Utilisation du modèle de coculture cellules endothéliales humaines/P. falciparum pour l'analyse de la pathogénicité des isolats plasmodiaux - Conférence de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Fousseyni TOURE - CIRMF, Franceville, Gabon - fousseyni@yahoo.fr

1. Utilisation du modèle de co-culture
cellules endothéliales/Plasmodium
falciparum pour l’étude de la
pathogénicité des isolats plasmodiaux
CIRMF & INSERM 511
Fousseyni Touré-Ndouo, A Siau, O Oukem, U Bisvigou, O Moussa, S Bisser, D Mazier

2. Interactions hôte-Plasmodium falciparum
Pf
Foie
Hématie
Cytoadhérence, Séquestration
Cellules endothéliales vasculaires
Lars Hvid et al. 2005 (modifié)

3. Séquestration au cours du neuropaludisme
Flux sanguin
Autoagglutination
des HP
1 2
1
Blocage mécanique
des capillaires
Cytoadhérence des HP Rosette
cytokines proinflammatoires (1),
toxines (2).
Modèle Lékana-Douki et al. 2003

4. Apoptose
P. falciparum 3D7 (souche de laboratoire)
induit l’apoptose de la cellule endothéliale
pulmonaire humaine par contact physique
(cytoadhérence)
Pino et al. 2003

5. Objectif général
Analyser le rôle des molécules de
transduction du signal dans la
pathogenèse du paludisme

6. Objectifs spécifiques
• Analyser la capacité des isolats plasmodiaux à
cytoadhérer et à induire des modifications (apoptose
etc.) de la cellule endothéliale
• Etablir une corrélation entre ces modifications et
l’état clinique des patients
• Identifier les ligands et récepteurs impliqués dans la
pathogénicité pour la perspective vaccinale et/ou
thérapeutique

7. Matériels et méthodes
Recrutement de patients, collecte de
données cliniques et d’ isolats plasmodiaux
Culture de cellules endothéliales
pulmonaires humaines (HLEC)
Maturation des isolats P.f
Co-cultures HLEC-Isolats P.f
Réalisation des tests (cytoadhérence,
ELISA apoptose, préparation des ARNm,
DNA microarray ou Biopuce)

8. Collection des isolats plasmodiaux et formes sanguines
Goutte épaisse A Goutte épaisse B
680.000 anneaux / l de sang 250.000 trophozoïtes / l de sang

9. Maturation ex vivo (24 – 48 h)
12% Schizontes

10. Enrichissement en schizontes
80%

11. Co-culture: HLEC/ isolats Pf
Suspension de schizontes
1 2 3
HLEC HLEC HLEC
Cytoadhérence (1h) Apoptose (4 h) Contact (4h) collection ARNm

12. Cytoadhérence
5.619 PRBC/mm2 HLEC

13. Cytoadhérence
6000
5000
4000
PRBC/mm2 HLEC
3000
2000
1000
0
D1 F17 F28 F3 F31 F33 F36 F39 F43 F45 F48 F50 F54 F59 F62 F64 F69 F37 F5 F52 F61
Isolats Pf

14. La cytoadhérence n’est pas associée à la charge
parasitaire
Isolats Pf Nombre de Cytoadhérence
schizontes PRBC/mm2HLEC
x 103
F3 4881 216
F31 23760 937
F69 27324 1686
F32 26080 5619
F37 26730 197
F42 13365 1561
F53 26730 592
F62 3960 437
F60 18810 5
F26 4703 230

15. ELISA apoptose (1)
2,400
2,200
*
2,000 *
1,800
1,600
1,400
DO échantillons
1,200
DO GRS
1,000
0,800
*
*
0,600 * *
* * *
0,400
* *
* *
0,200
0,000
D1 F1 F4 F7 F9 F16 F18 F21 F26 F30 F31 F33 F36 F38 F49 F51 F54 F55 F56 F59 F61 F63 F67 F69

16. ELISA apoptose (2)
N = 45 P.f
Paludisme malaria 35
Uncomplicatedsimple 35 Paludisme10
sévère 10
5
5 apoptotiques 4 apoptotiques
20% d’isolats apoptotiques

17. L’apoptose n’est pas associée à la
gravité du paludisme (p=0,11)
Les isolats apoptotiques se rencontrent
aussi bien dans les cas simples que
dans les cas sévères

18. L’apoptose est associée aux signes neurologiques
Fisher exact test p= 0,02
Isolats Pf Apoptose Critères de sévérité
(OMS 2000)
F3 + Prostration
F31 + Prostration
F69 + Coma
F32 + Hyperparasitémie
F37 - Hyperparasitémie
F42 - Hyperparasitémie
F53 - Hyperparasitémie
F62 - Prostration
F63 - Hyperparasitémie
F26 - Anémie

19. Hypothèse
L’apoptose pourrait être impliquée dans les
dommages causés à la barrière
hématoméningée au cours du
neuropaludisme

20. Apoptose CE et barrière hématoméningée
Modèle Bisser et al. 2006

21. Relation entre cytoadhérence et apoptose
25
20
HLEC apoptose
15
10
5
0
1 10 100 1000 10000
Cytoadhérence PRBC
▲ Paludisme sévère avec signes neurologiques (prostration ou coma);
Paludisme sévère sans signes neurologiques (anémie et hyperparasitémie)
Paludisme simple

22. Transcriptome associé à l’induction de l’apoptose
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

23. Recherche PlasmoDB
Ces gènes codent en grande majorité
pour des antigènes de surface dont
certains sont impliqués dans la
cytoadhérence

24. Résumé
• Environ 20% des isolats plasmodiaux de
Franceville (Gabon) induisent l’apoptose de
la cellule endothéliale
• L’apoptose est associée aux signes
neurologiques
• 23 gènes associés à la pathogénicité des
isolats plasmodiaux ont été identifiés

25. Perspectives
• Expression d’antigènes recombinants
correspondant à certains de ces gènes
• Analyses immunologiques (recherche de
candidats vaccins potentiels)
• Co-culture cellules endothéliales
cérébrales/P. falciparum

26. Remerciements (1)
• Patients et leurs parents
• Hôpital AMISSA BONGO
• CIRMF
• INSERM 511

27. Remerciements (2)
• Directeur de l’Institut Pasteur de
Madagascar
• Initiateurs et organisateurs de l’Atelier
Paludisme
• Peuple Malgache

28. Merci