Le diagnostic biologique du paludisme par microscopie

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Le diagnostic biologique du paludisme par microscopie - Conférence du 6e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - MENARD Didier - Madagascar - dmenard@pasteur.mg

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Le diagnostic biologique du paludisme par microscopie

  1. 1. atelier.paludisme@pasteur.mg http://www.pasteur.mg/Atelier-Palu/ LE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME PAR MICROSCOPIE 6ème édition de l’Atelier Paludisme Session 2008 17 Mars au 18 Avril 2008 Dr Marie Ange Rason - Dr Didier Ménard Unité de Recherche sur le Paludisme Institut Pasteur de Madagascar
  2. 2. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME Il comprend plusieurs étapes - ETAPE 1- Prélèvement du malade - ETAPE 2- Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince - ETAPE 3- Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du paludisme Si la recherche est négative : Conclure par « Examen négatif, Absence de Plasmodium » Si la recherche est positive, passer à l’étape 4 - ETAPE 4- Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse et le frottis mince - ETAPE 5-Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse (si il y a peude parasites) ou sur le frottis mince (si il y a beaucoup de parasites) 2
  3. 3. ETAPE 1 Prélèvement du malade Matériel nécessaire  Lames de verre propres  Lancette stérile  Méthanol ou Ethanol  Coton hydrophile  Crayon gras ou stylo graveur Méthode Chez les enfants et adultes, la piqûre se fait au niveau du 3ème ou 4ème doigt de la main gauche, sur le côté qui est moins sensible que le bout du doigt Chez les nourrissons de moins de 6 mois, la piqûre se fait au niveau du talon ou du gros orteil. Nettoyer lendroit choisi dabord avec un tampon de coton imbibé dalcool, puis avec un tampon sec pour enlever toute trace dalcool. 3
  4. 4.  Piquer dun coup sec et rapide. Essuyer la première goutte de sang avec un tampon de coton sec De la main droite : prendre une lame en la tenant par les bords. De la main gauche : presser le doigt piqué pour faire sortir une goutte de sang. Prendre une 2ème lame et recueillir une seconde goutte de sang en la mettant délicatement en contact avec une extrémité de la lame 4
  5. 5. ETAPE 2Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince Préparation de la goutte épaisse Faire un étalement épais, au centre de la lame. Étaler le sang avec le coin dune lame propre jusquà épaississement uniforme. Les étalements trop minces ou trop épais ne se colorent pas bien. Au bout de la lame, inscrire au crayon gras le numéro du malade. Laisser sécher à lair pendant au moins 10 minutes, par exemple sur un plan de travail ensoleillé, à condition de protéger létalement contre les mouches et la poussière. 5
  6. 6. Préparation du frottis mince Tenir la lame dune main. De lautre, poser le bord de la lame rodée juste en avant de la goutte de sang. Faire glisser la lame rodée jusquà ce quelle touche la goutte de sang. Laisser le sang se répartir tout le long du bord de la lame rodée. 6
  7. 7.  Pousser la lame rodée jusquau bout de la lame détalement, dun mouvement doux et régulier (tout le sang doit être réparti avant que lon atteigne le bout de la lame. Vérifier que létalement est bien fait (voir dessin A) : - il ne doit pas présenter de lignes transversales ou horizontales - il doit être lisse aux extrémités, et non irrégulier ou strié, comme sur le dessin B - il ne doit pas être trop long ni trop épais - il doit être étalé uniformément Un séchage correct est capital pour conserver la qualité de létalement, surtout dans les pays à climat humide. Sécher en agitant rapidement à 5 cm environ dune lampe à alcool allumée ; sur le côté de la lampe, un peu au- dessus de la flamme (mais jamais directement au-dessus). 7
  8. 8.  Inscrire sur la lame le nom et le numéro du malade. Écrire au crayon gras sur la partie épaisse de létalement, qui nest pas utilisée pour lexamen. 8
  9. 9. Coloration de la goutte épaisse Matériel nécessaire  Éprouvette de 50 ml  Pipette en verre de 5 ml  Poire en caoutchouc  Bac à coloration  Agitateur  Pinces à lame  Râtelier à lames  Minuterie  Colorant de Giemsa  Eau du robinet ou de pluie Préparation du Giemsa à 10 %  Remplir le bac à coloration avec 45 ml d’eau du robinet ou de pluie  Ajouter 5 ml de colorant de Giemsa à l’aide d’une pipette plastique  Mélanger à l’aide d’un agitateurNB : La solution de Giemsa à 10 % ne se conserve que 2 jours Coloration des lames  Plonger les lames à colorer dans la cuve à coloration contenant la solution de Giemsa à 10 %  Laisser colorer pendant 10 minutes  Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet  Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale 9
  10. 10. Coloration du frottis mince Matériel nécessaire Coloration rapide Kit RAL 555 (3 x 100 ml) Recharge fixateurs RAL 555 Recharge Eosine RAL 555 Recharge Bleu RAL 555 Coloration des lames Plonger 30 secondes la lame dans le fixateur (flacon 1) Plonger 30 secondes la lame dans l’éosine (flacon 2) Rincer la lame à l’eau du robinet Plonger la lame 2 minutes dans le bleu (flacon 3) Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale 10
  11. 11. ETAPE 3 Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du paludismeLexamen dune goutte épaisse est basé sur lobservation microscopique de 100champs de bonne qualité. Cest-à-dire que lon ne peut pas déclarer leprélèvement négatif avant davoir examiné 100 champs sans parasite. Technique dexamen des gouttes épaisses1. Mettre de lhuile à immersion sur la goutte épaisse.2. Amener lobjectif à immersion 100 x au-dessus de la zone sélectionnée de la goutte épaisse.3. Abaisser lobjectif jusquà ce quil entre en contact avec lhuile.4. Sassurer que la zone choisie a bien la qualité requise et examiner la lame sur 100 champs avec lobjectif à immersion. Ne déplacer la lame que dun champ à la fois, en suivant le schéma ci-dessus. Corriger la mise au point fine avec la vis micrométrique.5. Pour vous aider, utilisez un compteur manuel pour compter le nombre de champs examinés. 11
  12. 12. A lexamen, vous devez observer : La goutte épaisse est formée dun grand nombre dhématies déshémoglobinisées rassemblées en paquets. Lors de la coloration de la goutte épaisse, leau de la solution de Giemsa agit sur les globules rouges non fixés : le contenu des cellules se dissout alors dans leau. Les leucocytes et les plaquettes présentent un aspect très semblable à ce que lon observe dans un frottis. Comme ils nont pas été étalés par le frottis, les globules blancs paraissent plus petits, avec un cytoplasme plus compact autour du noyau. Hématies N : Neutrophile E : Éosinophile L : Lymphocyte P : PlaquettesDans les gouttes épaisses, les parasites, comme les globules blancs,apparaissent plus petits que dans les frottis. Il vous faudra sans doute regarderavec beaucoup dattention avant de les apercevoir. Vous devrez refaire la mise au 12
  13. 13. point fine avec la vis micrométrique chaque fois que vous changez de champ.Vous observerez ainsi la goutte épaisse dans différents plans horizontaux.Les fins anneaux de cytoplasme apparaissent parfois interrompus ou incomplets.Cest laspect normal des trophozoïtes dans les gouttes épaisses.De même labsence dhématie peut également rendre difficile lobservation desgranulations de Schüffner ; en fait, dans les parties les plus épaisses de la goutteil est parfois impossible de les voir. On peut cependant souvent observer le«fantôme» des globules rouges entourant les parasites dans les parties les plusfines, en général au bord de la goutte épaisse, ce qui aide à poser le diagnostic.Remarque : Il est impossible dobserver les taches de Maurer avec P. falciparumdans une goutte épaisse. 13
  14. 14. Les espèces plasmodiales dans les gouttes épaisses Plasmodium falciparum Trophozoïtes jeunes, en croissance, et/ou gamétocytes matures généralement visibles Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes Plasmodium vivax Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner dans lesfantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes 14
  15. 15. Plasmodium ovale Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner nettementvisibles dans les fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes Plasmodium malariae Tous les stades sont visibles Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes 15
  16. 16. ETAPE 4Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse et le frottis mince En cas de résultat positif, il est nécessaire d’examiner le frottis mince pour déterminer le ou les espèce(s) en cause. Examen du frottis mincePour examiner un frottis, procéder de façon systématique et normalisée : Mettre la lame sur la platine. Placer lobjectif 100 x à immersion au-dessus du bord du frottis, à mi-distance de ses deux extrémités. Mettre une goutte dhuile à immersion à cet endroit. Abaisser lobjectif à immersion jusquà ce quil soit en contact avec lhuile. Examiner le frottis de la façon suivante pour déterminer le ou les espèce(s) en cause. Identification des espèces plasmodiales 16
  17. 17. Les parasites découverts dans le sang en sont à différents stades de développementLes hématies parasitées peuvent rester identiques ou changer de couleur ou deforme, ou encore contenir des granulations roses (granulations de Schüffner).Attention : on peut trouver plusieurs espèces associées chez un même malade. 17
  18. 18. Plasmodium falciparum Trophozoïte jeune Stade fréquent Cytoplasme : petit anneau fin, bleu pâle, sans granulations Chromatine : 1 ou 2 petits grains rouges Trophozoïte adulte Stade fréquent Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, ou aspect en virgule, ou en point dexclamation Schizonte Très rarePratiquement jamais trouvés dans les étalements de sang (sauf dans les cas très graves) Mérozoites : 18 à 32 Pigment: brun foncé ou noir 18
  19. 19. Gamétocyte Stade assez fréquent Forme : banane, croissant ou faux Couleur : bleu (mâle) ou bleu soutenu (femelle) Noyau : rose-rougePigment : quelques grains bleu- noir situés au centre du cytoplasme, ou dispersés Hématie De taille normale Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes. Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières. Densité parasitaire Souvent très élevée 19
  20. 20. Plasmodium malariae Trophozoïte jeune Stade fréquentCytoplasme : anneau bleu soutenu épais, avec quelques grains de pigments noirs Chromatine : 1 grosse tâche rouges Trophozoïte adulte Stade fréquentCytoplasme : soit tâche compacte, arrondie, bleu foncé, avec de nombreux grains de pigment noirs, soit disposé en bande (étalements minces seulement). Chromatine : tâche ronde ou bande rouge 20
  21. 21. Schizonte Stade assez fréquent Mérozoites : 8 à 10 Chacun est une grosse tâche rouge entourée d’un peu de cytoplasme pâle.Ils peuvent avoir une disposition irrégulière (forme jeune) ou être disposés en couronne (forme adulte Gamétocyte Stade assez fréquent Forme : grand, ovale ou arrondi Couleur : bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle) Noyau : une tâche ronde de chromatine rouge contre un bord Pigment : gros grains noirs dans le cytoplasme Hématie De taille et forme normalesPeuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes.Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières. Densité parasitaire Faible 21
  22. 22. Plasmodium vivax Trophozoïte jeune Stade fréquent Cytoplasme : anneau bleu assez gros, à contour irrégulier Chromatine : 1 grain rouge, assez gros Trophozoïte adulte Stade peu fréquentCytoplasme : large tâche bleue, irrégulière (quelque fois divisée en 2, 3 ou 4), avec de petits grains de pigment brun-orange. Chromatine : une tâche rouge 22
  23. 23. Schizonte Stade assez fréquentMérozoites : 12 à 18 gros grains rouges compacts, posés sur le cytoplasme bleu pâle Gamétocyte Stade fréquent Femelle : ovale ou arrondi, bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle) Noyau triangulaire rouge soutenu, souvent placé à une extrémité; nombreux grains de pigments orange dans le cytoplasme. Mâle : arrondi, bleu clair Noyau central rond, rouge clair; quelques grains de pigments orange dans le cytoplasme HématieGrosses granulations de Schüffner, souvent colorées en rose, surtout autour des trophozoïtes adultes. Densité parasitaire Moyenne 23
  24. 24. Plasmodium ovale Trophozoïte jeune Cytoplasme : anneau régulier, bleu soutenu Chromatine : 1 grain rouge de taille moyenne Trophozoïte adulteCytoplasme : tâche ronde compacte, très bleue avec quelques grains de pigment bruns. Chromatine : une grosse tâche rouge SchizonteMérozoites : 8 à 14 grosses tâches rouges en couronne, autour d’un amas central de grains de pigments bruns. 24
  25. 25. Gamétocyte Stade fréquent Forme : grand, ovale ou arrondi bleu soutenu Noyau : une tâche ronde Pigment : quelques grains bruns dans le cytoplasmeDifférent de P. vivax par son pigment brun et de P. malariae par la présence de grains de Schüffner Hématie Peut paraître ovale, avec des extrémités irrégulières Grosses granulations de James rouges, facilement visibles. Densité parasitaire Moyenne 25
  26. 26. ETAPE 5Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse ou sur le frottis minceEn cas de résultat positif, il est nécessaire d’estimer la densité parasitaire car lagravité de l’infection palustre est liée au nombre d’hématies parasitées.Un paludisme à P. falciparum est considéré comme sévère quand le nombred’hématies parasitées est supérieur à 100000 par µl, l’accès pernicieux estprobable au-delà de 150000 par µl. Une parasitémie supérieur à 400 000 par µlest un élément de très mauvais pronostic Sur la goutte épaisse On estime la densité parasitaire sur la goutte épaisse quand le nombre de parasite est faible.Le calcul de la densité parasitaire va être établit par rapport aux leucocytes. Ilsuffit de compter le nombre de parasites que l’on voit et de compter au moins 200leucocytes. On peut s’aider pour cela d’un compteur de cellules. On estime que lenombre moyen de leucocytes est de 8000 par µl.Le calcul du nombre de parasites par µl est 8000 x Nombre de parasites comptés Nombre de parasites par µl = Nombre de leucocytes comptésLe pourcentage d’hématies parasitées peut en être déduit en prenant commenombre moyen d’hématies, 4 500 000 par µl : Nombre de parasites par µl Pourcentage d’hématies parasitées = 45000 26
  27. 27. Exemple :On compte 358 parasites et 205 leucocytes sur la lameLe nombre de parasites par µl est donc : (8000 x 358) / 205 = 13 971 par µlLe pourcentage d’hématies parasitées est donc : 13 971 / 45 000 = 0,31 % Sur le frottis mince On estime la densité parasitaire sur le frottis mince quand le nombre de parasite est élevé.On compte le nombre d’hématies parasitées par rapport au nombre d’hématiessaines et on établit le pourcentage d’hématies parasitées.Il suffit pour cela de compter dans 3 à 4 champs microscopiques, choisis auhasard mais éloignés les uns des autres, le nombre d’hématies (au minimum de1000 hématies) et le nombre d’hématies parasitées.NB : un champ microscopique à l’immersion (x 100) contient entre 150 et 300hématies Environ 150 hématies Environ 300 hématiesLe pourcentage d’hématies parasitées est donc : Nombre d’hématies parasitées x 100 Pourcentage d’hématies parasitées = Nombre d’hématies saines 27
  28. 28. Le nombre de parasites par µl peut être calculé en prenant comme nombremoyen d’hématies, 4 500 000 par µl : Nombre de parasites par µl = % d’hématies parasitées x 45 000Exemple :On compte 16 hématies parasitées sur 5 champs microscopiques d’environ 300hématies.Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : (16 x 100) / 1500 = 1,06 %Le nombre de parasites par µl est donc : 1,06 x 45 000 = 48 000 par µl 28

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