éLéctrophorèse d'adn
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éLéctrophorèse d'adn Presentation Transcript

  • 1. La république Algérienne Démocratique et PolitiqueMinistère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Mohamed khider-Biskra Faculté des Sciences exacte et des Sciences de la nature et de la vie Département de science de la nature et de la vie Groupe: 01 Chargé de module: Mr Athamena .A 2011/2012
  • 2. Plan de travail introduction Conclusion Définitionapplications But et principe Type d’électrophorèse Matériels et gels utilisé
  • 3. Introduction L’électrophorèse est la principale des techniques utilisées enbiologie pour la séparation et la caractérisation des molécules. Elle a quelques applications en chimie, mais principalementutilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation desprotéines ou celle des acides nucléiques. Alors comment réaliser l’électrophorèse des acidesnucléiques ?
  • 4. DéfinitionTechnique de séparation et d’analyse desparticules chargé grâce àla migration différentiellesous l’action d’un champ électrique .
  • 5. BUT
  • 6. Principe lélectrophorèse est basée sur le principe du mouvement d’ions sous l’effet d’un champ électrique. La vitesse de migration des acides nucléiques sera en fonction de : les petits fragmentsTaille(PM ) Migrent rapidement [ ]du gel [ ]du gel support vitesse de migration
  • 7. Les fragments des acides nucléiques peuvent être séparer selon leur conformation tridimensionnelle Forme II circulaire relachée (un brin coupé) Forme I circulaire Forme III linéaire super enroulée(deux brins cassés) fermée
  • 8. Les acides nucléiques sont des macromolécules polyanioniques chargés négativement à pH 8. Sous un champ électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle +).
  • 9. Mobilité élèctrophorétique différente
  • 10. Les matériels
  • 11. Tampon délectrophorèse(tampon TBE). est une solutioncontenant du Tris [tris (hydroxyméthyl)aminométhane]Du borate ,de EDTA (Ethyléne diaminetétra acétate )ajustée à PH 8.3Tampon de charge : bleu debromophénol - xylène cyanol - glycérol -tampon TBE.
  • 12. LES GELS UTILISÉS• Pour les fragments d’ADN de taille (0,5-20kb) Gel d’agarose • Pour les fragments Gel de de moins de 1000polyacrylamide paires de base
  • 13. gel de polyacrylamides Il existe deux types de gel de polyacrylamide : Les gels non dénaturants•Séparer des fragments d’ADN double brin•Ne peuvent pas déterminer précisément la tailled’un fragment Les gels dénaturants (DGGE)•Séparer des fragments d’ADN simple brin
  • 14. L’électrophorèse d’ADN est constituée de cinq étapesimportantes : 3) Migration 2) Dépôt de l’ADN dans 4) les puits du Coloration gel1) Préparation des gels 5) d’agarose observation
  • 15. Électrophorèse sur gel d’agarose Préparation du gelRéalisation du gel d’agarose par dissolution à chaud depoudre d’agarose dans un tampon TBE à pH 8.2et refroidissement jusqu’à une température voisine de50 C.
  • 16. après avoir obturé lesPréparation du moule pourcouler le gel : deux extrémités du moule avec un scotch fort, placer le moule sur une surface bien horizontale et disposer dans les encoches prévues à cet effet le peigne nécessaire à la réalisation des puits dans le gel.
  • 17. Coulage du gel : verser lentement le gel dans la cuve sans dépasser le niveausupérieur des dents du peigne.
  • 18. Laisser refroidir 30mn environ avantd’enlever délicatement lepeigne. Les puits sontalors prêts pour recevoirles dépôts d’ADN et lescotch fermant la cuvepeut-être enlevé.
  • 19. Mise en place du gel dans la cuve : les puits sont placés du côté de la cathode et la cuve est remplie de tampon TBE jusqu’au niveau supérieur du gel.
  • 20. Préparation de l’ADN Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendrecertaines précautions pour que les fragments ne se réassocientpas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un chocthermique à 65 c avant de le refroidir brutalement.
  • 21. Dilution et densificationde l’ADN par une solutionde charge permettant quele dépôt s’enfonce bienau fond de chaque puits.Cette solution est coloréepar du bleu debromophénol et ellepermettra de suivrel’avancement del’électrophorèse.
  • 22. On dépose directementle dépôt de l’ADN dans lespuits et la migration se faitdans le gel. On branche la cuve a la prise de courant pendant une heure environ.
  • 23. Quand le front de migrationatteint l’extrémité du gel, oncoupe le courant.
  • 24. Révélation des fragments : pendant la migration, ilfaut préparer la solutionpour révéler lesfragments d’ADN : ils’agit d’un colorant bleudans une solutiontampon dont on ajuste lepH à pH= 5.2
  • 25. Elimination de la coloration Après migrationde fond du gel par de leau coloration par du bleu dedistillée méthylène
  • 26. Placer le gel sur un rétroprojecteurpour une observation par la classeentière.
  • 27. Détermination de la tailledun fragment dADN: Gel délectrophorèse suragarose sur lequel on voit : les marqueurs (ouéchelle, "ladder") delongueur (en paires de base)de fragments dADN un fragment dADNinconnu
  • 28. Les avantages de lélectrophorèse en gel dagarosepréparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels dagarosepas de dénaturation des échantillonslagarose plus ferme et moins toxique que le gel depolyacrylamideles échantillons peuvent être récupérés en vue danalysessupplémentaires
  • 29. Électrophorèse en champ pulséOn change périodiquement l’orientation duchamp par rapport au gel ,lors du changementde l’orientation du champ électrique l’acidenucléique change le sens de son orientation .
  • 30. Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé Deux champs non homogènes orthogonaux sont L’OFGE appliqués alternativement (Orthogonal Field Les migrations sont plus linéaires que dans la Alternating Gel technique originale Electrophoresis) Séparer des fragments dont la taille peut atteindre 9Mbchamp homogène. Le FIGE(FieldLe sens du champ électrique étant simplement Inversion Gelinversé périodiquement. Electrophoresis) champ homogène et l’angles de Le CHEF(Contour réorientation était fixé à 120° clamped Les Migrations sont linéaires Homogeous Eletric Séparer des fragements dont la taille peut Field ) atteindre 12 Méga bases. .
  • 31. OFAGE FIGE CHEF A- B+ B-A- A- B-B+ A+ B+ A+ A+ B- α = 90° α = 180° α = 120°Orthogonal Field Alternation Field Invertion Gel Contour-Clamped Gel Electrophoresis Electrophoresis Homogeneous Electric Field Figure 1: Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé
  • 32.  Électrophorèse capillaire Tube capillaire de faible diamètre (50microns)remplie d’un gel remplie d’un gel séparateur. Le capillaire est introduit dans le tube contenant l’échantillon. Sous l’influence d’une haute tension.pénétration et migrationd’acides nucléiques dans lecapillaire . Figure2:instrumentation d’électrophorèse capillaire
  • 33. AvantagesLe système ne Il n’est pasconsomme nécessaire de fairequ’une quantité de dépôtinfimed’échantillon
  • 34. Les applications de l’électrophorèseEstimation du poids moléculaire de fragments dADNaprès une digestion par des enzymes de restrictionAnalyse dADN ou dARN après une amplification parPCRSéparation de fragments d’ADN digérés avant Southernblot ou dARN dans le cas de Northern Blot.
  • 35. ConclusionL’électrophorèse humain a joué un rôle important dans lacartographie du génome .l’ électrophorèse est la séparation departicules causées par un courant électrique. Le processus sépare les composants de lADN pourdéterminer la présence de certains responsables génétiques etmême la présence de troubles et de maladies