Université Catholique de Louvain
Faculté de Santé Publique
EXPOSITION PRENATALE AUX PESTICIDES ET LEUCEMIES:
APPORT DES NO...
EXPOSITION PRENATALE AUX PESTICIDES ET LEUCEMIES: APPORT DES
NOUVELLES CONNAISSANCES PHYSIOPATHOLOGIQUES DANS L'ETUDE DE L...
SOMMAIRE
5 I.OBJECTIF
10 II. PHYSIOPATHOLOGIE
10 II.1. NOTIONS GENERALES SUR L'ONCOGENESE
10 II.1.1. MODELE D'HANAHAN ET W...
73 V.2. APPORT DES CONNAISSANCES PHYSIOPATHOLOGIQUES ACTUELLES ET DES
NOUVELLES METHODES D'ETUDE
73 V.2.1. EPIDEMIOLOGIE
7...
I.OBJECTIF:
Les pesticides figurent parmi les substances cancérigènes, mutagènes et reprotoxiques auxquelles
les travaille...
 Groupe 2A : probablement cancérogène pour l'homme
 Groupe 2B : peut-être cancérogène pour l'homme
 Groupe 3 : inclassa...
Contexte réglementaire européen relatif à l'évaluation et à l'usage des pesticides:
L'usage des pesticides dans l'Union Eu...
usages non professionnels. Elle vise à réduire l'utilisation globale des pesticides, en favorisant les
méthodes de substit...
L'étude immunophénotypique, basée sur l'expression des marqueurs lymphoïdes normaux, permet
une classification pronostique...
II. PHYSIOPATHOLOGIE
II.1. NOTIONS GENERALES SUR L'ONCOGENESE:
II.1.1. MODELE D'HANAHAN ET WEINBERG:
Il est classiquement ...
Lorsque des cellules normales sont mises en culture, l'adjonction de facteurs de croissance dans le
milieu est nécessaire ...
L'inhibition de l'angiogenèse est une piste thérapeutique explorée depuis une dizaine d'années.
6/ Invasivité et pouvoir m...
des gènes humains (Egger, 2004). L’annotation CpG est employée à la place de CG afin de préciser
qu’il s’agit d’une séquen...
observée dans les tissus tumoraux, notamment les leucémies (Chen, 2010).
Il est classiquement admis que la carcinogenèse r...
chez les patients par transplantations itératives (Huntly, 2005).
Des constatations similaires ont été faites pour certain...
Une question majeure concerne le rôle de la niche dans le processus de carcinogenèse.
Des leucémies dérivant du greffon so...
II.2.2. DESCRIPTION ET ORIGINE DES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES LES
PLUS COURANTES:
TEL-AML1 :
TEL et AML1 sont des facteurs d...
La xénogreffe de cellules humaines de cordon ombilical préalablement transfectées avec un vecteur
lentiviral exprimant le ...
La cellule d'origine reste également à identifier. La translocation MLL-AF4 semble survenir à un
stade relativement précoc...
(Paulsson, 2009).
Lorsque seul l’un des jumeaux est atteint, la translocation initiale peut être retrouvée chez le jumeau
...
Les mutations additionnelles impliquées dans la LLA peuvent être identifiées de deux manières. Il
s'agit, d'une part, de l...
une diminution de transcription du gène en présence de ces mutations.
Le gène PAX5 est un facteur de transcription dont l'...
II.3 MECANISMES DES TRANSLOCATIONS CHROMOSOMIQUES
Les translocations réciproques sont retrouvées dans environ 30% à 40% de...
Les diverses protéines impliquées dans la détection des DSB et dans leur réparation sont en partie
caractérisées (Aguilera...
chromatides). Dans tous les cas, la recombinaison homologue allélique n'engendre pas de
translocation (Mani, 2010).
La rec...
Influence de la proximité spatiale des partenaires de translocation:
La fréquence de la survenue de translocations entre d...
Lors de la survenue d'une cassure double brin, une sous-unité d'histone est phosphorylée (γH2AX).
L'immunomarquage de γH2A...
II.3.2. MECANISMES ENDOGENES GENERANT DES CASSURES DOUBLE
BRIN:
Outre l'action de facteurs physiques et chimiques produisa...
du site catalytique et le brin d'ADN (Figure 6) durant la phase de détorsion de l'ADN (Deweese,
2009).
Cette réaction ATP-...
III. EPIDEMIOLOGIE:
III.1. DONNEES GENERALES:
Le taux d’incidence annuel de la leucémie aiguë est de 30 à 45 par million c...
31
Les généralités concernant la réalisation et l'interprétation d'études observationnelles et de méta-
analyses figurent en ...
III.2. DONNEES ENVIRONNEMENTALES DISPONIBLES SUR LE LIEN ENTRE
EXPOSITION AUX PESTICIDES ET LLA:
Bien que l'objectif soit ...
(Infante-Rivard, 2008). On peut citer la fumée de tabac, les solvants, la pollution produite par la
circulation automobile...
généralisé en agriculture ainsi que de l’usage domestique fréquent (Zahm, 1998).
Les autres facteurs de risque chimiques s...
Ces deux études présentent une bonne conformité avec les critères PRISMA qu'elles ne mentionnent
toutefois pas.
Les études...
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  1. 1. Université Catholique de Louvain Faculté de Santé Publique EXPOSITION PRENATALE AUX PESTICIDES ET LEUCEMIES: APPORT DES NOUVELLES CONNAISSANCES PHYSIOPATHOLOGIQUES DANS L'ETUDE DE LA LEUCEMIE LYMPHOBLASTIQUE AIGUË CROCHET Thibaut Mémoire présenté en vue de l'obtention du Master Complémentaire en Médecine du Travail Promoteur : Professeur Dominique LISON Année académique 2013-2014 1
  2. 2. EXPOSITION PRENATALE AUX PESTICIDES ET LEUCEMIES: APPORT DES NOUVELLES CONNAISSANCES PHYSIOPATHOLOGIQUES DANS L'ETUDE DE LA LEUCEMIE LYMPHOBLASTIQUE AIGUË La leucémie aiguë lymphoblastique est la première cause de cancer chez l'enfant. L'exposition prénatale aux pesticides figure parmi les facteurs de risque environnementaux potentiels d'après les données épidémiologiques actuelles, qui mettent également en évidence une interaction avec des polymorphismes génétiques impliqués notamment dans le métabolisme des xénobiotiques. Cependant, les données épidémiologiques actuelles ne présentent pas un niveau de preuve optimal et aucune donnée expérimentale n'est actuellement disponible. Les connaissances physiopathologiques actuelles soulignent l'origine majoritairement prénatale de la LLA de l'enfant et permettent de préciser les fenêtres d'exposition à étudier ainsi que le mécanisme mutationnel initial. Une meilleure évaluation épidémiologique du lien de cause à effet tenant compte des anomalies cytogénétiques et moléculaires, du type de pesticide et des polymorphismes génétiques est justifiée. Les modèles expérimentaux doivent également être développés, en particulier l'usage de cellules souches embryonnaires humaines et de précurseurs hématopoïétiques et lymphoïdes obtenus par différenciation in vitro. En raison des limitations inhérentes aux méthodes épidémiologiques (problèmes de puissance et d'évaluation de l'exposition), ces méthodes expérimentales doivent être validées et intégrées à l'analyse de routine préalable à la mise sur le marché ainsi qu'à l'évaluation des molécules existantes. Ces préconisations entrent en conformité avec le règlement CE N°1107/2009 qui recommande une protection renforcée des femmes enceintes et des enfants à naître ainsi qu'une limitation du recours à l'expérimentation animale. Du fait de l'origine prénatale manifeste de la mutation initiale responsable de la LLA, une protection accrue des femmes enceintes ou en âge de procréer doit être assurée. Mots-clés: Pesticides, leucémie lymphoblastique aiguë, épidémiologie, toxicologie expérimentale. 2
  3. 3. SOMMAIRE 5 I.OBJECTIF 10 II. PHYSIOPATHOLOGIE 10 II.1. NOTIONS GENERALES SUR L'ONCOGENESE 10 II.1.1. MODELE D'HANAHAN ET WEINBERG 12 II.1.2. MECANISMES EPIGENETIQUES 14 II.1.3. CELLULES SOUCHES TUMORALES 15 II.1.4. NOTION DE MICROENVIRONNEMENT (NICHE) 16 II.2. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA LEUCEMIE AIGUE LYMPHOBLASTIQUE DE L'ENFANT 16 II.2.1. GENERALITES 17 II.2.2. DESCRIPTION ET ORIGINE DES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES LES PLUS COURANTES 19 II.2.3. ORIGINE PRENATALE DES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES 20 II.2.4. MUTATIONS ADDITIONNELLES 23 II.3 MECANISMES DES TRANSLOCATIONS CHROMOSOMIQUES 23 II.3.1. MECANISMES IMPLIQUES DANS LA REPARATION DES CASSURES DOUBLE BRIN 28 II.3.2. MECANISMES ENDOGENES GENERANT DES CASSURES DOUBLE BRIN 30 III. EPIDEMIOLOGIE 30 III.1. DONNEES GENERALES 33 III.2. DONNEES ENVIRONNEMENTALES 33 III.2.1. FACTEURS DE RISQUE ENVIRONNEMENTAUX AUTRES QUE LES PESTICIDES 34 III.2.2. DONNEES CONVENTIONNELLES RELATIVES AUX PESTICIDES 42 III.2.3. DONNEES RELATIVES AUX PESTICIDES INTEGRANT LES CONNAISSANCES PHYSIOPATHOLOGIQUES ACTUELLES 43 III.3. FACTEURS GENETIQUES 44 III.3.1. METABOLISME DES XENOBIOTIQUES ET REPARATION DE L'ADN 49 III.3.2. IMMUNITE ANTITUMORALE 54 III.3.3. NOUVELLES METHODES BASEES SUR L'ANALYSE DU GENOME ENTIER 56 IV. TOXICOLOGIE EXPERIMENTALE 56 IV.1. METHODES CONVENTIONNELLES 56 IV.1.1. MUTAGENICITE 58 IV.1.2. CANCEROGENICITE 59 IV.1.3. REPROTOXICITE ET IMMUNOTOXICITE DEVELOPPEMENTALE 60 IV. 2. AVANCEES RECENTES 60 IV.2.1. TOXICOGENOMIQUE 61 IV.2.2. MODELES ANIMAUX TRANSGENIQUES 62 IV.2.3. CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES HUMAINES 69 V. PROPOSITION DE VOIES DE RECHERCHE 69 V.1. RECOMMANDATIONS GENERALES SUR L'ETUDE DES EFFETS DES PESTICIDES 69 V.1.1. AMELIORATION DES CONNAISANCES SUR L'EXPOSITION DES POPULATIONS 71 V.1.2. RECHERCHE DU LIEN ENTRE EXPOSITION ET PATHOLOGIES 3
  4. 4. 73 V.2. APPORT DES CONNAISSANCES PHYSIOPATHOLOGIQUES ACTUELLES ET DES NOUVELLES METHODES D'ETUDE 73 V.2.1. EPIDEMIOLOGIE 75 V.2.2. TOXICOLOGIE EXPERIMENTALE 79 V.2.3. PERSPECTIVES RELATIVES A L'ETUDE DE LA PHYSIOPATHOLOGIE DE LA LLA 80 VI. PREVENTION, PROTECTION ET REPARATION EN MILIEU PROFESSIONNEL 84 VII. CONCLUSION 86 ANNEXE I RAPPELS SUR LES METHODES EPIDEMIOLOGIQUES 95 ANNEXE II RAPPELS SUR L'IMMUNITE ANTITUMORALE 100 BIBLIOGRAPHIE 4
  5. 5. I.OBJECTIF: Les pesticides figurent parmi les substances cancérigènes, mutagènes et reprotoxiques auxquelles les travailleurs sont exposés. La population générale est également concernée du fait de la dispersion environnementale et de l'usage domestique. La réglementation européenne encadre l'évaluation sanitaire et l'usage des pesticides, en raison des risques sanitaires démontrés. La leucémie lymphoblastique aiguë de l'enfant (LLA), qui est le cancer de l'enfant le plus fréquent, fait partie de ces risques. Les connaissances récentes sur la physiopathologie de la LLA, ainsi que les progrès relatifs aux techniques d'étude, permettent de mieux préciser le lien de cause à effet entre exposition aux pesticides et survenue de LLA chez l'enfant. Substances cancérigènes, mutagènes et reprotoxiques: Les pesticides seuls ou en mélanges peuvent présenter divers effets nocifs pour la santé humaine. Certains sont classés « CMR », car ils présentent un caractère cancérogène, mutagène, ou toxique pour la reproduction:  Cancérogènes (C) : substances et mélanges qui, par inhalation, ingestion ou pénétration cutanée, peuvent provoquer un cancer ou en augmenter la fréquence.  Mutagènes (M) : substances et mélanges qui, par inhalation, ingestion ou pénétration cutanée, peuvent produire des défauts génétiques héréditaires ou en augmenter la fréquence.  Toxiques pour la reproduction (R) : substances et mélanges qui, par inhalation, ingestion ou pénétration cutanée, peuvent produire ou augmenter la fréquence d'effets nocifs non héréditaires dans la progéniture ou porter atteinte aux fonctions ou capacités reproductives. Les substances CMR sont classées selon les connaissances disponibles sur leur potentiel, suivant une classification européenne: Effets / Classe de danger Catégories Définitions des catégories Cancérogènes Catégorie 1A Substances dont le potentiel cancérigène pour l'être humain est avéré. Catégorie 1B Substances dont le potentiel cancérogène pour l'être humain est supposé. Catégorie 2 Substances suspectées d'être cancérogènes pour l'homme. Mutagènes Catégorie 1A Substances dont la capacité d'induire des mutations héréditaires dans les cellules germinales des êtres humains est avérée. Catégorie 1B Substances dont la capacité d'induire des mutations héréditaires dans les cellules germinales des êtres humains est supposée. Catégorie 2 Substances préoccupantes du fait qu'elles pourraient induire des mutations héréditaires dans les cellules germinales des êtres humains. Toxique pour la reproduction Catégorie 1A Substances dont la toxicité pour la reproduction humaine est avérée. Catégorie 1B Substances présumées toxiques pour la reproduction humaine. Catégorie 2 Substances suspectées d'être toxiques pour la reproduction humaine. En ce qui concerne les substances cancérigènes, bien que la classification européenne soit reprise dans la réglementation relative à l'étiquettage et à la prévention des risques liés à l'exposition humaine, c'est la classification du Centre international de recherche sur le cancer (IARC) qui est employée en priorité dans la littérature scientifique:  Groupe 1 : cancérogène pour l'homme 5
  6. 6.  Groupe 2A : probablement cancérogène pour l'homme  Groupe 2B : peut-être cancérogène pour l'homme  Groupe 3 : inclassable quant à sa cancérogénicité pour l’homme  Groupe 4 : probablement pas cancérogène pour l’homme La directive CE n° 2004/37 concernant la protection des travailleurs contre les risques liés à l'exposition à des agents cancérigènes ou mutagènes au travail est applicable aux substances appartenant aux catégories 1A et 1B de la classification européenne. Une substance est classée en catégorie 2 quand les données issues d’études adéquates chez l’animal sont insuffisantes pour la classer en catégorie 1B. C'est le cas de nombreux pesticides. Il est donc important de ne pas se limiter aux tests conventionnels de l'OCDE, et de développer de tests expérimentaux alternatifs afin de déterminer si ces substances sont associées à un risque accru de LLA. Leur classement éventuel en catégorie 1B permettrait en effet aux salariés exposés de bénéficier d'un meilleur niveau de protection. Pesticides: La notion de pesticide n'est pas clairement délimitée (INSERM, 2013). Dans le domaine agricole, le règlement CE N°1107/2009 utilise le terme de "phytopharmaceutique", qui n'inclut pas les engrais ni les rodenticides: il s'agit d'un produit visant à protéger les cultures et les récoltes contre les organismes nuisibles, notamment les insectes (insecticide), les moisissures (fongicide) et les mauvaises herbes (herbicide). La directive CE N°2009/128 relative au développement durable et le règlement CE N°1185/2009 relatif aux statistiques utilisent quant à eux le terme de pesticide. Il convient aussi de prendre en compte les usages non agricoles de ces substances, mais aussi l'usage non professionnel, notamment domestique, qui entraîne également des problèmes sanitaires. La notion de pesticide au sens des textes européens regroupe les substances actives, mais aussi d'autres substances susceptibles d'être utilisées conjointement:  phytoprotecteurs, visant à protéger les plantes des effets indésirables éventuels de la substance active  synergistes, visant à potentialiser l'effet des substances actives  coformulants, qui n'ont en principe pas d'activité sur les végétaux ni sur les nuisibles. Des adjuvants peuvent également être mélangés aux phytoprotecteurs préalablement à leur usage. Les substances actives appartiennent à de nombreuses familles chimiques (Figure 1, page suivante), ce qui implique des propriétés de rémanence environnementale et d'action toxicologiques distinctes (INSERM, 2013). Les risques sanitaires liés aux pesticides sont pris en compte par la réglementation communautaire. 6
  7. 7. Contexte réglementaire européen relatif à l'évaluation et à l'usage des pesticides: L'usage des pesticides dans l'Union Europrénne est encadré par plusieurs dispositions. Le règlement CE N°1107/2009 concerne spécifiquement l'usage agricole, avec deux objectifs principaux. D'une part, il vise à maintenir la compétitivité de l'agriculture européenne et à faciliter la libre circulation des pesticides en simplifiant les démarches administratives d'autorisation d'utilisation. D'autre part, il vise à augmenter le niveau de protection des populations et de l'environnement. Ce règlement attribue l'initiative de l'homologation des nouveaux pesticides à un Etat membre rapporteur, l'homologation dans cet Etat devant permettre la libre circulation du pesticide par reconnaissance mutuelle dans les autres Etats, dans les limites de trois zones principales considérées comme étant homogènes au niveau des pratiques agricoles (Nord, Centre et Sud). Ce réglement définit des groupes vulnérables devant faire l'objet d'une évaluation et d'une protection particulières: femmes enceintes, enfants, travailleurs et habitants fortement exposés. Les critères d'évaluation sont peu détaillés et sont laissés à l'initiative de l'Etat rapporteur. Toutefois, un prinipe général consiste à réduire l'expérimentation animale sur les vertébrés. L'Etat membre est également tenu d'assurer la confidentialité des données d'évaluation qui lui sont soumises. La directive CE N°2009/128 relative au développement durable prend également en compte les 7
  8. 8. usages non professionnels. Elle vise à réduire l'utilisation globale des pesticides, en favorisant les méthodes de substitution et en améliorant la formation et l'information des utilisateurs. Elle préconise également une amélioration de l'évaluation des risques liés à l'usage des pesticides. Les recommandations de cette directive reposent sur l'élaboration de plans nationaux d'évaluation des risques et de réduction de l'usage de pesticides basés sur des objectifs quantitatifs. La directive CE N°1185/2009 relatives aux statistiques prévoit un cadre commun pour la production de statistiques relatives à la commercialisation et à l'usage de pesticides dans l'Union. Le règlement CE N°1107/2009 relatif à la mise sur le marché et les directives CE N°2009/128 relative au développement durable et CE N°2009/128 relative aux statistiques établissent donc un cadre favorable à l'étude des impacts sanitaires des pesticides, tant au niveau professionnel qu'au niveau de la population générale. Risque sanitaires liés aux pesticides: Même s'il existe des limites méthodologiques aux études épidémiologiques et si les arguments expérimentaux sont peu nombreux, l'exposition aux pesticides pose un problème de santé publique qui justifie à la fois la réalisation d'études épidémiologiques supplémentaires et le développement de modèles expérimentaux visant, d'une part, à approfondir l'étude des effets des molécules déjà commercialisées, mais aussi, à l'avenir, de pouvoir effectuer une sélection des nouvelles molécules en cours de développement. Le risque de cancer chez l'enfant semble supérieur à celui qui est observé chez l'adulte, ce qui indique une plus grande susceptibilité (Zahm, 1998). Les effets néfastes de l'exposition aux pesticides chez l'enfant sont multiples. Trois fenêtres d'exposition sont impliquées: tout d'abord une fenêtre anténatale (toxicité sur les cellules germinales), ensuite une fenêtre prénatale (embryo/foetotoxicité) et enfin une fenêtre postnatale. Du fait de différences métaboliques, le foetus et l'enfant présenteraient une sensibilité accrue par rapport à l'adulte (Garry, 2004). Des avortements spontanés et des malformations sont imputés à l'exposition aux pesticides (Garry, 2004), ainsi que des effets neurologiques et endocriniens (Garry, 2004). L'exposition aux pesticides est également incriminée dans la survenue de cancers: hémopathies malignes (leucémies et lymphomes non hodgkiniens), dont la leucémie aiguë lymphoblastique de l'enfant, tumeurs cérébrales et sarcomes (Zahm, 1998). Leucémie aiguë lymphoblastique: La leucémie aiguë constitue la forme de cancer la plus fréquente chez l'enfant (Kim, 2006). On distingue de façon générale la forme myéloblastique et la forme lymphoblastique, qui est la plus fréquente. Il s'agit d'une prolifération maligne de précurseurs de la lignée lymphoïde, contrairement aux lymphomes, au myélome et la leucémie lymphoïde chronique qui sont constitués d'éléments plus différenciés. Le diagnostic formel est porté par la biopsie de moëlle osseuse. Deux types de classification diagnostique coexistent actuellement. Il s'agit d'une part, de la classification Franco-Américano-Britannique (dite classification FAB), qui repose uniquement sur des critères cytologiques, et d'autre part, de la classification de l'OMS, qui repose sur des critères cytogénétiques. La classification FAB tombe en désuétude en raison de son absence d'informativité pronostique:  LLA1: petits lymphoblastes  LLA2: grands lymphoblastes  LLA3: LLA de type Burkitt. 8
  9. 9. L'étude immunophénotypique, basée sur l'expression des marqueurs lymphoïdes normaux, permet une classification pronostique, de valeur toutefois inférieure à la cytogénétique. La classification de l'OMS inclut sans distinction les formes de l'enfant et celles de l'adulte. Les anomalies cytogénétiques décrites ont une valeur pronostique importante: - Leucémie aiguë lymphoblastique B sans autre spécification - Leucémie aiguë lymphoblastique B avec anomalies cytogénétiques récurrentes :  (t9;22)(q34;q11.2): BCR-ABL1  t(v;11q23): MLL réarrangé  t(12;21)(p13;q22): TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)  hyperdiploïdie  hypodiploïdie  t(5;14)(q31;q32): IL3-IGH  t(1;19)(q23;p13.3): TCF3 – PBX1 Ces anomalies moléculaires méritent d'être prises en compte dans l'étude du lien entre exposition aux pesticides et leucémies. Lien entre exposition aux pesticides et leucémies: Les données epidémiologiques actuellement disponibles mettent en évidence un lien entre exposition aux pesticides et survenue de leucémies chez l'enfant. Il existe toutefois des difficultés relatives à la caractérisation qualitative et quantitative de l'exposition mais aussi une absence de classification diagnostique précise, certaines études examinant les leucémies aiguës en général, tandis que d'autres considèrent plus spécifiquement la forme lymphoblastique, mais sans classification détaillée sur le plan cytogénétique. Il serait nécessaire, d'une part, de faciliter la mise à disposition de données d'exposition utiles aux études épidémiologiques, et d'autre part, d'encourager les études de toxicologie expérimentale prédictive. Les connaissances physiopathologiques actuelles mettent en évidence l'origine prénatale de la LLA de l'enfant, ce qui pose la question de l'étude spécifique de la fenêtre d'exposition prénatale. Dans la majorité des cas, les anomalies cytogénétiques initiales ne suffisent pas à déclencher la maladie, des mutations additionnelles, des effets épigénétiques ainsi que de probables anomalies immunologiques sont décrits. Le rôle de l'exposition aux pesticides dans la survenue de ces étapes postérieures aux anomalies cytogénétiques initiales doit donc être étudié, d'autant plus que les données épidémiologiques actuellement disponibles n'excluent pas le rôle de l'exposition postnatale même si le lien apparaît moins clairement. Outre le rôle des pesticides, d'autres facteurs environnementaux sont susceptibles d'être impliqués, ce qui pose le problème des interactions potentielles et de leur nature (additives ou potentialisatrices). Il est donc important de développer des modèles de toxicologie expérimentale permettant, d'une part, de préciser le niveau auquel les pesticides connus peuvent exercer leur action, et d'autre part, de permettre une évaluation en amont du risque lié aux nouvelles substances en cours de développement. Le risque final de développement d'une LLA dépend non seulement de facteurs environnementaux, dont les pesticides, mais aussi de facteurs génétiques, portant notamment sur le métabolisme des xénobiotiques. Les limitations liées à l'approche gène-candidat peuvent être surmontées par le développement de stratégies d'étude du génome entier, permettant de découvrir des polymorphismes au niveau de gènes non suspectés, voire inconnus. 9
  10. 10. II. PHYSIOPATHOLOGIE II.1. NOTIONS GENERALES SUR L'ONCOGENESE: II.1.1. MODELE D'HANAHAN ET WEINBERG: Il est classiquement admis que la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse résulte de mutations de gènes impliqués dans la régulation de la prolifération cellulaire (Hanahan et Weinberg, 2000). Ces mutations peuvent affecter des oncogènes, par gain de fonction, ou des anti- oncogènes, par perte de fonction (Figure 2). L'allèle muté est dominant dans le cas d'un oncogène et récessif dans le cas d'un anti-oncogène. Le nombre et le type de gène muté sont variables selon le type de tumeur considéré, ainsi que d'un patient à un autre. Hanahan et Weinberg (2000) proposent une définition de la malignité basée sur l'existence des six caractéristiques générales suivantes. 1/ Perte de dépendance aux signaux extérieurs induisant la prolifération: La prolifération d'une cellule non transformée au sein d'un tissu dépend de facteurs paracrines. 10
  11. 11. Lorsque des cellules normales sont mises en culture, l'adjonction de facteurs de croissance dans le milieu est nécessaire à leur multiplication. Ces signaux induisant la prolifération agissent par l'intermédiaire de récepteurs transmembranaires. Ces derniers activent diverses voies de transduction du signal, du cytoplasme vers le noyau, afin d'enclencher l'entrée en mitose. Une cellule tumorale acquiert une autonomie par sécrétion autocrine de facteurs de croissance ou le plus souvent par activation constitutionnelle d'une protéine impliquée dans la transduction du signal. 2/ Perte de sensibilité aux signaux extérieurs inhibant la prolifération: L'homéostasie tissulaire résulte d'un équilibre entre les différents signaux activant ou inhibant la prolifération. L'inhibition de la prolifération va de pair avec l'entrée en différenciation. Outre les facteurs circulants, la matrice extra-cellulaire et les jonctions inter-cellulaires sont également impliquées dans l'inhibition de la prolifération.Ces signaux inhibiteurs deviennent inopérants dans les cellules tumorales. 3/ Perte de la capacité d'entrer en apoptose: La mort cellulaire programmée, ou apoptose, est un mécanisme ubiquitaire participant à l'homéostasie tissulaire. L'apoptose est régulée par des signaux externes mais aussi intracellulaires. Ces signaux activateurs ou inhibiteurs activent des voies de signalisation spécifiques. L'éventuelle entrée en apoptose se traduit par une fragmentation de l'ADN nucléaire, une destruction du cytosquelette et une dispersion finale de la cellule sous forme de corps apoptotiques. Contrairement à la nécrose, la membrane cellulaire n'est pas rompue et le contenu de la cellule n'est pas répandu dans le milieu ambiant. Les cellules cancéreuses ont la propriété d'échapper à l'apoptose, par altération des voies effectrices (gain de fonction d'une protéine anti-apoptotique ou perte de fonction d'une protéine pro- apoptotique). 4/ Capacité de réplication illimitée: Les cellules normales ont un potentiel de réplication limité. Ainsi, la plupart des cellules humaines en culture perdent la capacité de se diviser au bout de 60 à 70 mitoses successives. Ce phénomène provient d'une érosion progressive des extrémités des chromosomes, les télomères, qui sont constitués de séquences répétées de 6 pb. Les télomères sont raccourcis à chaque mitose en raison de l'incapacité des DNA polymérases à répliquer la chromatide jusqu'à son extrémité, induisant une perte de 50 à 100 pb par mitose. Les chromosomes ainsi tronqués s'assemblent par l'intermédiaire de mécanismes de réparation inappropriés, ce qui induit des anomalies caryotypiques devenant incompatibles avec la survie de la cellule. Une enzyme permet la maintenance des télomères, en ajoutant les nucléotides perdus: il s'agit de la télomérase. Elle n'est normalement pas exprimée par les cellules différenciées, au contraire des cellules tumorales dans lesquelles la maintenance des télomères est presque constamment observée. 5/ Augmentation de l'angiogenèse: La croissance d'une tumeur solide n'est pas possible sans un apport soutenu en oxygène et en nutriments. Les cellules normales sécrètent des facteurs activateurs et inhibiteurs de l'angiogenèse, dont les effets antagonistes aboutissent à une adaptation régulée de la microcirculation locale. Un déséquilibre est observé au niveau des cellules tumorales, au profit des facteurs activateurs. 11
  12. 12. L'inhibition de l'angiogenèse est une piste thérapeutique explorée depuis une dizaine d'années. 6/ Invasivité et pouvoir métastatique: La capacité des cellules tumorales à envahir les tissus adjacents et surtout à proliférer à distance de la tumeur primitive repose sur deux caractéristiques. D'une part, les cellules tumorales deviennent insensibles à l'inhibition de contact, par mutation de protéines d'adhérence impliquées dans les jonctions inter-cellulaires ou d'autres protéines assurant la transduction du signal généré par les protéines d'adhérence. D'autre part, on observe une augmentation de sécrétion de protéases par les cellules tumorales, ce qui permet l'infiltration des tissus sains par digestion de la matrice extra-cellulaire. Les deux derniers critères (5 et 6) sont plus spécifiques des tumeurs solides. Les auteurs soulignent que l'ordre chronologique d'acquisition de ces six caractéristiques fondamentales est variable selon le type de tumeur considéré. Par ailleurs, chacune de ces caractéristiques n'est pas forcément reliée à une mutation spécifique, une mutation donnée pouvant à elle seule induire plusieurs de ces caractéristiques, tandis que l'acquisition d'une autre de ces six caractéristiques peut nécessiter la survenue de plusieurs mutations distinctes. Le modèle d'Hanahan et Weinberg demeure valide dans ses fondements principaux. Cependant, des données plus récentes contribuent à modifier la vision actuelle de la physiopathologie du cancer. Tout d'abord, ce modèle se base sur l'acquisition d'anomalies de nature purement génétique. Or, des études récentes mettent en évidence la coexistence de mécanismes de nature épigénétique contribuant également à activer des oncogènes ou à réprimer des anti-oncogènes. Ensuite, un nombre croissant d'études tend à montrer le caractère hétérogène des populations cellulaires tumorales, avec la notion de cellules-souches tumorales, qui possèdent les six caractéristiques fondamentales, tandis que les autres cellules n'en posséderaient qu'une partie et perdraient notamment la capacité de réplication illimitée. Enfin, ce modèle apparaît réducteur dans la mesure où il tend à présenter l'acquisition et le maintien des caractéristiques tumorales comme des phénomènes autonomes intrinsèques à la cellule tumorale, alors que des données récentes soulignent le rôle de l'environnement cellulaire (concept de niche). Les notions de modification épigénétique, de cellule-souche et de niche sont en partie interdépendantes. La propriété de cellule-souche résulte en effet d'une configuration épigénétique spécifique (Shackleton, 2009) et dépend du microenvironnement, dénommé niche (Morrison, 2008). II.1.2. MECANISMES EPIGENETIQUES: Le qualificatif d’ « épigénétique » s’applique à un mécanisme de répression génique qui a la propriété, d’une part, d’être transmissible à la descendance (ce qui sous-entend également la descendance de cellules en culture), et d’autre part, de ne pas reposer sur une mutation de la séquence du gène ou de sa région régulatrice, contrairement à un mécanisme de nature génétique (Wolffe, 1999). Ce mécanisme est responsable, par exemple, de l’inactivation de l’un des deux chromosomes de chaque paire chez l'être humain (imprinting), mais il est largement impliqué dans la différenciation et le développement (Egger, 2004). Les mécanismes de la régulation épigénétique reposent sur la méthylation de l’ADN et diverses modifications de histones, mais aussi sur l'action de micro-ARN (Chen, 2010). La méthylation de l’ADN concerne les ilôts CpG présents dans la région promotrice d’environ 40% 12
  13. 13. des gènes humains (Egger, 2004). L’annotation CpG est employée à la place de CG afin de préciser qu’il s’agit d’une séquence binucléotidique, « p » représentant le radical phosphate qui relie les nucléosides, et non pas de l’appariement de deux bases complémentaires. Le radical méthyle est introduit par une DNA méthyle transférase (DNMT) au niveau de la cytosine de CpG (Egger, 2004). Des anomalies de méthylation sont retrouvées à un stade précoce de l’oncogenèse (Egger, 2004; Chen, 2010). Certaines molécules, telle la 5-azacytidine, inhibent la méthylation de l’ADN et réactivent l’expression de gènes réprimés par méthylation (Egger, 2004). Les modifications des histones aboutissent à une régulation de la transcription par des effets stériques. Le rapprochement des histones par le biais de liaisons électrostatiques confère à l’ADN une conformation défavorable à la fixation du complexe de transcription. Au contraire, une modification de charge aboutissant à des interactions de nature répulsive déploie l’ADN et favorise la transcription. Ces modifications chromatiniennes sont observables en cytogénétique, la chromatine décompactée, appelée euchromatine, correspondant aux régions chromosomiques où la transcription est active, contrairement à la chromatine compactée, appelée hétérochromatine. L’acétylation de certaines lysines favorise ainsi la transcription. Le taux d’acétylation des histones d’un gène donné correspond à un équilibre entre l’activité des histone acétyle transférases (HAT) et des histone désacétylases (HDAC) (Egger, 2004). L’activité des HDAC est inhibée par certaines molécules telle la trichostatine A. Ces molécules réactivent donc des gènes réprimés par désacétylation des histones. La méthylation de certaines lysines par des histone méthyle transférases aboutit à une augmentation ou à une diminution de la transcription selon la lysine concernée (Egger, 2004). Les rôles respectifs de la méthylation de l’ADN et des modifications des histones, ainsi que les modes de régulation de ces mécanismes, sont complexes et commencent à peine à être caractérisés. Le rapport éventuel entre les deux phénomènes est imparfaitement élucidé. La méthylation de l’ADN peut déclencher la désacétylation des histones. La protéine MeCP2 se fixe ainsi aux ilôts CpG méthylés et recrute les HDAC (Wolffe, 1999). La séquence inverse a également été observée (Egger, 2004). L’origine des signaux entraînant l’activation de ces mécanismes est complexe. Les enzymes impliquées peuvent être recrutées par des facteurs de régulation de la transcription. De manière générale, par comparaison avec le tissu normal, le génome des cellules tumorales est l'objet d'une hypométhylation globale dès un stade précoce, avec des zones d'hyperméthylation (Feinberg, 2006). L'hypométhylation semble entraîner une instabilité génomique (Feinberg, 2006; Jones, 2007). Elle est également responsable d'une augmentation d'expression de certains oncogènes, tels RAS dans le cancer gastrique ou PAX2 dans le cancer de l'endomètre (Feinberg, 2006). L'hyperméthylation ponctuelle est impliquée dans la répression de divers anti-oncogènes, notamment APC et GATA-4 dans le cancer colique, P16 dans le mélanome (Feinberg, 2006; Jones, 2007). Des modifications globales sont également constatées au niveau des histones. La perte d'acétylation de la lysine 16 et la triméthylation de la lysine 20 de l'histone H4 semblent être des caractéristiques typiques des cancers humains (Jones, 2007). Les microARN (miRNA) sont des séquences non codantes d'environ 22 pb, qui inhibent la transcription de l'ARN messager cible ou entrainent sa dégradation (Chen, 2010). Ils régulent en particulier la traduction d'ARN de gènes et d'anti-oncogènes, et une perturbation de leur taux est 13
  14. 14. observée dans les tissus tumoraux, notamment les leucémies (Chen, 2010). Il est classiquement admis que la carcinogenèse repose sur deux étapes successives: en premier lieu l'initiation, consistant en une mutation génique, puis la promotion, entraînant une prolifération préférentielle de la cellule mutée en raison de l'avantage sélectif conféré par la mutation initiale. La présence d'anomalies épigénétiques préalables serait en faveur, dans certains cas, d'un ordre inversé (Feinberg, 2006). On décrit ainsi une perte d'imprinting du gène IGF2 dans les cellules intestinales normales de certains patients atteints de cancer colique. Feinberg (2006) propose un modèle selon lequel des anomalies épigénétiques polyclonales constitueraient la première étape de la carcinogenèse. Ce modèle n'est basé que sur des hypothèses et les preuves expérimentales tendant à le généraliser manquent dans l'immédiat. Néanmoins, sans aller jusqu'à généraliser le rôle précurseur des altérations épigénétiques dans la survenue du cancer, on peut en revanche admettre avec un niveau de preuve suffisant que les modifications épigénétiques peuvent constituer une alternative aux mutations géniques au stade où celles-ci surviennent (Jones, 2007). II.1.3. CELLULES SOUCHES TUMORALES: La plupart des tissus font l'objet d'un renouvellement cellulaire permanent et sont organisés de façon hiérarchique avec un degré de différenciation croissant. Ce renouvellement est assuré par les cellules-souches, qui sont définies par la capacité à s'auto- renouveler durant toute la vie de l'individu et à engendrer des cellules s'engageant dans le processus de différenciation (Knoblich, 2008). Les cellules en cours de différenciation perdent cette capacité d'auto-renouvellement (Huntly, 2005). Les cellules-souches peuvent subir une division symétrique, aboutissant à deux cellules-souches afin d'augmenter le pool de cellules-souches ou de compenser un déficit, ou bien une division asymétrique générant une autre cellule-souche et un progéniteur s'engageant dans la différenciation (Knoblich, 2008). Le concept ce cellules-souches tumorales provient de deux constatations. D'une part, les tumeurs sont souvent hétérogènes: elles sont constituées de cellules présentant divers degrés de différenciation (Shackleton, 2009). D'autre part, des expériences parfois anciennes montrent que seule une proportion minoritaire de cellules tumorales, souvent inférieure à 1% (Rosen, 2009), est capable de proliférer in vitro ou de générer une nouvelle tumeur in vivo (Huntly, 2005). Le modèle classique est celui de la xénogreffe chez la souris NOD/SCID. Des dilutions limites de suspension cellulaire sont effectuées afin de calculer la fréquence des cellulles capables de générer une tumeur après injection. Des transplantations itératives d'une souris à une autre permettent de confirmer l'existence et la proportion de ces cellules (Huntly, 2005). Ces éléments suggèrent que les cancers sont organisés selon les mêmes principes que les tissus normaux, avec des cellules-souches tumorales capables de s'autorenouveler et d'engendrer des cellules tumorales plus différenciées mais dénuées de capacité d'autorenouvellement indéfinie (Huntly, 2005; Rosen, 2009; Shackleton, 2009). Cette hypothèse a été validée dans des cas où il est possible d'identifier les cellules-souches tumorales et de les séparer des autres cellules tumorales et non tumorales par cytométrie en flux avant xénogreffe. Par analogie avec l'hématopoïèse normale, il a ainsi été démonté, dans le cas de diverses leucémies aiguës myéloblastiques et lymphoblastiques, que seule la sous-population de phénotype CD34+CD38- (comme la cellule-souche normale) possédait la capacité de reproduire une masse tumorale chez la souris NOD/SCID ainsi que d'engendrer les autres sous-populations observées 14
  15. 15. chez les patients par transplantations itératives (Huntly, 2005). Des constatations similaires ont été faites pour certaines tumeurs solides. Ainsi, des cellules-souches de tumeur cérébrale ont été identifiées, sur la base de l'expression de CD133, de même que des cellules-souches de tumeur mammaire (phénotype CD44+/CD24low/lineage-) (Rosen, 2009). Le modèle stochastique est une alternative proposée au modèle de la cellule-souche tumorale. Ce modèle suppose que toute cellule tumorale serait susceptible de s'autorenouveler et d'engendrer les différents phénotypes cellulaires observés, mais avec une probabilité plus ou moins faible et dépendante des conditions environnementales (Huntly, 2005; Shackleton, 2009). Il repose sur deux constatations. D'une part, certaines tumeurs humaines ne semblent pas comporter de cellules-souches clairement identifiables. Ainsi, dans le cas du mélanome, environ 25% des cellules tumorales produisent une nouvelle tumeur après xénotransplantation, et aucune différence phénotypique ne permet d'identifier et de séparer ces cellules (Rosen, 2009). Cependant, des marqueurs spécifiques pourraient être découverts à l'avenir (Shackleton, 2009). D'autre part, le modèle même de la xénogreffe pose le problème de différences environnementales (système immunitaire, facteurs de croissance divers) qui soulèvent la question de la transposabilité des résultats observés chez la souris à l'homme (Shackleton, 2009; Rosen, 2009). Des expériences de greffe syngénique de tumeurs murines sur des souris de même lignée tendent néanmoins à reproduire les observations faites dans le cadre de xénogreffes (Rosen, 2009). En l'état actuel, l'existence de cellules-souches tumorales dans un type de tumeur donné ne peut donc être affirmée avec certitude que s'il existe un marqueur spécifique permettant de les différencier (Shackleton, 2009). Il est important de préciser que l'existence de cellules-souches cancéreuses ne signifie pas que la cellule-souche normale soit nécessairement la cible du processus de cancérisation. Ainsi, la transfection de progéniteurs hématopoïétiques sains par un vecteur contenant un gène chimérique résultant d'une translocation chromosomique de leucémie permet de produire des cellules leucémiques dont certaines possèdent des propriétés de cellules-souches (Huntly, 2005; Flynn, 2007). II.1.4. NOTION DE MICROENVIRONNEMENT (NICHE): Le concept de niche définit un microenvironnement tissulaire capable d'abriter et de maintenir les cellules-souches. La première évidence expérimentale provient de la constatation que des cellules- souches transplantées ne survivent et croissent que dans des sites particuliers, qui ont la propriété d'être saturables (Morrison, 2008). La possibilité de repeupler un environnement tissulaire donné par introduction de nouvelles cellules-souches suite à une éradication préalable permet de confirmer qu'il s'agit d'une niche (Morrison, 2008). Les cellules-souches tumorales dépendent-elles d'une niche spécifique ? La réponse suppose qu'il soit préalablement possible d'identifier clairement ces cellules-souches, et selon les critères d'Hanahan et Weinberg, on peut imaginer que la dépendance à la niche est moindre par comparaison aux cellules-souches normales (Morrison, 2008). En revanche, il est admis que la niche contribue à la résistance des cellules aux thérapies anticancéreuses conventionnelles (Morrison, 2008; Raaijmakers, 2011). Une étude portant sur les tumeurs cérébrales montre cependant que les cellules-souches tumorales dépendent pour leur maintenance de la présence de cellules endothéliales, in vitro et in vivo (Morrison, 2008). Le nombre limité de données expérimentales ne permet pour le moment pas de généraliser la nécessité d'une niche pour d'autres types de tumeurs. 15
  16. 16. Une question majeure concerne le rôle de la niche dans le processus de carcinogenèse. Des leucémies dérivant du greffon sont observées chez des patients ayant bénéficié d'une greffe de cellules-souches hématopoïétiques, avec une incidence variant de 0,12 à 5% (Flynn, 2007). Sachant que les donneurs sont indemnes de leucémie, le phénomène reste inexpliqué. L'endommagement de la niche médullaire par le traitement myéloablatif préalable pourrait conduire à une cancérisation des cellules du donneur, par altération des signaux régulant la prolifération (Flynn, 2007; Raaijmakers, 2011). Une myélodysplasie, représentant un état pré-leucémique, peut être induite chez la souris par délétion du gène Dicer1 au niveau des précurseurs des ostéoblastes (Raaijmakers, 2011). Les ostéoblastes constituent un des éléments de la niche des cellules souches hématopoïétiques (Morrison, 2008). Dans l'étude citée, la greffe de cellules dysplasiques ainsi produites chez la souris normale rétablit une hématopoïèse normale. A l'inverse, la greffe de cellules normales chez la souris présentant l'anomalie de la lignée ostéoblastique reproduit une myélodysplasie (Raaijmakers, 2011). Les données actuelles ne permettent pas de savoir si la niche possède un rôle initiateur ou simplement promoteur par activation de la prolifération de cellules-souches préalablement mutées (Raaijmakers, 2011). II.2. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA LEUCEMIE AIGUE LYMPHOBLASTIQUE DE L'ENFANT II.2.1. GENERALITES: La leucémie aiguë lymphoblastique (LLA) est une prolifération maligne de précurseurs de la lignée lymphoïde, siégeant dans la moëlle osseuse mais aussi dans d’autres organes (MeSH). Les anomalies chromosomiques à l’origine de la transformation maligne sont, le plus souvent, des translocations uniques impliquant des proto-oncogènes (Pui, 2004) (Figure 3, page suivante). Dans certains cas, on retrouve des altérations caryotypiques globales : hyperdiploïdie avec présence de plus de 50 chromosomes (25% des cas chez l’enfant) et plus rarement hypodiploïdie avec présence de moins de 45 chromosomes (1% des cas chez l’enfant) (Pui, 2004). Des mutations additionnelles sont le plus souvent nécessaires à la transformation maligne (Pui, 2004). Près de 90% des LLA de l’enfant ont un phénotype de lignée B (Pui, 2004). L’anomalie chromosomique la plus fréquente (22 % des cas de LLA chez l’enfant) est la translocation t(12 ;21), générant le facteur de transcription chimérique TEL-AML1 (synonyme de ETV6-RUNX1) (Pui, 2004). On retrouve ensuite les translocations impliquant le gène Mll, situé sur le chromosome 11 (8% des cas chez l’enfant), la translocation t(1 ; 19) produisant la protéine chimérique E21-PBX1 (5% des cas) et la translocation t(9 ; 22) produisant la protéine chimérique BCR-ABL (3% des cas) (Pui, 2004). 16
  17. 17. II.2.2. DESCRIPTION ET ORIGINE DES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES LES PLUS COURANTES: TEL-AML1 : TEL et AML1 sont des facteurs de transcription préférentiellement exprimés par la cellule souche hématopoïétique, par opposition à d’autres facteurs associés à la différenciation en lignées spécifiques (Orkin, 2008). TEL est impliqué dans la domiciliation des progéniteurs dans la moëlle osseuse (Pui, 2004). AML1 est un facteur de transcription pourvu d'un domaine de fixation à l'ADN (Pui, 2004). A l'état normal, AML1 active notamment la transcription de gènes de la famille HOX, impliqués dans l'autorenouvellement et la différenciation. La protéine chimérique TEL-AML1 agit comme un inhibiteur compétitif de la protéine AML1 normale, ce qui a pour effet de diminuer la transcription des gènes cibles (Pui, 2004). Chez les malades, la translocation est retrouvée dans une sous-population médullaire de phénotype CD34+CD38-CD19+, ce qui correspond à un progéniteur de lignée B (Castor, 2005). Ces cellules possèdent des propriétés de cellules souches leucémiques démontrées par transplantation itérative chez la souris NOD/SCID. La translocation n’est pas retrouvée dans la lignée d’amont CD34+CD38-CD19-, ce qui indique qu’elle surviendrait donc au niveau du progéniteur B (Castor, 2005 ; Hong 2008). Des cellules de phénotype CD34+CD38-CD19+ comportant la mutation ont été retrouvées chez des jumeaux non malades, mais ne sont pas observées chez le sujet sain (Hong, 2008). L’analyse de la recombinaison des gènes d’immunoglobulines retrouve les mêmes clones chez les jumeaux sains et malades, le degré de recombinaison étant toutefois plus avancé chez le jumeau malade, ce qui témoigne d’un degré de différenciation supplémentaire par rapport aux cellules pré-leucémiques. 17
  18. 18. La xénogreffe de cellules humaines de cordon ombilical préalablement transfectées avec un vecteur lentiviral exprimant le gène chimérique fait apparaître des cellules de phénotype CD34+CD38- CD19+, qui, sans toutefois générer de leucémie, possèdent des caractéristiques de cellules souches (Hong, 2008). Cette translocation ne suffit pas à elle seule à déclencher une leucémie. Un modèle murin basé sur la transfection non virale du gène chimérique ne retrouve pas d’avantage prolifératif des cellules souches exprimant le gène par rapport aux autres cellules souches (Schindler, 2009). Cette étude montre en revanche un blocage de différenciation lymphoïde, spécifiquement chez la souris adulte, mais pas chez le souriceau ni chez l’embryon, ce qui, extrapolé à l'homme, expliquerait que la maladie soit rare à l'âge adulte (Schindler, 2009). Un excès de leucémies est observé chez les souris transgéniques, par rapport aux témoins, uniquement après exposition des souris à un agent mutagène, la N-éthyl-nitroso-urée (ENU). Les effets de la translocation ont également été étudiés chez le zebrafish (Sabaawy, 2006). Les lignées de poisson transgéniques ont été créées par microinjection embryonnaire, le gène chimérique étant placé soit sous le contrôle du promoteur de la béta-actine, permettant une expression ubiquitaire, ou sous le contrôle du promoteur de RAG2 (protéine impliquée dans la recombinaison des immunoglobulines et des gènes TCR), permettant une expression spécifique dans la lignée lymphoïde. Aucune anomalie particulière n'est observée avec le promoteur RAG2. En revanche, l'expression ubiquitaire du gène chimérique conduit à un arrêt de la maturation lymphocytaire chez les poissons transgéniques, ainsi qu'à la survenue de leucémie dans environ 3% des cas, dans un délai de 8 à 12 mois. MLL: MLL (mixed lymphoïd leukemia) est un facteur de transcription spécifique de la cellule souche hématopoïétique, impliqué dans le maintien de la transcription de gènes de la famille HOX (Orkin, 2008). Le gène MLL peut être impliqué dans un nombre important de translocations aboutissant à des protéines chimériques différentes (Pui, 2004), dont le point commun est de posséder une activité dérégulée dans le sens d'une augmentation de l'activité transcriptionnelle (Pui, 2004; Orkin, 2008). Les partenaires de fusion sont nombreux, mais certains sont retrouvés à une fréquence plus élevée. Ainsi, dans plus de 90% des cas de LLA liées à MLL, les gènes impliqués sont AF4 (le plus fréquent), AF9, ENL et AF10 (Mohan, 2010). Des partenaires de fusion rares ou inconnus peuvent être identifiés par LDI-PCR (long distance inverse PCR) (Meyer, 2005). Le rôle précis des partenaires de fusion dans l'induction de la LLA n'est pas totalement connu, l'hypothèse la plus probable étant le recrutement de protéines stimulant la transcription au niveau de l'élongation de l'ARN messager, par interaction avec l'ARN-polymérase II (Mohan, 2010). Ces protéines font partie, à l'état normal, de complexes d'élongation dont la structure et la composition commencent à être élucidées (Biswas, 2011). Le gène chimérique MLL-AF9 possède la capacité de transformer les cellules souches hématopoïétiques murines in vitro après transfection rétrovirale (Biswas, 2011). Dans cette étude, seul le gène AF9 sauvage induit une transformation. Des variants produits par mutagenèse dirigée ne produisent aucun effet cellulaire, de même qu'ils se révèlent incapables de se polymériser avec les autres constituants des complexes d'élongation, contrairement à l'allèle sauvage. Contrairement à TEL-AML1, il n'existe pas de modèle animal fiable permettant de décrire la physiopathologie des translocations impliquant MLL. Les modèles murins développés ont en effet abouti au développement de pathologies différentes (leucémies aiguës myéloblastiques ou lymphomes) avec, de plus, des délais supérieurs à ceux qui sont observés chez l'homme (Bueno, 2011). 18
  19. 19. La cellule d'origine reste également à identifier. La translocation MLL-AF4 semble survenir à un stade relativement précoce du développement embryonnaire, probablement au niveau d'un précurseur préhématopoïétique, car, contrairement à d'autres translocations courantes dans les LLA de l'enfant, elle est retrouvée au niveau des cellules souches mésenchymateuses (Menendez, 2009). Ces cellules sont diploïdes, ce qui élimine la possibilité d'une fusion cellulaire entre un blaste leucémique et une cellule souche mésenchymateuse exempte de translocation. Par ailleurs, elles ne présentent pas de réarrangements des gènes des immunoglobulines, ce qui exclut l'hypothèse d'une transdifférenciation d'un blaste. D'un point de vue fonctionnel, elles conservent une capacité de différenciation normale en ostéoblastes ou en adipocytes, en milieu de culture appropriée. Toutefois, si l'hypothèse des auteurs se vérifie, on pourrait s'attendre à retrouver la translocation également dans les autres lignées hématopoïétiques. Or ce point n'est ni vérifié expérimentalement ni discuté par les auteurs. Forme hyperdiploïde : Il s’agit d’une forme de LLA dans laquelle le caryotype des cellules leucémiques présente plusieurs chromosomes surnuméraires, c'est-à-dire triploïdes ou parfois tétraploïdes. Le nombre de chromosomes permettant de définir une LLA comme étant hyperdiploïde prête à débat. Il est proposé d’inclure dans ce groupe les caryotypes présentant entre 51 et 67 chromosomes (Paulsson, 2009). Les chromosomes surnuméraires retrouvés sont les chromosomes X, 4, 6, 10, 14, 17, 18 et 21, dans des combinaisons variables (Paulsson, 2009 ; Paulsson 2010). L’analyse par FISH retrouve un ou plusieurs chromosomes 21 surnuméraires dans 100 % des cas, avec, dans 60% des cas, une tétraploïdie voire une pentaploïdie (Paulsson, 2009). Les autres chromosomes mentionnés sont retrouvés sous forme généralement triploïde dans plus de 50% des cas (Paulsson, 2009). On retrouve également, dans la moitié des cas, des aberrations chromosomiques équilibrées, essentiellement des translocations, ainsi que des anomalies déséquilibrées, la plus fréquente étant un gain du bras 1q (Paulsson, 2009). La cellule d’origine et la séquence d’acquisition des anomalies chromosomiques ne sont pas clairement élucidées (Paulsson, 2009). De même, le mécanisme d’action de ces anomalies ainsi que la question de savoir si elles suffisent à elles seules à induire une transformation maligne restent à définir (Paulsson, 2009). II.2.3. ORIGINE PRENATALE DES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES: Le concept de l’origine prénatale des anomalies chromosomiques observées dans les LLA de l’enfant provient, d’une part, de l’étude de jumeaux monozygotes, et d’autre part, de l’analyse rétrospective de cartes de Guthrie ou de sang de cordon ombilical éventuellement conservé (Pui, 2004). Chez les jumeaux monozygotes, un taux de concordance moyen allant de 10 à 15%, mais pouvant atteindre 100% pour les cas à déclenchement postnatal, est communément décrit, indépendamment de l’anomalie cytogénétique en cause (Greaves, 2009). Le taux de concordance est de 100% pour la translocation MLL-AF4, tandis qu’il n’est que de 10% pour la translocation TEL-AML1 (Pui, 2004). Lorsque les deux jumeaux sont atteints, l’analyse moléculaire retrouve des réarrangements identiques au niveau des gènes d’immunoglobulines, ce qui indique qu’il s’agit du même clone (Pui, 2004 ; Greaves, 2009). Une constatation similaire existe pour la forme hyperdiploïde 19
  20. 20. (Paulsson, 2009). Lorsque seul l’un des jumeaux est atteint, la translocation initiale peut être retrouvée chez le jumeau sain. Ceci est décrit dans le cas de TEL-AML1 (Hong, 2008). Ces données obtenues chez les jumeaux monozygotes permettent de déduire, d’une part, l’origine prénatale de l’anomalie chromosomique initiale, et d’autre part, la nécessité de mutations additionnelles dans le déclenchement de la leucémie (Pui, 2004 ; Greaves, 2009). L’analyse rétrospective de prélèvements sanguins néonataux (cartes de Guthrie ou, plus rarement, sang de cordon ombilical) peut être effectuée par RT-PCR, à la recherche du gène chimérique ou du gène d’immunoglobulines réarrangé du clone leucémique, avec, dans le cas des cartes de Guthrie, un risque de faux négatif du à une quantité insuffisante de cellules présentes (Greaves, 2003). La présence de TEL-AML1 et de MLL-AF4 sur les cartes de Guthrie est ainsi établie (Greaves, 2003 ; Burjanivova 2006). De même, chez des enfants présentant une leucémie hyperdiploïde avec trisomie 14, les trois gènes d’immunoglobulines recombinés correspondant à chaque chromosome 14 sont retrouvés par RT-PCR sur les cartes de Guthrie (Paulsson, 2009). Des constatations similaires sont reportées à partir de prélèvements conservés de sang de cordon ombilical, dans un cas de forme hyperdiploïde ainsi que dans un autre cas avec présence de TEL- AML1 (Greaves, 2009). Bien que résultant d’observations effectuées sur des échantillons limités, la présence d’anomalies à la naissance semble nettement plus fréquente dans les leucémies aiguës lymphoblastiques que dans les formes pédiatriques de leucémies aiguës myéloblastiques (Burjanivova, 2006). La survenue d’anomalies prénatales serait un évènement relativement fréquent. Une étude portant sur 567 échantillons de sang de cordon d’enfants bien portants retrouve 6 cas de translocation TEL-AML1 par RT-PCR (Mori, 2002). Ceci représente une fréquence de 1%, ce qui est environ 100 fois supérieur à la fréquence de la LLA dans la population (Mori, 2002). Après séparation cellulaire par cytométrie en flux, l’anomalie est retrouvée sélectivement dans les lignées CD34+ et CD19+, correspondant respectivement aux cellules souches et à la lignée B. Des translocations impliquant MLL sont également décrites chez le sujet normal (Brassesco, 2008), mais leur fréquence est très variable d’une étude à l’autre (Mori, 2002 ; Janz, 2003). Ces résultats provenant d’études limitées ne sont toutefois pas surprenants, la présence de transcrits chimériques spécifiques d’hémopathies malignes de l’adulte étant décrite chez le sujet sain (Greaves, 2003 ; Janz, 2003). Ces données, bien que sujettes à des biais expérimentaux (Janz, 2003) et ne résultant pas d’études épidémiologiques rigoureuses, semblent toutefois converger avec les observations réalisées chez les jumeaux et confirment les données expérimentales tendant à montrer que ces anomalies cytogénétiques ne suffisent pas à elles seules à déclencher une leucémie. Dans le modèle actuellement admis, la survenue d’une LLA dépendrait de l’acquisition de mutations additionnelles postnatales (Greaves, 2003 ; Pui, 2004). II.2.4. MUTATIONS ADDITIONNELLES: L’identification de mutations additionnelles était jusqu’à présent limitée par la faible résolution de la cytogénétique conventionnelle, le caryotype ne permettant pas de détecter des anomalies (duplications ou délétions) inférieures à 1 Mb (Maciejewski, 2008). Par ailleurs, la sensibilité est limitée car seules les cellules en métaphase peuvent être observées. Ce problème de sensibilité a été résolu par l’introduction du FISH (fluorescent in situ hybridization), qui permet d’observer les cellules en interphase. Néanmoins, la fabrication et l’utilisation de sondes d’hybridation suppose la connaissance préalable de la séquence génétique à observer (Maciejewski, 2008). De ce fait, le FISH est couramment utilisé pour la détection des translocations initiales mais n’a pas d’utilité dans la découverte de mutations additionnelles inconnues. 20
  21. 21. Les mutations additionnelles impliquées dans la LLA peuvent être identifiées de deux manières. Il s'agit, d'une part, de l'analyse du génome tumoral par puces à ADN, et d'autre part, chez l'animal, par mutagenèse insertionnelle aléatoire suivie de séquençage. Puces à ADN: Les technologies basées sur l’emploi de puces à ADN permet à présent une identification des mutations additionnelles par examen du génome entier avec une résolution de l'ordre de la Kb (Mullighan, 2007), ce qui représente un progrès considérable par rapport au caryotype.. Ceci permet de détecter des amplifications, susceptibles d’activer des oncogènes par dosage génique, mais aussi des altérations d’anti-oncogènes. Il est classiquement admis que les anti- oncogènes sont récessifs, ce qui implique la notion de perte d’hétérozygotie : lorsqu’il existe un allèle normal et un allèle muté à l’activité altérée, la perte de l’allèle normal constitue une étape supplémentaire vers la cancérisation. La perte d’hétérozygotie peut avoir lieu selon deux modalités. Il s’agit, d’une part, de la délétion de la région chromosomique contenant l’allèle fonctionnel, et d’autre part, de la disomie uniparentale, qui résulte du remplacement de régions chromosomiques incluant l'allèle fonctionnel, voire du chromosome entier, par la séquence du chromosome homologue contenant un allèle moins fonctionnel (Heinrichs, 2010). Il est donc nécessaire de disposer de techniques d'analyse du génome permettant de détecter les délétions non visibles en cytogénétique conventionnelle mais aussi les disomies uniparentales. La technologie permettant l'analyse du génome entier la plus employée en hématologie est le SNP- A « single-nucleotide polymorphysms array » (Maciejewski, 2008). La technique SNP-A est basée sur l'identification de polymorphismes bialléliques ponctuels (une base), les SNP, présents en moyenne à des intervalles de 700 pb, avec toutefois des variations de densité en fonction de la région considérée (Heinrichs, 2008). L'ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction, puis hybridé avec des sondes complémentaires des deux allèles des SNP. Il existe deux variantes, selon que le marquage par une molécule colorante soit appliqué à l'ADN génomique ou bien aux sondes (Maciejewski, 2008). La résolution du test dépend du nombre de sondes employées. Cette technique permet une analyse du génome cellulaire sur le plan quantitatif (duplications ou délétions) mais aussi qualitatif (disomie uniparentale). La découverte d'anomalies par SNP-A au niveau du génome tumoral pose cependant le problème de leur origine. S'agit-il de mutations spécifiques aux cellules tumorales, donc susceptibles de jouer un rôle dans la pathogenèse, ou de simples anomalies congénitales présentes dans toutes les cellules de l'individu et fonctionnellement neutres ? Il est actuellement recommandé de clarifier cette question en comparant systématiquement le génome tumoral au génome de cellules saines, par exemple les cellules cutanées (Heinrichs, 2010). Une étude d'envergure par SNP-A a été réalisée chez 242 enfants atteints de LLA présentant diverses anomalies caryotypiques, avec comparaison du génome tumoral au génome normal. (Mullighan, 2007). La technique employée possède une résolution moyenne de 5 Kb. Une moyenne de 6,46 anomalies par cas est retrouvée, tous cas confondus, avec deux fois plus de délétions que d'amplifications. Des anomalies récurrentes sont identifiées, et confirmées par FISH ou PCR quantitative. Dans 40% des cas, il s'agit d'anomalies touchant des régions contenant des gènes impliqués dans la différenciation des lymphocytes B, ce qui laisse supposer qu'il s'agit d'anomalies impliquées dans la pathogenèse et non pas de simples anomalies neutres. L'observation la plus notable est la présence d'anomalies impliquant le gène PAX5 sur le chromosome 9, dans 31,7% des cas. Il s'agit de délétions de tailles variables, mono- ou bialléliques mais aussi de translocations cryptiques et de mutations ponctuelles. L'analyse par RT-PCR montre 21
  22. 22. une diminution de transcription du gène en présence de ces mutations. Le gène PAX5 est un facteur de transcription dont l'absence conduit à l'arrêt de la différenciation lymphocytaire. Les auteurs démontrent les conséquences fonctionnelles des mutations qu'ils ont identifiées de deux façons. D'une part, la cotransfection de lignées cellulaires en culture par un plasmide comportant un des mutants identifiés et un plasmide contenant le gène de la luciférase placé sous le contrôle d'un promoteur correspondant au domaine de fixation de PAX5 aboutit à une diminution de l'activité luciférase, en comparaison avec l'allèle sauvage. D'autre part, l'analyse du transcriptome des cellules leucémiques présentant des mutations de PAX5 montre une diminution d'expression de certains gènes contrôlés par PAX5. Les auteurs concluent en proposant d'examiner l'effet physiopathologique de la présence conjointe des translocations initiales (notamment TEL-AML1) et des mutations de PAX5 dans un modèle murin. Ces anomalies semblent survenir après la naissance, conformément au modèle communément admis (Greaves, 2003 ; Pui, 2004). En effet, une étude portant sur cinq paires de jumeaux malades avec présence de la translocation TEL-AML1 retrouve un profil SNP-A discordant dans chaque paire (Bateman, 2010). Une autre étude par SNP-A a été réalisée chez 74 enfants atteints de LLA hyperdiploïde (Paulsson, 2010). Le taux d'aneuploïdie des chromosomes caractéristiques ( X, 4, 6, 10, 14, 17, 18 et 21) est significativement supérieur au taux habituellement admis en cytogénétique conventionnelle. Des disomies uniparentales sont fréquemment retrouvées au niveau d'autres chromosomes, dans 27% des cas. Des microdélétions sont retrouvées dans 59% des cas. Elles portent, tout comme dans l'étude précédente, sur des gènes impliqués dans la différenciation lymphocytaire. Il s'agit avant tout du gène TEL (15% des cas). Une analyse de subclonalité révèle que 20% des mutations additionnelles sont l'objet de différence subclonale, contre seulement 3% des aneuploïdies. Bien que les chiffres présentés portent sur les anomalies décrites et non sur le nombre de patients, les auteurs en concluent que l'acquisition des mutations additionnelles est certainement postnatale, contrairement aux aneuploïdies détectables en cytogénétique conventionnelle. Mutagenèse insertionnelle suivie de séquençage: Une étude réalisée chez la souris a permis d'identifier des sites potentiels de mutations additionnelles par coexpression du gène chimérique TEL-AML1 et du transposon Sleeping Beauty (SB), qui a la propriété de s'insérer de façon aléatoire dans le génome (Van der Weyden, 2011). Le transposon perturbe l'expression des gènes dans lesquels il s'insert. Il est possible d'identifier les sites d'insertion par une technique de PCR employant des amorces spécifiques du transposon. Le séquençage du produit de PCR, qui contient des séquences du transposon mais aussi des séquences du site d'insertion, permet de déterminer ce dernier. Alors que l'expression isolée de TEL-AML1 ne suffit pas à déclencher une leucémie, 21% des souris développent une LLA de type B dans cette étude lorsque le transposon est coexprimé. Cependant, l'observation d'un groupe de souris n'exprimant que le transposon montre une survenue de LLA B dans 13% des cas, et l'étude ne précise pas si la différence avec l'autre groupe est significative sur le plan statistique. De plus, les souris développent également d'autres types de leucémies (myéloblastiques et lymphoblastiques de lignée T). De nombreux sites d'insertion correspondant à des gènes dérégulés dans les LLA B humaines sont identifiés. L'étude ne retrouve pas d'insertion au niveau de PAX5 contrairement aux résultats antérieurs obtenus par SNP-A (Mullighan, 2007), mais retrouve en revanche plusieurs sites d'insertion concernant des gènes régulant l'activité de PAX5. 22
  23. 23. II.3 MECANISMES DES TRANSLOCATIONS CHROMOSOMIQUES Les translocations réciproques sont retrouvées dans environ 30% à 40% des cas de LLA pédiatriques (Pui, 2004 ; Mitelman, 2007). La forme hyperdiploïde est quant à elle identifiée dans des proportions identiques (Pui, 2004). Dans les autres cas, aucune anomalie n’est retrouvée en cytogénétique conventionnelle, ni par des techniques plus sensibles (FISH et RT-PCR) qui requièrent une connaissance préalable des anomalies à rechercher. Les techniques à haute résolution (par exemple SNP-A) pourraient permettre d’identifier des anomalies non visibles au caryotype. Contrairement à l’étiologie des aneuploïdies de la forme hyperdiploïde, celle des translocations chromosomiques réciproques commence à être élucidée. Les translocations observées dans les leucémies sont généralement équilibrées (Greaves, 2003), ce qui signifie qu’il n’y a pas de perte de matériel génétique. Elles sont le plus souvent réciproques (Greaves, 2003), ce qui implique un échange d’ADN entre deux chromosomes. Le modèle communément admis repose sur la survenue d’une cassure double-brin touchant simultanément deux chromosomes différents, suivie d’une recombinaison illégitime résultant d’une réparation inappropriée (Greaves, 2003 ; Nickoloff, 2008). Ces translocations ne semblent pas fortuites, la survenue d’une translocation donnée impliquant la réunion des quatre conditions suivantes (Mani, 2010) : 1/ Proximité spatiale des chromatides impliquées dans le noyau 2/ Présence de séquences d’ADN ou d’une conformation spatiale de la chromatine favorisant les cassures double-brin 3/ Stress cellulaire (transcription, réplication, agent physique ou chimique génotoxique) 4/ Réparation inappropriée. Le type cellulaire est déterminant tant en terme de causalité que de conséquence à l'égard d’une translocation donnée. La présence de certaines des conditions précitées, notamment la proximité spatiale des chromatides impliquées et la conformation chromatinienne dépend de la lignée d’appartenance de la cellule et de son degré de différenciation (Mani, 2010). Par ailleurs, l’implication de la translocation dans la survenue d’une leucémie suppose également que la lignée d’appartenance et le degré de différenciation de la cellule rendent celle-ci sensible à l’action de la protéine chimérique générée (Greaves, 2003). Ces éléments peuvent expliquer que la grande majorité des translocations décrites soient spécifiques d’une catégorie cytologique précise de leucémie. Naturellement, l’expression du gène chimérique généré implique que la translocation ne décale pas le cadre de lecture lors de la transcription (Mitelman, 2007). Les translocations surviennent généralement dans une région restreinte caractéristique de chaque gène impliqué. Cette région est dénommée BCR (breakpoint cluster region) (Greaves, 2003). II.3.1. MECANISMES IMPLIQUES DANS LA REPARATION DES CASSURES DOUBLE BRIN: Une cassure double brin (DSB, double strand break) peut survenir tout au long du cycle cellulaire par lésion directe de l'ADN, mais aussi, lors de la réplication, par destabilisation de la fourche de réplication (Mani, 2010). Il existe deux voies principales de réparation d'une cassure double brin: la jonction non homologue d'extremités (NHEJ, non homologous end joining), et la recombinaison homologue (Greaves, 2003; Mani, 2010). Tandis que la NHEJ est active durant tout le cycle cellulaire, la recombinaison homologue est spécifique à la réplication (Mani, 2010). 23
  24. 24. Les diverses protéines impliquées dans la détection des DSB et dans leur réparation sont en partie caractérisées (Aguilera, 2008). Les anomalies génétiques de certaines de ces protéines conduisent à des syndromes comportant fréquemment une prédisposition accrue à divers cancers (Nickoloff, 2008). NHEJ: Deux types de NHEJ sont décrits: une voie classique qui aboutit à la jonction correcte des deux extrémités d'une DSB et une voie alternative qui aboutit à des translocations (Nickoloff, 2008, Mani, 2010). Une DSB peut survenir à une localisation similaire sur les deux brins complémentaires, aboutissant à une cassure nette, mais aussi avec un certain décalage, conduisant à des extrémités comportant de l'ADN simple brin flanquant non apparié. La voie classique est impliquée dans la réparation des cassures fortuites, mais aussi dans la recombinaison des gènes des immunoglobulines lors de la maturation lymphocytaire (Nickoloff, 2008). En présence d'une DSB, le complexe Ku70/Ku80 se fixe sur chacune des extrémités, aboutissant à la constitution d'un complexe de ligation contenant des DNA protéines kinases, ainsi que XLF, XRCC4 et la DNA ligase IV (Nickoloff, 2008, Mani, 2010). Il est fréquent de constater la délétion ou l'ajout de quelques paires de bases au niveau du site de jonction, ce qui résulte d'une cassure d'ADN avec décalage (Nickoloff, 2008, Mani, 2010). Certaines de ces protéines, notamment Ku70, auraient pour fonction de maintenir les deux extrémités à proximité afin d'éviter les translocations (Nickoloff, 2008). La voie alternative, qui aboutit à des recombinaisons illégitimes, est moins bien caractérisée. Elle est vraisemblablement médiée par d'autres protéines, car elle est observée expérimentalement après délétion spécifique de protéines impliquées dans la voie classique (Mani, 2010). Il est suggéré que la voie alternative interviendrait préférentiellement dans la réparation des DSB présentant un décalage plus important que dans le cas de la voie classique, le mécanisme de jonction de deux extrémités de cassure reposant sur l'hybridation des simples brins flanquants (Nickoloff, 2008). Recombinaison homologue: Cette voie de réparation est spécifique aux phases S et G2 du cycle cellulaire et repose sur l'emploi d'un brin d'ADN non endommagé qui sert de modèle de réparation (Mani, 2010). On décrit une voie allélique et une voie non allélique (Mani, 2010). Dans la voie allélique, le brin d'ADN servant de modèle correspond exactement au locus lésé, tandis que dans la voie non allélique il s'agit d'un locus différent possédant une homologie avec le locus lésé. La recombinaison homologue allélique débute par la génération d'extrémités simple brin au niveau du site de cassure, le brin complémentaire étant ôté par le complexe MRN. Ensuite, un autre complexe contenant RAD51, RAD52, BRCA1 et BRCA2 catalyse l'appariement de chacune de ces séquences simple brin avec la séquence complémentaire de la chromatide homologue non lésée dont les brins sont simultanément déshybridés (Mani, 2010, Nickoloff, 2008). Ceci aboutit à la création d'une structure intermédiaire, l'hélice-D. Enfin, une DNA polymérase comble les lacunes et les deux chromatides de l'hélice-D se dissocient selon deux voies distinctes (Mani, 2010). La voie SDSA (synthesis-dependant strand annealing) aboutit à la restitution de la chromatide- modèle sous forme originale et à l'introduction d'une séquence dérivée de la chromatide modèle dans la chromatide réparée au niveau du site de la cassure, ce qui est dénommé conversion génique (Weinstock, 2006). La voie DSBR (bouble-strand break repair) aboutit à une conversion génique des deux chromatides et éventuellement à un crossover (échange réciproque complet entre les deux 24
  25. 25. chromatides). Dans tous les cas, la recombinaison homologue allélique n'engendre pas de translocation (Mani, 2010). La recombinaison homologue non allélique repose sur certaines séquences répétées situées à des loci différents. Il s'agit par exemple de rétrotransposons, d'élements Alu (séquences répétées de 300 pb), d'élements L1, de pseudogènes (Mani, 2010). Un éventuel crossover aboutirait alors à une translocation réciproque (Weinstock, 2006). Les mécanismes moléculaires ne sont pas précisément connus (Mani, 2010), mais RAD51 semble également impliquée (Francis, 2007). Une modalité particulière de recombinaison homologue non allélique est le SSA (single strand annealing), qui conduit à une délétion de toute la séquence comprise entre deux éléments répétés ainsi que d'une des deux séquences répétées (Aguilera, 2008; Nickoloff, 2010). Lors d'une réparation par SSA, la cassure survenant entre deux séquences répétées aboutit à une résection du brin complémentaire jusqu'à la séquence répétée. Cette résection se fait en sens inverse sur chaque brin. Les deux séquences répétées adjacentes se retrouvent donc en configuration simple brin et s'hybrident. Tout l'ADN intermédiaire est délété (Nickoloff, 2010). Ce mécanisme peut également impliquer deux chromosomes différents, si les cassures sont localisées à proximité de séquences répétées identiques, ce qui génère des translocations (Nickoloff, 2010). La voie non allélique semble être mise en jeu en cas de déficience de la voie allélique (Mani, 2010). L'absence de BRCA2 conduit ainsi à une réparation prédominante par SSA (Nickoloff, 2010). Place respective des différents mécanismes de réparation et implication dans les translocations: Il semble exister une hiérarchie entre les différentes voies de réparation. Bien qu'étant spécifique des phases S et G2, la recombinaison homologue interviendrait de façon secondaire, en cas de déficience de la NHEJ (Mani, 2010) (Figure 4, page suivante). Dans le cas de la recombinaison homologue, le crossover est généralement inhibé chez les mammifères, en dehors de la méïose. Il est donc peu probable qu'une translocation résulte d'une recombinaison homologue non allélique suivie d'un crossover (Weinstock, 2006).Les mécanismes de translocation ont été étudiés in vitro dans les cellules souches embryonnaires murines. Deux chromosomes différents sont modifiés afin d'introduire une séquence contenant un site de restriction sensible à IsceI générant une cassure double brin, des gènes reporters, et des séquences répétées. Il existe différentes variantes selon le mécanisme que l'on souhaite étudier, mais une stratégie commune consiste à introduire, dans chaque chromosome, une version tronquée ou défective d'un gène reporter, la version fonctionnelle étant reconstituée après réparation (Weinstock, 2006; Francis, 2007). L'analyse de la taille des fragments de PCR et de l'expression des différents gènes reporters permet de déterminer le mécanisme prépondérant de translocation. Deux études différentes montrent ainsi que les translocations générées résultent de la réparation par NHEJ et SSA, dans des proportions relatives variables selon les séquences répétées introduites à proximité du site de restriction (Weinstock, 2006). En revanche, aucune translocation résultant d'un crossover n'est retrouvée, bien qu'une recombinaison homologue non allélique soit identifiée (Weinstock, 2006; Francis, 2007), mais elle n'aboutit qu'à une conversion génique. La surexpression de RAD51 aboutit à une conversion génique plus étendue mais n'augmente pas la fréquence du crossover (Francis, 2007). 25
  26. 26. Influence de la proximité spatiale des partenaires de translocation: La fréquence de la survenue de translocations entre deux chromosomes semble dépendre de leur proximité spatiale (Mani, 2010). Ceci a été montré dans le cas des lymphomes non hodgkiniens présentant une translocation plaçant l'oncogène MYC sous le contrôle du promoteur des immunoglobulines: les translocations impliquant la chaîne lourde des immunoglobulines sont plus fréquentes que celles impliquant la chaîne légère. Or, dans des lymphoblastes normaux, le gène de MYC est physiquement plus proche du gène de la chaîne lourde (Mani, 2010). La proximité spatiale semble influencée par le type cellulaire. La microscopie confocale par fluorescence retrouve une proximité spatiale entre l'oncogène RET, responsable de cancers de la thyroïde, et certains de ses partenaires de fusion dans les cellules thyroïdiennes normales, mais pas dans les lymphocytes circulants ni les cellules mammaires (Mani, 2010). La proximité spatiale est également influencée par le degré de différenciation. Ainsi, dans les cellules souches hématopoïétiques CD34+, les oncogènes BCR et ABL sont plus proches l'un de l'autre que PML et RARα. Le traitement des cellules par IL-3, qui déclenche la diférenciation myéloïde, aboutit à l'observation inverse. Ces données concordent avec le type de cellule impliqué dans les pathologies résultant des translocations, sachant que BCR-ABL est observé dans la leucémie myéloïde chronique tandis que PML-RARα est observé dans la leucémie aiguë promyélocytaire (Mani, 2010). Dans les deux casn la proximité maximale est observée durant les phases S et G2 du cycle cellulaire (Mani, 2010). 26
  27. 27. Lors de la survenue d'une cassure double brin, une sous-unité d'histone est phosphorylée (γH2AX). L'immunomarquage de γH2AX permet de détecter les sites de cassures double brin par microscopie confocale (Falk, 2010) (Figure 5). Des techniques de biologie moléculaire sont également développées. La capture de conformation chromosomique permet de déterminer la fréquence d'interaction entre deux loci déterminés, par fixation au formaldéhyde suivie d'une digestion enzymatique. La fréquence d'interaction est quantifiée par PCR quantitative en temps réel (Mani, 2010). Une autre technique dérivée de la précédente, la Hi-C, permet une étude des interactions au niveau du génome entier (Mani, 2010). Plusieurs hypothèses sont avancées afin d'expliquer le rapprochement physique de séquences différentes aboutissant à une translocation après cassure double brin. Les modalités d'organisation spatiale de la chromatine interphasique sont imparfaitement connues, mais il existe des compartiments dits «transcription factories» où les gènes activement transcrits ont tendance à se colocaliser, ce qui favoriserait les translocations en cas de lésion de l'ADN (Mani, 2010). Selon une autre hypothèse, la proximité spatiale préalable ne serait pas un pré-requis obligatoire, la probabilité de rencontre dépendant de la densité en chromatine autour du site de cassure (Falk, 2010). Les brins de chromatine rompus à proximité d'une région peu dense (« trous chromatiniens ») auraient tendance à migrer dans cette région, sous l'effet du mouvement brownien et de la décompaction chromatinienne induite par le processus de réparation, augmentant ainsi la probabilité d'entrer en contact et de générer une recombinaison illégitime (Falk, 2010). Tous ces mécanismes restent à préciser. 27
  28. 28. II.3.2. MECANISMES ENDOGENES GENERANT DES CASSURES DOUBLE BRIN: Outre l'action de facteurs physiques et chimiques produisant directement des cassures double brin, celles-ci sont produites de façon physiologique dans certaines circonstances. La perturbation de ces mécanismes peut conduire à des translocations. Il s'agit notamment de la recombinaison des gènes des immunoglobulines (ou du TCR dans les lymphocytes T), des endonucléases apoptotiques et de la topoisomérase II (Greaves, 2003). Recombinaison des gènes d'immunoglobulines: La recombinaison survient à deux reprises dans les étapes de différenciation du lymphocyte B. Lors des étapes précoces, la recombinaison V(D)J aboutit à la création du répertoire antigénique. Ensuite, lors de l'activation du lymphocyte B, une nouvelle recombinaison se produit au niveau de la partie constante du gène, aboutissant à la production d'immunoglobulines G, A ou E à la place des immunoglobulines M (Mani, 2010). La recombinaison V(D)J est catalysée par le complexe à activité endonucléase RAG, qui reconnaît des séquences spécifiques de 16 pb au niveau des exons subissant la recombinaison: les séquences RSS (Greaves, 2003). Quelques nucléotides sont ensuite ajoutés de façon aléatoire au niveau des points de cassure, aboutissant à accroître la diversité du répertoire d'anticorps de façon aléatoire (Greaves, 2003). Enfin, la ligation est effectuée par NHEJ classique (Mani, 2010). Le changement de classe d'immunoglobulines qui intervient plus tard est catalysée par l'enzyme AID (activation-induced cytidine deaminase), qui désamine les cytosines de régions non codantes au niveau des gènes de la partie constante des immunoglobulines. Les cytosines ainsi modifiées sont excisées par la voie habituelle (base excision repair), ce qui conduit à une cassure double brin. La ligation est ici aussi effectuée par NHEJ classique (Mani, 2010). Contrairement au cas des lymphomes B, ces mécanismes ne semblent pas impliqués dans la grande majorité des LLA de type B de l'enfant, car on ne retrouve pas de RSS cryptiques ni d'adjonction aléatoire de nucléotides au niveau du point de jonction de la translocation, à l'exception de la translocation t(1 ; 19) qui est retrouvée dans moins de 5% des cas de LLA de type B (Greaves, 2003; Aplan, 2006). Endonucléases apoptotiques: L'apoptose aboutit entre autres à une fragmentation du génome par expression d'endonucléases. Des études réalisées in vitro tendent à montrer que le processus apoptotique n'est pas irréversible et peut être interrompu malgré l'expression des endonucléases (Greaves, 2003). L'application de divers traitements pro-apoptotiques à des cellules en culture (anticorps anti-CD95, céramide, déplétion du milieu de culture) permet de retrouver des translocations impliquant MLL ou TEL-AML1 au niveau des cellules ayant échappé à la mort par apoptose (Greaves, 2003). Cette voie ne semble en l'état actuel pas avoir été explorée de manière plus approfondie. Topoisomérase II : La littérature est relativement abondante sur l'implication de l'inhibition de la topoisomérase II dans les anomalies touchant le gène MLL. Cet intérêt particulier provient de la fréquence des leucémies secondaires impliquant MLL chez les patients préalablement traités par inhibiteurs de la topoisomérase pour une autre néoplasie (Alexander, 2001 ; Bueno, 2009). La topoisomérase II est un homodimère régularisant le degré de torsion de la double hélice d'ADN, par clivage double brin suivi de religation. Une liaison covalente se forme entre un résidu tyrosine 28
  29. 29. du site catalytique et le brin d'ADN (Figure 6) durant la phase de détorsion de l'ADN (Deweese, 2009). Cette réaction ATP-dépendante nécessite la présence d'un coenzyme métallique, généralement l'ion magnésium (Deweese, 2009). La topoisomérase II est notamment active durant la réplication de l'ADN (Greaves, 2003 ; Deweese, 2009). L'homodimère peut être inhibé dans certaines circonstances avant la phase de ligation, aboutissant à une cassure double brin. Les inhibiteurs classiques sont des agents anticancéreux (épipodophyllotoxines et anthracyclines), mais aussi certains phytoestrogènes (Deweese, 2009).Il n'existe pas véritablement de séquences spécifiques de fixation de l'enzyme : la fixation dépend avant tout de la structure secondaire de l'ADN (Deweese, 2009 ; Le, 2009). 29
  30. 30. III. EPIDEMIOLOGIE: III.1. DONNEES GENERALES: Le taux d’incidence annuel de la leucémie aiguë est de 30 à 45 par million chez l’enfant dans les pays occidentaux (Greaves, 2006), ce qui représente la première cause de cancer pédiatrique (Kim, 2006). L’incidence semble inférieure dans les autres pays (Greaves, 2006), mais l’influence éventuelle de facteurs ethniques prête à débat dans la mesure où il existe certainement un sous- diagnostic lié à une différence d’accès aux soins (Eden, 2010). Une augmentation annuelle significative de l’incidence de l’ordre de 1% est observée dans les pays occidentaux (Eden, 2010) depuis quarante ans (Ward, 2009), ce qui laisse supposer l’implication de facteurs environnementaux liés à l’industrialisation et au mode de vie (Kim, 2006 ; Ward, 2009 ). Une tendance similaire apparaît au Japon (Ward, 2009). Les formes lymphoblastiques sont de loin les plus fréquentes en occident, devant les formes myéloblastiques: elles représentent environ 80% des leucémies pédiatriques (Kim, 2006 ; Wigle, 2009). Près de 90% des LLA pédiatriques ont un phénotype de lignée B (Pui, 2004). On distingue des facteurs génétiques et des facteurs exogènes, agissant vraisemblablement en synergie (Kim, 2006). Ceci justifie l’étude des interactions gène-environnement (Infante-Rivard, 2008 ; Sherborne, 2011) et gène-gène (Sherborne, 2011). Il est actuellement admis que les anomalies cytogénétiques les plus fréquentes sont acquises durant la période prénatale, tandis que les mutations additionnelles seraient d’origine postnatales (Chapitre III). Cette notion est importante en termes de fenêtre d’exposition à un facteur de risque exogène (Kim, 2006). Le modèle actuellement admis, récapitulé dans la figure 7 (page suivante), est le suivant (Greaves, 2003 ; Kim, 2006):  Initiation en deux étapes : 1/ acquisition de la translocation chromosomique ou de l’aneuploïdie en phase prénatale, voire pré- conceptionelle 2/ acquisition de mutations secondaires plutôt en phase postnatale (Chapitre III).  Promotion en phase postnatale. Les trois fenêtres d’exposition à considérer sont les suivantes (Kim, 2006): -Période préconceptionnelle -Période prénatale -Période postnatale . La notion de fenêtre d’exposition mérite également d’être prise en compte dans les études portant sur les prédispositions génétiques, en raison de la variabilité possible de l’expression génique des enzymes de détoxification au cours du développement intra-utérin et de l’enfance. La répartition selon l’âge (Figure 8, page suivante) montre un pic d’incidence entre 2 et 5 ans (Kim, 2006 ; Ward, 2009), le nombre de cas observés avant l’âge de un an étant d’environ 5% (Kim, 2006). 30
  31. 31. 31
  32. 32. Les généralités concernant la réalisation et l'interprétation d'études observationnelles et de méta- analyses figurent en annexe 1. Une légère prédominance masculine est notée, avec un sex ratio de 1,2 :1 (Eden, 2010). Les anomalies cytogénétiques, observables dans environ 80% des cas avec les techniques de routine (Pui, 2004), se répartissent différemment selon l’âge de diagnostic (Figure 9). La tranche d’âge de moins de un an (« infant leukemia ») présente un intérêt physiopathologique particulier (Chapitre III): d’une part, la translocation MLL-AF4 est retrouvée dans 90% des cas (Bueno, 2011), et d’autre part, un taux de concordance de 100% est retrouvé chez les vrais jumeaux en cas de présence de MLL-AF4 (Pui, 2004). Par la suite, ce sont la forme hyperdiploïde et la translocation t(12 ;21) qui prédominent (Pui, 2004 ; Szczepanski, 2010). La classification cytogénétique permet de déterminer le pronostic de la LLA (Figure 10, page suivante). La translocation t(12 ;21) et la forme hyerdiploïde sont de pronostic plutôt favorable, tandis que les formes impliquant le gène MLL ont un pronostic défavorable (Pui, 2004 ; Szczepanski, 2010). La lourdeur des traitements nécessaires et le pronostic plus ou moins péjoratif selon la forme cytogénétique justifient une identification et une maîtrise des facteurs de risques. 32
  33. 33. III.2. DONNEES ENVIRONNEMENTALES DISPONIBLES SUR LE LIEN ENTRE EXPOSITION AUX PESTICIDES ET LLA: Bien que l'objectif soit ici d'examiner le lien entre exposition maternelle prénatale et LLA chez l'enfant, il convient de noter que l'exposition aux pesticides semble également liée à une augmentation du risque de LMA chez l'enfant. Par ailleurs, les études concernant l'exposition paternelle sont contradictoires mais n'éliminent pas la possibilité d'une association avec la LMA. III.2.1. FACTEURS DE RISQUE ENVIRONNEMENTAUX AUTRES QUE LES PESTICIDES: Le facteur de risque environnemental le mieux caractérisé est l'exposition prénatale aux radiations ionisantes (Greaves, 1997). Ces données proviennent de l'observation des cohortes de survivants d'Hiroshima et Nagasaki ainsi que d'études portant sur le suivi d'enfants dont la mère avait subi des radiographies lors de la grossesse (Greaves, 2006). D'autres facteurs environnementaux physiques et chimiques ont été étudiés avec des niveaux de preuve variables. Parmi les facteurs physiques, le rayonnement électromagnétique prête à débat (lignes à haute tension, antennes-relais de téléphonie sans fil), avec des résultats contradictoires et des risques de biais majeurs (Greaves, 2006). Parmi les facteurs chimiques autres que les pesticides, plusieurs catégories de substances sont suspectées, mais les études directes sont contradictoires ou présentent un faible niveau de preuve 33
  34. 34. (Infante-Rivard, 2008). On peut citer la fumée de tabac, les solvants, la pollution produite par la circulation automobile et les trihalométanes présents dans l'eau de boisson (Infante-Rivard, 2008; Eden, 2010). Le benzène est cité mais semble plus impliqué dans la forme myéloblastique (Eden, 2010). La question des interactions et confusions se pose lors de l'interprétation de ces études (Infante-Rivard, 2008). Des facteurs nutritionnels sont également incriminés, avec une hypothèse mécanistique portant sur l'inhibition de la topoisomérase II (Paragraphe II.3.2). Une étude cas-témoins (Alexander, 2001) portant sur 136 enfants de moins de 18 mois et 266 témoins issus d'une population hospitalière examine l'exposition prénatale de la mère à sept différentes catégories de substances (alcool, tabac, médicaments endommageant l'ADN, automédication par phytothérapie, pesticides, dipyrone et Baygon). L'exposition est estimée par un questionnaire, ce qui rend son estimation qualitative et quantitative relativement imprécise, d'autant plus que les effectifs sont faibles. Une association significative est retrouvée pour les pesticides, mais aussi pour l'automédication par phytothérapie, cette dernière strate ne contenant toutefois que 27 cas et 22 témoins. Les auteurs émettent l'hypothèse d'une inhibition de la topoisomérase II par les bioflavonoïdes, bien que l'association soit similaire dans le groupe présentant une translocation impliquant MLL comme dans celui n'en présentant pas. Ces éléments sont toutefois repris par plusieurs études et revues ultérieures (Greaves, 2006; Le, 2010; Vanhees, 2010). L'intérêt pour la translocation MLL provient du fait que les leucémies secondaires aux traitements par inhibiteurs de la topoisomérase II présentent fréquemment cette translocation (Vanhees, 2010), bien qu'elles soient plus souvent de type myéloblastique (Eden, 2010). Des études in vitro montrent la capacité des flavonoïdes à induire des translocations impliquant MLL sur des cellules souches CD34+ humaines. Toutefois, la méthodologie est partiellement remise en cause par une étude montrant que l'action clastogénique de l'épigallocatéchine sur les ovocytes de Hamster Chinois (CHO) dépend en fait de son niveau d'oxydation par le milieu de culture (Long, 2007). Certains milieux de culture tel que le DMEM (Dulbecco‘s modified Eagle’s medium) provoquent une oxydation des flavonoïdes, ainsi que de l’acide ascorbique, ce qui produit du peroxyde d’hydrogène responsable des effets cytotoxiques et clastogéniques observés in vitro (Long, 2007), en contradiction avec l’effet plutôt protecteur qui est classiquement attribué aux flavonoïdes (Vanhees, 2010). L’adjonction de catalase dans le milieu de culture permet de supprimer ces effets (Long, 2007). Ces éléments méritent d’être pris en considération non seulement dans le débat sur la clastogénicité potentielle des flavonoïdes, mais aussi lors de l’étude in vitro des pesticides. Les données obtenues in vivo, notamment dans un modèle murin présentant un déficit de réparation des cassures double brin (mutation du gène ATM, impliqué dans l‘ataxie télangiectasie), tendent à montrer une augmentation du nombre de translocations impliquant MLL lors de l’exposition in utero à la génistéine et à la quercétine (Vanhees, 2011). Bien que chaque groupe d’exposition comporte une quarantaine d’individus, il n’y a toutefois pas de précision statistique claire sur la différence obtenue, et un éventuel effet dose-dépendant n’est pas recherché (Vanhees, 2011). Bien qu’il soit prudent de prendre en compte la toxicité éventuelle des flavonoïdes pendant la grossesse, le niveau de preuve expérimental reste toutefois limité et les conditions expérimentales doivent être améliorées. Il en va de même des données épidémiologiques. III.2.2. DONNEES CONVENTIONNELLES RELATIVES AUX PESTICIDES: Les pesticides représentent le facteur de risque chimique le mieux étudié à l’heure actuelle. Ceci résulte d’un intérêt particulier des agences gouvernementales et des associations de protection de l‘environnement, en raison, d’une part, du caractère mutagène et/ou cancérigène établi de certaines molécules et, d’autre part, de l’exposition environnementale relativement large du fait de l’usage 34
  35. 35. généralisé en agriculture ainsi que de l’usage domestique fréquent (Zahm, 1998). Les autres facteurs de risque chimiques sont moins étudiés, ce qui permet difficilement de déterminer la contribution respective des pesticides et des autres agents chimiques dans l'augmentation du risque de LLA. La mise au point de modèles expérimentaux fiables permettrait, d’une part, d’orienter davantage les études épidémiologiques vers d’autres facteurs de risque éventuellement sous-estimés, et d’autre part, de réduire le risque de biais de confusion lié à ces autres facteurs lors de l’étude spécifique des pesticides. Les données spécifiques aux pesticides peuvent être regroupées en deux catégories. Il existe, d'une part, des études mettant en évidence un risque augmenté de leucémie infantile en cas d'exposition aux pesticides, et, d'autre part, des études mettant en évidence une action mutagène chez l'adulte. Néanmoins, le lien direct entre les trois paramètres que sont l'exposition aux pesticides, l'action mutagène et la maladie manque pour le moment dans le cadre de la LLA. Lien entre LLA infantile et exposition aux pesticides: Les données disponibles sont peu précises quant aux familles de pesticides ou aux molécules suspectées. Les éléments suivants sont à prendre en compte:  usage de molécules multiples  difficultés d'identification rétrospective de l'exposition (Metayer, 2008)  évolution dans le temps des molécules employées, certaines étant retirées du marché (problème de la persistance environnementale et biologique à long terme). Par ailleurs, la mise en évidence d'une association nécessite la prise en compte de facteurs confondants ou modifiants, parmi lesquels on peut compter au minimum:  les effets additifs ou synergiques entre molécules  les prédispositions génétiques (Infante-Rivard, 2008; Metayer, 2008)  d'autres facteurs environnementaux physiques ou chimiques (Infante-Rivard, 2008) Les données actuellement disponibles regroupent généralement les expositions étudées sous les trois catégories suivantes:  exposition professionnelle  exposition domestique  exposition environnementale (pesticides employés dans les espaces verts ou exploitations agricoles voisines du domicile, eau potable). Cette distinction permet une première orientation vers les classes de pesticides suspectées, dans la mesure où les molécules à usage agricole ou domestique sont susceptibles de différer. Les méthodologies employées pour les expositions domestique et environnementale méritent d'être détaillées car, d'une part, elles pourraient dans une certaine mesure être employées pour l'estimation de l'exposition professionnelle, et d'autre part, leurs résultats pourraient être pris en compte afin d'estimer la contribution relative de l'exposition professionnelle dans l'exposition totale aux pesticides. Exposition professionnelle des parents: Il existe deux méta-analyses récentes examinant le lien entre leucémies aiguës de l'enfant (tous types confondus) et exposition professionnelle des parents (Wigle, 2009; Van Maele-Fabry, 2010). 35
  36. 36. Ces deux études présentent une bonne conformité avec les critères PRISMA qu'elles ne mentionnent toutefois pas. Les études incluses sont en grande partie identiques et partiellement redondantes dans la mesure où elles portent en partie sur des individus identiques. Tandis que la revue bibliographique de Wigle s'étend de 1950 à 2009 et inclut tous types de travaux référencés dans diverses bases de données, dont des thèses non publiées et des études publiées dans d'autres langues que l'Anglais, Van-Maele Fabry restreint sa recherche aux années 1966-2009, à la base MEDLINE et aux études publiées en Anglais. Toutefois, Wigle classe les études identifiées à l'aide d'un score de qualité développé à cette fin en adaptant les critères de Downs et Black, indépendants des critères STROBE. Les deux méta-analyses incluent à la fois des études prospectives et des études cas-témoins. L'hétérogénéïté est estimée par le test de Cochrane dans l'étude de Wigle, tandis que Van Maele- Fabry recourt à I², qui a l'avantage de permettre des comparaisons ultérieures avec d'autres méta- analyses de façon indépendante de l'effectif inclus (Higgins, 2003). Les méta-risques sont d'emblée calculés à partir du modèle des effets aléatoires par Wigle, tandis que Van Maele-Fabry emploie les deux modèles et retient le modèle fixe si I² est inférieur à 25%. L'exposition paternelle toutes fênetres confondues n'apparaît pas comme un facteur de risque: le méta-risque est de 1,09 (IC: 0,88-1,34) dans l'étude de Wigle et de 1,14 (IC: 0,76-1,69) dans celle de Van Maele-Fabry. L'hérétogénéïté est cependant importante. Van Maele-Fabry retrouve toutefois des méta-risques significatifs, sauf pour l'exposition postnatale, après stratification sur la fenêtre d'exposition: Période préconceptionnelle 1,41 (1,15-1,74) Phase prénatale 1,36 (1,08-1,72) Phase postnatale 1,25 (0,95-1,65) Une action sur les cellules germinales paternelles, ainsi qu'une contamination de la mère pendant la grossesse par l'intermédiaire du père ne sont donc pas exclues. Les résultats concernant l'exposition maternelle sont présentés différemment. L'hétérogénéïté apparaît faible dans les deux études. Wigle ne retient que la notion d'exposition prénatale, sans distinguer les phases pré- et post- conceptionnelles, et trouve un méta-risque de 2,09 (IC: 1,51-2,88). Van Maele-Fabry trouve un méta-risque de 1,62 (IC: 1,22-2,16) pour l'ensemble des fenêtres et retrouve des résultats significatifs après stratification: Phase préconceptionnelle 2,24 (1,34-3,72) Phase prénatale 2 (1,11-3,62) Phase postnatale 2,25 (1,21-4,20) 36

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