes les catégories d'ARN des procaryotes, dans la cellule eucaryotique, trois ARN polymérases sont mises en jeu dans la transcription d'ensembles de cistrons différents. • L'ARN polymérase A transcrit les cistrons ribosomiques, elle assure la synthèse des plus grands ARN des ribosomes. Son lieu d'action est le nucléole, en effet, les très nombreux cistrons ribosomiques répétés (c'est une de leur caractéristique), sont groupés au niveau de loci précis : les organisateurs nucléolaires. A l'interphase, la transcription active de ces cistrons se manifeste sous forme de structures cytologiques : les nucléoles. • L'ARN polymérase B réalise la synthèse de tous les ARN messagers nucléaires, qui seront traduits en protéines. • L'ARN polymérase C assure la synthèse des petits ARN nucléaires (ARN de transfert et ARN ribosomique 5S) et la transcription des gènes cytoplasmiques, c'est à dire, ceux qui sont portés par les chromosomes des mitochondries et des plastes des végétaux. Toutes ces polymérases sont des édifices protéiques complexes composés de quatre sous unités, rappelant celles des procaryotes, auxquelles s'ajoutent jusqu'à une douzaine de protomères. De plus, ces complexes ne fonctionnent in vivo que grâce à l'interaction de nombreux autres facteurs protéiques établissant des relations temporaires avec le cœur de l'enzyme.Ce que l'on connaît de la transcription des cistrons ribosomiques rappelle la transcription de l'ADN procaryotique .
  • 26. 25 La transcription des cistrons exprimés en protéines La transcription des séquences codantes, les cistrons exprimés en protéines, est assurée par la polymérase B. Parmi ceux-ci, on distingue plusieurs types d'organisation : quelques rares gènes présentent des unités de transcription semblables à celles des procaryotes, cependant la plupart des gènes eucaryotes sont structurés en mosaïque de portions codantes (les exons) et de portions n'ayant pas de signification protéique (les introns). La synthèse d'ARN chez les eucaryotes donne généralement naissance à un produit de transcription "primaire" (ou prémessager) qui devra subir une maturation pour fournir le messager cytoplasmique fonctionnel. Nous allons donc distinguer les deux étapes dans la "fabrication" d'un ARN messager fonctionnel : la transcription proprement dite et la maturation. Fig.13 : Transcription chez la cellule procaryote  Mécanisme de la transcription : l'étape d'initiation de la transcription est cruciale, bien plus que l'élongation et à la terminaison, elle présente des caractéristiques propres aux eucaryotes, elle est décrite ci-dessous. La transcription des séquences codantes est assurée
  • 27. 26 par la polymérase B, mais d'autres facteurs protéiques (appartenant au groupe des TF II) sont nécessaires pour certaines étapes particulières, notamment pour le démarrage (l'initiation). La formation du complexe d'initiation nécessaire à la fixation précise de l'ARN polymérase B est résumée dans la figure ci-contre. Un premier complexe, TFII-D reconnait le promoteur et permet la fixation de TFII-A puis des interactions protéiques entre cet assemblage, TFII-B et la polymérase B permettent la fixation de celle-ci, son maintien est assuré par TFII-E. D'autres facteurs (TFII-H et J) participent à la modification de la topologie de l’ADN. C’est au prix de cette complexité que la transcription est correctement initiée. Ici encore, tout repose sur l'interaction de protéines spécifiques avec des séquences déterminées, les promoteurs. Fig.14 : Initiation de la transcription chez la cellule Eucaryote
  • 28. 27 Les promoteurs des cellules eucaryotes, reconnus par l'ARN polymérase B (ou II), ont été étudiés à l'aide des outils les plus performants de la génétique moléculaire. Des expériences ont permis l'analyse systématique de l'effet de mutations dans les régions situées en amont du site de démarrage de la transcription. Leurs résultats ont mis en évidence le rôle déterminant de trois 'modules', positionnés à des distances d'environ -30, -75 et -100 du point de démarrage de la transcription : • La cassette TATA, vers -30, est probablement la seule séquence consensus située à une position fixe présente dans la quasi-totalité des gènes de la classe II, elle semble jouer un rôle dans la précision du premier nucléotide transcrit. • La cassette CAAT est située à -80 dans l'exemple du gène de la globine mais sa position peut varier selon les gènes, séquence consensus : GGCCAATCT. • La cassette GC (consensus : GGGCGG) est souvent en plusieurs copies et dans les deux orientations. Ces modules de base représentent donc un signal pour le complexe d'initiation de la polymérase B mais leur assemblage en différentes combinaisons possibles permet déjà une diversification qui va intervenir dans la régulation de la transcription. D'autres modules, parfois très éloignés du promoteur "de base", jouent également un rôle dans la régulation. Les signaux de terminaison sont moins bien connus que chez les procaryotes, par contre on connait des signaux de polyadénylation (l'ajout d'une séquence polyadénylée en 3' OH des messagers eucaryotiques fait partie de la maturation).  La maturation La maturation de la plupart des transcrits primaires porte sur 3 points: • la formation d'une structure particulière en 5' : la coiffe, • l'adjonction d'une séquence polyadénylée en 3', • l'épissage : excision des introns et jonction des exons.
  • 29. 28 La coiffe est formée par addition d'une guanosine triphosphate: le premier nucléotide du messager est généralement une purine, A ou G et représente théoriquement l'extrémité 5' triphosphorylée de la molécule : 5'pppA-pN-pN-pN-pN-pN ...En fait, une guanine est ajoutée par une liaison inhabituelle 5'-5' : Gppp + pppA-pN-pN-pN-pN-pN → Gp-ppA-pN-pN-pN-pN-pN ...Diverses méthylations peuvent se produire ensuite, notamment une en position 7 de la guanine et sur le ribose pour compléter cette structure que l'on retrouve dans tous les messagers eucaryotiques. L'adjonction de la coiffe se fait au cours de la synthèse du transcrit primaire. La coiffe joue un rôle pour le démarrage de la traduction : elle permet la reconnaissance, par les ribosomes, de l'extrémité 5' de l'ARN messager. La polyadénylation est un ajout post-transcriptionnel de nucléotides adényliques au niveau d'un site de polyadénylation du transcrit primaire. Le site est reconnu par un complexe protéique comportant une poly-A polymérase. Cette structure va former l'extrémité 3' du messager, elle peut aller jusqu'à 200 nucléotides. Elle semble assurer la protection de l'ARNm contre les dégradations enzymatiques et jouerait un rôle dans l'adressage du messager vers le cytoplasme. La maturation des gènes mosaïques, qui sont transcrits depuis le point d'initiation jusqu'au signal de terminaison, assure l'élimination des introns du transcrit primaire, ou pré-messager, et la jonction des exons qui doit se faire avec une grande précision. L'ensemble se fait simultanément par un mécanisme d' "épissage". Il existe plusieurs mécanismes d'épissage, qui diffèrent selon les unités de transcription. Tous font intervenir des molécules d'ARN autres que le transcrit primaire. Dans certains cas, c'est même un ARN qui catalyse la réaction : un ribozyme. Le mécanisme décrit ici est celui utilisé pour la plupart des messagers nucléaires, il fait appel à des ribonucléoprotéines au sein desquels, la molécule d'ARN joue certainement un rôle prépondérant.
  • 30. 29 Fig.15 : Phénomène de maturation chez la cellule procaryote Activité Consigne : à l’aide de la note de cours, des Moocs et supports vidéo reçus et de vos recherches personnelles sur internet, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-après 1- Définir : gène, locus, allèle, polypeptide, cistron, histone 2- Comparez le génome bactérien au génome humain 3- Comparez la transcription chez les cellules eucaryotes et procaryotes
  • 31. 30 4- Quels sont les complexes d'initiation nécessaires à la transcription de l'ARN polymérase B chez la cellule eucaryote 5- Citez, décrivez puis donnez le rôle des différents phénomènes de maturation de l'ARNm chez la cellule eucaryote 6- Quels sont les trois modules déterminant du promoteur chez la cellule eucaryote ? Durée : 90mn (travail individuel) ; 45mn (travail en groupe) b-La traduction Chez les eucaryotes, l'ARN messager, transcrit et maturé dans le noyau, est transféré dans le cytoplasme avant d'être traduit. La traduction se déroule au sein des ribosomes, complexes ribonucléiques, qui servent de support à l'assemblage ordonné des acides aminés du polypeptide codé par l'ARNm. Cette synthèse s'effectue en présence de différents types de facteurs protéiques. L'hydrolyse des nucléosides triphosphates, ATP ou GTP en nucléosides diphosphates, ADP ou GDP, fournit l'énergie nécessaire aux différentes étapes de la biosynthèse des protéines. Les acteurs de la transmission du message génétique à travers la traduction du code: • l'ARN messager (ARNm) porte la séquence informative, succession des codons spécifiant chaque acide aminé de la protéine; • les ARN de transfert (ARNt) sont capables d'établir la correspondance entre un codon et un acide aminé précis; • les aminoacyl-ARNt synthétases assurent la fixation d'un acide aminé aux ARNt correspondants. Elles assurent la spécificité de la liaison entre un ARN de transfert donné et l'acide aminé correspondant.
  • 32. 31 Les principales étapes de la traduction Démarrage ou initiation Les deux sous-unités du ribosome sont indispensables à la traduction et vont se mettre en place au moment de la phase d'initiation de ce processus. Dans le cytoplasme, en absence de traduction, l'association d'une protéine supplémentaire, le "facteur d'initiation" IF3, avec la petite sous unité empêche l'assemblage spontané des ribosomes. La petite sous-unité du ribosome reconnaît l'ARN messager et s'y fixe. Les modalités de la reconnaissance du site de démarrage de la traduction sur l'ARNm diffèrent chez les procaryotes et chez les eucaryotes : La grande sous-unité vient compléter le ribosome, elle présente deux sites de reconnaissance et de traitement de chaque ARN de transfert chargé en acide aminé, les sites A et P qui permettent de recevoir des ARN de transfert avec un espacement correspondant exactement à deux triplets successifs. Au départ, le site P (par lequel la Protéine naissante sort du complexe de traduction) ne peut être reconnu que par un ARN de transfert caractéristique de l'initiation (ARNti) systématiquement chargé en méthionine (chez les eucaryotes) ou en formyl-méthionine (chez les procaryotes). Cet ARN chargé est différent de celui qui sera utilisé en cours de synthèse pour apporter une méthionine là où le code le demande bien que le codon spécifiant la méthionine (A U G) soit unique, du fait des structures tertiaires de l'ARNt d'initiation (ARNtimet) et des autres. Des facteurs protéiques d'initiation (IF), formant un complexe avec l'ARNti chargé (en méthionine ou en formyl methionine) jouent un rôle essentiel dans la reconnaissance du site
  • 33. 32 P. Lorsque cet assemblage est effectué, un second ARNt chargé vient occuper le site A (sur lequel arrivent les Acides Aminés). La sélection de cet ARNt repose sur l'appariement codon- anticodon de telle sorte que l'acide aminé spécifié par le deuxième codon est en contact avec la méthionine d'initiation, une liaison peptidique peut s'établir entre les deux acides aminés. C'est une aminoacyl peptidyl-transférase qui catalyse l'établissement de cette liaison. Fig.16 : Initiation de la traduction Allongement ou élongation L'élongation nécessite la translocation du ribosome qui se décale exactement d'un triplet de nucléotides. Il en résulte que : le site P contient maintenant le second ARNt chargé s'un dipeptide et le site A est maintenant libre de recevoir un troisième ARNt chargé d'un troisième acide aminé (spécifié par le codon "en cours" face au site A) ce qui entraîne une deuxième liaison peptidique, les ARNt amont (côté site P) sont libérés. Ici encore, des facteurs protéiques, spécifiques de l'élongation (EF) forment des complexes avec les ARNt chargés pour assurer l'installation dans le site A. Les translocations du ribosome se poursuivent avec adjonction séquentielle d'acides aminés à la chaîne peptidique en cours jusqu'à la terminaison. De nouveaux ribosomes démarrent de nouvelles séquences d'initiation - élongation... avant que les précédents aient terminé
  • 34. 33 Fig.17: Elongation des chaînes polypeptidiques Arrêt ou terminaison L'arrêt de la traduction est indiqué dans l'ARN messager par un des trois codons stop : UAG ou codon "ambre", UAA ou "ochre" et UGA ou "opale" (terminologie liée à l'historique de leur découverte). Aucun ARN de transfert ne possède d'anticodon correspondant à ces triplets 'non- sens', un facteur protéique de relargarge ("Release Factor" en anglais, d'où l'abréviation RF) vient occuper le site A, la translocation du ribosome s'arrête, la protéine est relachée ainsi que le dernier ARNt et les deux sous-inités du ribosome se séparent. Fig.18: Terminaison de la traduction Activité Consigne : à l’aide de la note de cours, des Moocs et supports vidéo reçus et de vos recherches personnelles sur internet, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-après 1- Comparez la traduction chez la cellule eucaryote et la cellule procaryote 2- Décrivez les différentes étapes de la traduction chez la cellule procaryote Durée : 45mn (travail individuel) ; 20mn (travail en groupe)
  • 35. 34 4-Regulation 4-1Régulation de l'expression des gènes chez les procaryotes Les micro-organismes sont capables de contrôler l’expression de leurs gènes. Ce contrôle permet essentiellement à la cellule d’ajuster ses synthèses en fonction des besoins nutritionnels, face à un environnement changeant, de façon à assumer la croissance et la division cellulaire. Le contrôle de l’expression des enzymes permet un ajustement rapide des activités métaboliques en réponse aux fluctuations des niveaux intracellulaires des sucres, d’acides aminés ou de nucléotides. Certaines enzymes ne sont synthétisées que lorsque leurs substrats sont présents dans la cellule, ces enzymes sont dites inductibles. D’autres enzymes ne sont synthétisées que lorsque leur produit final est absent, elles sont dites répressibles. Enfin, certaines enzymes sont produites par des gènes qui ne sont pas régulés, elles sont donc produites continuellement, que leur substrat soit présent ou pas. Ces enzymes sont dites constitutives. Les enzymes constitutives sont généralement celles dont la cellule a continuellement besoin, comme celles du métabolisme du glucose. Chez les procaryotes les gènes sont groupés en unités fonctionnelles appelées opérons. L’opéron est une unité de régulation d’un ensemble de gènes adjacents qui seront transcrits à l’aide d’un même promoteur sous forme d’un seul ARNm (polycistronique), puis traduit en plusieurs protéines différentes. Cette unité comprend des gènes de structure (CISTRONS), un ou plusieurs gènes régulateurs codant pour des protéines régulatrices et des éléments de contrôle présent dans la séquence d’ADN. Il existe deux grands types d'opérons : les opérons inductibles qui codent pour des enzymes de la voie catabolique (dégradation) tel que l’opéron lactose et les opérons répressibles qui codent pour des enzymes de la voie anabolique (biosynthèse) tel que l’opéron tryptophane. 4-1-1 Régulation de l'expression de l'opéron lactose (lac ZYA) Structure de l'opéron lactose : L’opéron lactose est constitué des éléments suivants : 1. Trois gènes de structure représentés par : le gène lac Z qui code pour la bêta galactosidase qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose, le gène lac Y qui code pour une perméase
  • 36. 35 qui permet le passage du lactose à travers la membrane cellulaire et le gène lac A qui code pour la transacétylase ; 2. Un gène régulateur (gène I) qui code pour une protéine appelée répresseur ; 3. Un promoteur des gènes de structures qui permet la fixation de l'ARN polymérase ou le répresseur ; 4. Un opérateur. Figure 18 : Structure de l’Opéron lactose Caractéristiques de l'opéron lactose Les gènes de l'opéron lac ont un fort niveau d'expression seulement en présence du lactose, et en absence du glucose (la source de carbone et d'énergie préférée). L'opéron lac ne possède pas un promoteur fort pour cette raison la fixation de l'ARN polymérase doit être stimulée par une protéine d'activation spécifique, appelé protéine réceptrice d'AMPc (CRP) ou protéine activatrice du catabolisme (CAP) qui se fixe sur le site CAP. Régulation de l'opéron lactose En présence de glucose et absence de lactose :
  • 37. 36 Le gène I code pour une protéine, le répresseur qui se lie à l'opérateur (sous une forme tétramèrique), ce qui empêche l'ARN polymérase (fixée au promoteur) de progresser pour effectuer la transcription. Donc les trois enzymes ne sont pas produites car leurs gènes correspondants ne s'expriment pas, ils sont réprimés.
  • 38. 37 Fig 19 : Fonctionnement de l’opéron lac en présence de glucose et absence de lactose En présence de lactose et absence de glucose En présence de lactose une molécule inductrice est synthétisée par un réaction de transglycosylation à partir du lactose (β, 1-4), il s‘agit de l'allolactose (β-Dgalactopyranosyl– (1-6)- β- glucopyranose). Cette molécule va se fixer sur le répresseur et l'inactive de sorte qu'il ne puisse plus se fixer à la séquence de l'opérateur. Permettant ainsi à l’ARN polymérase activée d’initier la synthèse de l'ARN (la synthèse des enzymes). En absence du glucose, les niveaux d'AMPc (synthétisée à partir de l'ATP par l'adénylate cyclase) augmentent, aboutissant à la fixation de la CAP à l'AMPc. Le complexe CAP-AMPc se fixe sur le site CAP. Induisant une forte fixation de l'ARN polymérase au promoteur pour augmenter le taux de la transcription (x50 fois).
  • 39. 38 Fig 20 : Fonctionnement de l’opéron lac en présence de lactose et en absence de glucose En présence de glucose et lactose La présence du lactose induit la synthèse de l'allolactose qui se fixe au répresseur induisant sont inactivation donc il se détache de la séquence de l'opérateur permettant à l’ARN polymérase activée d’initier la synthèse de l'ARN et des enzymes. Cependant, en présence de glucose les niveaux d'AMPc diminuent et le complexe CAP- AMPc ne se forme pas et il ne se fixe pas sur le site CAP. Et donc la transcription n’est pas accélérée (faible taux de transcription).
  • 40. 39 4-1-2 Régulation de l'expression de l'opéron Tryptophane Structure de l'opéron Tryptophane L’ensemble des gènes qui codent pour les enzymes de la voie de synthèse de tryptophane constitue l’opéron trp. L’opéron Tryptophane est constitué des éléments suivants : 1-Gènes de structure : cinq gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse du tryptophane (TrpE, TrpD, TrpC, TrpB et TrpA) ; 2-Gène régulateur TrpR, très éloigné de l’opéron trp et codant pour un aporépresseur (répresseur Trp). (Lorsque le gène trpR est transcrit, il y a production d’un répresseur sous forme inactive qui n’a pas d’affinité pour l’opérateur trp. Il ne prend sa forme active que s’il s’unit à une molécule de tryptophane) ; 3. Un promoteur ; 4. Un opérateur (la région de l’opérateur se situe à l’intérieur du promoteur). Fig 21 : Structure de l'opéron Tryptophane Régulation de l'opéron Tryptophane Régulation par répression
  • 41. 40 Les gènes de l'opéron Trp sont contrôlés par un répresseur et ne s'expriment qu'à l'épuisement de tryptophane (l'absence du tryptophane qui arrête la répression). En absence du tryptophane Le répresseur est incapable de se fixer sur l’opérateur trp, l’ARN polymérase peut se lier au promoteur et transcrire les 5 gènes de structure. Fig 21 : Fonctionnement de l'opéron Tryptophane en absence du tryptophane En présence du tryptophane Lorsqu’il y a du tryptophane dans la cellule, il se fixe au répresseur Trp, cela forme un complexe répresseur fonctionnel qui se lie à l’opérateur trp et réprime la transcription des cinq gènes de structure de l’opéron. Le tryptophane, (le produit final des enzymes codées par l’opéron trp) agit ainsi comme un co-répresseur, c’est ce qui fait que lorsqu’on fournit à la bactérie du tryptophane, elle s’arrête d’en produire. Si la concentration en tryptophane dans le milieu diminue, le tryptophane se dissocie du répresseur Trp, celui-ci quitte l’opérateur trp et la transcription des gènes de structure de l’opéron trp reprend. Les enzymes de la voie de synthèse du tryptophane constituent donc un exemple d’enzymes répressibles, c'est-à-dire que leur synthèse est inhibée par la présence du tryptophane.
  • 42. 41 Fig 22 : Fonctionnement de l'opéron Tryptophane en présence du tryptophane Régulation par atténuation L'atténuation est un mécanisme de régulation de l'expression des gènes présent en particulier chez les bactéries. Elle consiste en une terminaison prématurée de la transcription, en amont des gènes de structure. Il n'y a alors pas de synthèse d'un ARN messager complet et donc pas d'expression. L'atténuation dépond de la capacité de l'ARN à former des structures secondaires entre des régions complémentaires Si les taux de tryptophane sont élevés, la plupart des transcrits terminent leur synthèse de façon prématurée (incomplète). Au contraire, si les taux sont insuffisants, la polymérase transcrit les gènes en entier. 4-2Régulation de l'expression des gènes chez les eucaryotes La régulation de la synthèse des protéines chez les eucaryotes est beaucoup plus complexe que chez les procaryotes. Chez les eucaryotes supérieurs, les cellules sont spécialisées pourtant, elles contiennent toutes les mêmes chromosomes et donc le même ADN et les mêmes gènes. En effet, la cellule n’exprime pas tous ces gènes en même temps, cette expression est strictement contrôlée, et elle diffère d’un type cellulaire à un autre, ceci constitue la base du développement embryonnaire et de la différenciation cellulaire. Structure des gènes eucaryotes 1-Les gènes eucaryotes sont constitués de segments d’ADN codants (exons ) et non codants (introns).
  • 43. 42 2-La présence d’introns intercalés le long de la séquence codante constitue la différence la plus frappante entre un gène eucaryote et un gène procaryote. L’ARN polymérase reconnaît et se lie à une séquence qui se trouve en amont du gène appelée promoteur. Ce promoteur donne le signal à l’ARN polymérase qui transcrit alors les introns en même temps que les séquences exons. Les introns seront enlevés plus tard au cours de la maturation de l’ARN-pré- messager. 3-Une autre caractéristique propre aux gènes eucaryotes est la présence de séquences régulatrices non codantes supplémentaires qui peuvent se trouver à des milliers de bases à distances du promoteur. Ces séquences appelées amplificateurs (ou ENHANCERS) exercent une forte influence et permettent d’amplifier la transcription du gène. Régulation de l’expression des gènes eucaryotes Il n’y a pas de modèle général de régulation génétique chez les eucaryotes comme c’est le cas chez les procaryotes. La régulation de l’expression des gènes eucaryotes peut se faire à plusieurs niveaux à savoir : au niveau chromatinien, au niveau transcriptionnel (Maturation de l’ARN pré-messager ; Transport de l’ARNm du noyau vers le cytoplasme), au niveau traductionnel et au niveau post- traductionnelle. Chez les cellules eucaryotes : • de nombreuses protéines sont fixées sur l'ADN. C’est le cas des histones qui participent à la formation de la chromatine. Seule une petite partie de l'ADN est nue ; • une grande partie des séquences d'ADN n'est pas traduite du fait que le gène est discontinu (fragmenté) en exons (traduits et transcrits) et en introns (transcrits mais non traduits) ; • Il existe des mécanismes qui permettent le réarrangement de segments d'ADN de manière contrôlée ; processus de réparation (coupure, réunion et excision, épissage) ; • les régions régulatrices sont beaucoup plus grandes et peuvent être situées à une centaine de paires de bases des promoteurs. Les protéines régulatrices se fixent au niveau de ces régions, mais à une distance trop grande pour interagir directement sur le promoteur ;
  • 44. 43 • les ARNm sont synthétisés dans le noyau et doivent être transportés à travers la membrane nucléaire vers le cytoplasme pour y être traduits. Une telle compartimentation n'existe pas chez les procaryotes ; • la région 5' en amont du site d'initiation de la transcription est une région de contrôle de la transcription très complexe. Elle est formée de divers motifs de nucléotides dits "cis- régulateurs" qui serviront de cibles à des facteurs dits "trans-régulateurs" ; • la fixation de ces facteurs trans-régulateurs (protéines et diverses autres substances non protidiques) provoquera selon les cas un démarrage, une activation (quelques rares fois une diminution) de la transcription ; • différents éléments cis-régulateurs (séquences nucléotidiques) sont maintenant connus. Ils sont retrouvés dans plusieurs gènes, mais chaque gène, dans une cellule animale, possède une combinaison particulière d'éléments cis-régulateurs uniques dans leur type, leur nombre et leur localisation Activité Consigne : à l’aide de la note de cours et de vos recherches personnelles, répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-après 1- Qu’est-ce qu’une enzyme ? 2- Décrivez les différentes enzymes retrouvées chez les procaryotes en tenant compte de leur mode de fonctionnement 3- Qu’est-ce qu’un opéron ? 4- Décrivez la structure et le fonctionnement des opérons lactose et tryptophane Durée : 60mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe)
  • 45. 44 CHAPITRE 2 : LES MUTATIONS - Propriétés des mutations - Notion de mutation germinale et de mutation somatique - Les agents mutagènes et leurs modes d’action - Notion d’épigénétique - Les différents types de mutations et leurs conséquences
  • 46. 45 CHAPITRE 2 : LES MUTATIONS 2-1-Notion de mutation génétique Une mutation génétique est une modification rare, accidentelle ou provoquée, de l'information génétique (séquence d’ADN ou d’ARN) dans le génome. Selon la partie du génome touchée, les conséquences d'une mutation peuvent varier. 2-2- Notion de mutation germinale et de mutation somatique On parle de mutation germinale ou mutation de novo, quand la mutation porte sur l'ADN des cellules souches d'un gamète. Dans ce cas, l'embryon sera porteur de la mutation alors qu'aucun de ses parents ne la possédait dans son patrimoine génétique. Ce type de mutation survient lors de la formation ou de la vie des gamètes d'un des deux parents (ovule ou spermatozoïde). Dans ce cas, il semblerait que les mutations apportées par le spermatozoïde prédominent ; selon une étude, environ 80 % des aberrations chromosomiques des chromosomes des descendants proviendraient du matériel chromosomique apporté par le spermatozoïde et la proportion de spermatozoïdes anormaux serait corrélée à l'âge du parent mâle. Toutefois, les anomalies apportées par la mère restent fréquentes et tendent également à augmenter avec l'âge. Les mutations somatiques ne touchent pas les cellules destinées à la reproduction, elles ne sont donc jamais héréditaires : les mutations post-zygotiques sont les mutations qui apparaissent dans l'œuf après sa fécondation. Elles sont plus rares et s'expriment sous forme de mosaïque chez l'individu concerné. Des mutations peuvent apparaître tout au long de la vie sur l'ADN de n'importe quelle cellule ; elles sont alors transmises à la lignée des cellules filles. Ces dernières peuvent, dans certains cas, devenir des cellules tumorales puis former un cancer.
  • 47. 46 Chez les animaux pluricellulaires, les mutations de la lignée germinale peuvent être transmises à la descendance, contrairement aux mutations somatiques. 2-3-Origine des mutations Les mutations naturelles sont aléatoires, mais leur fréquence d'apparition peut être augmentée par des mutagènes, parfois qualifiés d’agents ou de facteurs mutagènes. Ces agents peuvent être physiques (rayonnements ionisants), chimiques (agents alkylants, dérivés réactifs de l'oxygène...) ou biologiques(Virus en général).Des procédés permettent aujourd'hui de provoquer des mutations non aléatoires et contrôlées (Type et Nature de la mutation). Ces procédés sont notamment fortement utilisés dans l'étude du vivant, par exemple pour comprendre les fonctions d'un gène. 2-3-1-Les mutagènes chimiques On les distingue par leur mode d’action. Certains agissent par des mécanismes semblables aux mécanismes spontanés, d’autres agissent davantage comme les radiations. 1 - Les analogues des bases : Leur structure chimique rappelle les purines et pyrimidines. Ils peuvent être incorporés à l’ADN lors de la réplication. Le bromo-uracile (BU), semblable à T (Br remplace CH3), s’apparie à A. Il a une forte tendance à se tautomériser en « enol ». Elle s'apparie alors à G. L’aminopurine, analogue de A s’apparie avec T et cause des transitions de A-T en G-C ou l’inverse. 2 - Les substances chimiques altérant la structure et l’appariement des bases : L’acide nitreux provient de la digestion des nitrites (conservateurs des aliments). Il est à l’origine de déaminations(= perte d'un groupe NH3)(ex : C ->U ; meC->T ; A-> hypoxanthine). La nitrosoguanidine, le methyl-methanesulfonate, l’ethyl- methanesulfonate réagissent avec les bases en ajoutant des groupements methyl ou ethyl. La dégradation peut aller jusqu’à la production de sites sans bases ce qui, à la réplication, est générateur de mutations. 3 - Les agents intercalants : Acridine, proflavine, bromide d’ethidium sont des molécules qui s’insèrent entre les bases de l’ADN.
  • 48. 47 Ceci entraîne un étirement de l’ADN. La polymérase insère alors une base surnuméraire en face de la molécule étrangère. 4 - Les agents qui altèrent la structure de l’ADN : Certaines grosses molécules se lient aux bases et qui deviennent ainsi « non codantes » (ex : NAAAF). D'autres agents causent des liaisons intra et inter brins (ex : le psoralène trouvé dans les végétaux et utilisé dans les traitements de la peau). Des produits chimiques causent des ruptures dans l’ADN ( ex : peroxydes). Ces agents n’induisent sans doute pas directement les mutations mais induisent des processus de réparation qui sont mutagéniques. 2-3-2 Les radiations : Elles sont le principal agent mutagène. 1 - Le spectre électromagnétique : La lumière visible et les autres formes de radiations sont des radiations électromagnétiques. Leur longueur d'onde varie et est inversement proportionnelle à leur énergie. Parmi les courtes longueurs d'onde, l'énergie est croissante dans cet ordre : ondes FM, TV, micro-ondes, Infrarouge, visible, UV, rayons X et gamma. La fraction biologiquement active est constituée par les UV, les rayons X et gamma. 2 - Les radiations ionisantes Les rayons X et gamma sont assez énergétiques pour produire des ions réactifs (atomes chargés ou molécules) quand ils interagissent avec les molécules biologiques. On parle ainsi de radiations ionisantes. On regroupe également sous ce terme les radiations corpusculaires, flux de particules atomiques et subatomiques émises par les éléments radioactifs. Elles sont de deux types : les particules alpha (noyau de l'hélium 2H+ + 2 neutrons) et les particules bêta (des électrons). Les UV ne sont pas ionisants mais peuvent réagir avec l'ADN ou d'autres molécules biologiques. L'unité utilisée pour évaluer les radiations ionisantes est le rem (roentgen equivalent man) : 1 rem de n'importe quelle radiation ionisante produit le même effet biologique.
  • 49. 48 3 - Les sources de radiations : Les sources naturelles produisent des radiations "d'arrière-plan". Ce sont les rayons cosmiques (incluant le rayonnement solaire), les éléments radioactifs du sol ou des produits du sol (bois, pierre) et de l'atmosphère (radon). Les autres sources sont artificielles : rayons X pour le diagnostic, essais nucléaires, TV, etc. Dans l'ensemble, le taux moyen d'exposition est de 350 mrem/an, l'essentiel étant dû au radon. 4 - Effets biologiques des radiations : Les dégâts causés aux cellules par les radiations sont le résultat de la production de radicaux libres issus de l'eau (le radical OH ou hydroxyl). Les radicaux libres possèdent des électrons non appariés et sont chimiquement très réactifs. Ils interagissent avec l'ADN, les protéines et les lipides des membranes. Les dégâts causés ont pour conséquences l'atteinte d'organelles, le blocage de la division cellulaire ou la mort de la cellule. Les cellules à cycle cellulaire court (cellules souches de la moelle osseuse, lignée du tractus gastro-intestinal) sont les plus touchées. La sévérité des effets dépend de la dose reçue. 5 - Les effets génétiques des radiations ionisantes : Les radiations ionisantes ont de nombreux effets sur l'ADN à la fois par les radicaux libres qu'elles créent et par action directe : • ruptures dans l'un ou les deux brins (qui peuvent conduire à des réarrangements, délétions, perte de fragments de chromosome, ou la mort de la cellule en l'absence de réparation) ; • altération ou perte de bases (mutations) ; • enchevêtrement de l'ADN avec lui-même ou avec des protéines Il y a une relation entre la dose de rayonnement et le taux de mutations, l'effet des radiations étant cumulatif.
  • 50. 49 6 - Les effets des UV : Ils ne sont pas parmi les plus énergétiques et ne sont pas ionisants, mais leurs longueurs d'onde sont absorbées préférentiellement par des bases de l'ADN et par les acides aminés aromatiques des protéines. La plupart des lésions létales sont des dimères entre bases pyrimidiques ( T- T ou T-C) dans l'ADN, résultat de l'établissement d'une liaison covalente entre pyrimidines adjacentes sur un brin. Ces dimères comme la majeure partie des lésions d'origine chimique, bloquent la transcription et la réplication. Elles sont létales si elles ne sont pas réparées. Elles genérent aussi des mutations et des réarrangements chromosomiques. 2-3-3-Les mutagènes biologiques Les sources possibles d'agents mutagènes biologiques peuvent être toutes les préparations de nature biologique utilisées en médecine prophylactique ou thérapeutique, telles que vaccins, antitoxines, sang, sérum et antigènes. Les agents biologiques mutagènes potentiels peuvent être des micro-organismes, en particulier des virus. Dans le cas des virus, il a été démontré qu'ils peuvent produire des anomalies chromosomiques, de la simple casse à la pulvérisation des chromosomes, de sorte que la vaccination avec des virus vivants peut impliquer un risque potentiel. La contamination virale résultant de transfusions, telle que l'hépatite, provoque des déchirures chromosomiques dans le sang et la moelle osseuse de patients atteints d'hépatite. Les molécules d'ADN recombinantes présentent un risque potentiel, car de nombreux types d'ADN de cellules animales contiennent des séquences communes aux virus tumoraux. 2-4Notion d’épigénétique L'épigénétique est l'étude de la relation entre génotype (l'information du génome d'un individu) et le phénotype (l'ensemble des caractéristiques observables de l'organisme de l'individu). Le génotype représente l'ensemble de la composition génétique d'un individu. Le génotypage est donc la discipline qui vise à déterminer la nature d'une variation génétique à une position spécifique dans le génome, pour un individu donné. On estime que les différences entre deux êtres humains
  • 51. 50 sont d'environ 3 millions de nucléotides sur les 3 milliards constituant leur génome. Le phénotype est l'ensemble des caractéristiques observables d'un organisme (anatomiques, morphologiques, moléculaires ou physiologiques). Il est déterminé à la fois par les gènes et par l'environnement. Le terme épigénétique a été proposé pour la première fois par Conrad Hal Waddington dans les années 1940 comme "la branche de la biologie qui étudie les relations de cause à effet entre les gènes et leurs produits, lesquelles donnent naissance au phénotype". Aujourd'hui, la définition la plus courante de l'épigénétique est "l'étude des changements héréditaires dans la fonction des gènes, ayant lieu sans altération de la séquence de l'ADN". Pour prendre une métaphore, la génétique renvoie à l'écriture des gènes, l'épigénétique à leur lecture. L'accessibilité d'un gène dans le noyau d'une cellule, et donc sa capacité à être transcrit puis traduit en une protéine, va dépendre de modifications chimiques de l'ADN (par exemple, la méthylation) et de protéines qui entourent l'ADN. L'épigénome est l'ensemble des modifications épigénétiques d'une cellule. L'hérédité épigénétique est fondamentale au niveau cellulaire, car elle contribue dans l'organisme à la mémoire de l'identité des cellules. Les modifications épigénétiques sont influencées par l'environnement intrinsèque ou extrinsèque. Notre mode de vie pourrait ainsi laisser dans nos cellules une "trace épigénétique" éventuellement transmissible d'une génération à l'autre. 2-5 Les différents types de mutations et leurs conséquences Il existe plusieurs types de mutations. 2-5-1-Les mutations par substitution Dans cette mutation, l’anomalie est provoquée par le remplacement d’un nucléotide par un autre. Imaginons un gène de 36 nucléotides ou TOP designe le codon initiateur et OUT le codon stop: TOP CET ADO FOU TUA TON AMI QUI FUT TON PSY OUT
  • 52. 51  Mutation faux-sens A la position 16, le simple fait de mettre un « M » à la place d’un « T » modifie une partie du sens de la phrase. La phrase garde un sens mais il est différent de l’original. … TOP CET ADO FOU TUA MON AMI QUI FUT TON PSY OUT. En génétique, on parle de mutation « faux-sens ». Le codon modifié « MON » produit un acide aminé (un sens) différent de celui produit par « TON » donc la protéine sera modifiée. Ainsi une des mutations du gène OPA1 s’écrit : c.1334 G>A ce qu’on lit : le nucléotide G (guanine) qui était à la 1334ème position sur le gène a été remplacée par le nucléotide A (adénine).  Mutation non-sens A la position 25, le remplacement de la lettre « F » par la lettre « O » introduit donc un signal d’arrêt. On parle de mutation « non-sens ». TOP CET ADO FOU TUA TON AMI QUI OUT/ TON PSY OUT/ En cas de mutation non-sens, la lecture s’arrête et la protéine produite est incomplète. En génétique, on représente les coodns d’arrêt par la lettre "X". Dans ce cas on note la mutation en comptant des codons (groupe de 3 nucléotides) et non des nucléotides isolés. On note l’acide aminé produit par le codon concerné.  Mutation silencieuse TOP CET ADO FOU TUE TON AMI QUI FUT TON PSY OUT A la position 15, nous mettons un « E » à la place d’un « A ». Le temps de la phrase change mais le passage du passé simple au présent ne modifie pas le sens général. De même, en génétique, certaines modifications sont sans effet sur la qualité des protéines produites. On parle de mutation silencieuse. 2-5-2-Les mutations par insertion Cette mutation est provoquée par l’ajout d’une ou plusieurs lettres dans la phrase. La phrase n’a plus aucun sens. Une insertion décale la lecture vers la droite, la découpe des mots n’a plus de sens. Dans notre exemple ci-dessous, nous avons inséré les lettres « VI » aux positions 10 et 11
  • 53. 52 TIN DEN /TOP CET ADO VIF OUT /UAT ONA MIQ UIF UTT ONP SYO. On écrira, par exemple, 546_547insT qui se lit : « insertion d’un nucléotide T (thymine) entre les positions 546 et 547 » 2-5-3-Les mutations par délétion Dans notre exemple ci-dessous, nous avons ôté la lettre "F" qui était à la position 10. Comme dans le cas de l’insertion la lecture est décalée mais vers la gauche. On écrira, par exemple, 586_591del qui se lit : « six nucléotides manquent entre les positions 586 et 591 inclues /TOP CET ADO OUT /UAT ONA MIQ UIF Activité Consigne : à l’aide de la note de cours et de vos recherches personnelles répondez individuellement puis en groupe aux questions ci-après 1- Mutation : définition et propriétés 2- Quelle différence faites-vous entre mutation germinale et somatique 3- Quel est le mode d'action des agents mutagènes 4- Donnez les différents types de mutation et leur conséquence 5- Qu’avez-vous compris de la notion d’épigénétique ? Durée : 60mn (travail individuel) ; 30mn (travail en groupe)