2. Techniques de fractionnement
1. Centrifugation
La sédimentation est une technique d’analyse permettant de séparer une dispersion d’un solide au
sein d’un liquide ou une dispersion d’un liquide au sein autre liquide non miscible et de densité
différente. Cette séparation peut se faire d’elle-même sous l’action de la pesanteur lorsque la
dispersion est formée d’une substance beaucoup plus dense que le liquide (décantation). Lorsque
la densité de la substance est plus faible, la sédimentation est gênée par l’agitation thermique, il
faut avoir recours à des champs de forces plus intenses. La centrifugation permet de remplacer
l’accélération de la pesanteur (g) par une accélération centrifuge développée par un rotor
tournant à grande vitesse.
3. 1.1. Définition
Le mot centrifugation est construit à partir du verbe "centrifuger" qui vient du latin
fugere qui signifie "fuir" et de "centre", auquel est ajouter le suffixe -action
indiquant une action. La centrifugation est un procédé de séparation des composés
d'un mélange en fonction de leur différence de densité en les soumettant à une
force centrifuge. Le mélange à séparer peut être constitué soit de deux phases
liquides, soit de particules solides en suspension dans un fluide. On peut ainsi
fractionner une préparation en un sédiment (ou "culot"), constitué de matériel plus
ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant
qui sera le liquide résiduel au dessus du sédiment.
4. 1.2. Principe
Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer dans ce champ jusqu'à
ce qu'elle rencontre une résistance capable de l'arrêter complètement. Ce principe
fondamental de physique est très utilisé en biochimie pour séparer des précipités, des
cellules, des organites et même des macromolécules. En mettant une préparation
biochimique dans le rotor d'une centrifugeuse et en faisant tourner celui-ci, on génère une
accélération qui va pousser les particules qui la composent vers l'extérieur du rotor, c'est-à-
dire le fond du tube à centrifuger. La vitesse avec laquelle se déplaceront ces particules est
proportionnelle à :
la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise ;
la masse de la particule ;
la différence entre la densité de la particule et celle du solvant
5. . Tous les constituants contenus dans un échantillon sont soumis à la gravité, force qui s'exerce
du haut vers le bas, et à la poussée d'Archimède, force qui s'exerce du bas vers le haut. En
dehors du cas particulier dans lequel ces deux forces sont parfaitement équilibrées, on pourrait
donc s'attendre qu'avec le temps tous les constituants finissent par tomber au fond du récipient
dans lequel ils se trouvent (sédimentation) ou remontent à la surface. C'est d'ailleurs ce qui arrive
pour certains. Mais pour la majorité d'entre eux, un autre phénomène intervient qui empêche ce
résultat : l'agitation moléculaire. Elle n'a pas de direction privilégiée, et à l'échelle microscopique
l'agitation moléculaire est de très loin plus importante que la gravité et la poussée d'Archimède,
de sorte que les effets de ces dernières sont négligeables (fig.1 et fig. 2).
6. Fig. 1. Forces s’exerçant sur une particule en suspension dans un liquide. La gravité et la poussée d'Archimède
sont faibles comparées à l'agitation moléculaire. Elle peut entraîner un mouvement de la particule, mais comme
elle n'a pas de direction privilégiée, statistiquement l'ensemble des particules ne se déplace pas.
Fig. 2. Forces s’exerçant sur une particule en suspension dans un liquide. La gravité et la poussée
d'Archimède sont grands comparées à l'agitation moléculaire. Les particules sédimentent vers le
fond du tube.
7. En faisant tourner l'échantillon, on fait apparaître une nouvelle force, la force centrifuge,
qui est une accélération qui s'exerce vers l'extérieur, ce qui entraîne sa sédimentation ou sa
remontée (fig. 3).
Fig. 3. La force centrifuge
8. 1.6. Types de centrifugation
1.4.1. Centrifugation en gradient de densité ou centrifugation à l'équilibre
Dans une centrifugation en gradient de densité, les différents constituants atteignent une
position dont ils ne vont plus bouger, car étant en équilibre. l'équilibre est atteint lorsque
la densité d'une particule est égale à la densité du solvant, ce qui entraîne que la force
gravitationnelle est égale à la poussée d'Archimède. On va donc utiliser un solvant dont la
densité va varier en fonction de la position dans le tube permettant aux différents
constituants de rejoindre la zone de densité équivalente à la sienne : on parle de gradient.
9. 1.4.1.1. Préparation des gradients
Pour obtenir des solutions de densités différentes, la méthode la plus classique est
d'utiliser des solutions de concentration croissante en saccharose, mais on utilise aussi
du chlorure de césium. D'autres molécules sont aussi utilisées mais beaucoup plus
marginalement.
10. 1.4.1.2. Gradients continus et discontinus
Il existe deux types de gradients :
Les gradients discontinus sont constitués d'un empilement de solutions de
moins en moins dense. Les différents éléments s'accumulent aux interfaces entre les
solutions de densité différentes. Au dessus, leur densité étant plus élevée, ils migrent
vers le bas, et au dessous, leur densité étant plus faible ils migrent vers le haut.
Les gradients continus pour lesquels la variation de densité est continue
(comme leur nom l'indique). Les différents constituants vont alors migrer jusqu'à
atteindre le point précis où leur densité est égale à celle du solvant formant des bandes
parfois visibles à l'œil nu (diffusion de la lumière).
11. Fig. 4. Exemple de gradient discontinu. L'échantillon a été représenté au sommet ce
qui suppose qu'il soit moins dense que la première couche de solution de saccharose. Il
arrive qu'on place l'échantillon au fond, au besoin en ayant au préalable augmenté sa
densité en ajoutant du saccharose (par exemple).
Fig. 4. Exemple de gradient continu. Le gradient peut être linéaire (cas présenté) mais
aussi exponentiel ou logarithmique selon les besoins. On le coule en faisant varier en
continu le débit de deux pompes qui mélangent deux solutions, l'une à 10% et l'autre à
60% de saccharose dans le cas présent.
12. Centrifugation isopycnique
Les molécules soumises à la centrifugation sur le gradient se sépareront selon leur
densité, non pas leur masse. La préparation à analyser est mélangée avec le gradient.
Chaque type de particule sédimentera jusqu'à ce qu'elle atteigne la concentration
correspondant à sa densité. Elle s'immobilisera alors à ce niveau.
13. •Centrifugation de zone ou séparation zonale
La centrifugation peut aussi être utilisée pour des fins analytiques, pour séparer des
particules ou des molécules, selon leur taille. Dans ce type d'applications, comme les
particules sont homogènes, elles ont toutes la même densité, elles ne diffèrent que par
leur taille. Le gradient sert donc à faire en sorte que les particules lourdes sédimentent
plus vite que les plus légères, tout en n'atteignant jamais le fond du tube à centrifuger.
Au début de cette centrifugation, l’échantillon est déposé sur une colonne liquide
constituant un gradient de densité.+
14. 1.4.2. La centrifugation différentielle
Le principe est de séparer les différents constituants le plus souvent à l'aide de plusieurs
cycles de centrifugation à accélération croissante. Dans une première centrifugation à
faible accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au
fond du tube. Tous les autres éléments vont rester dans la fraction liquide appelée alors
surnageant. On récupère alors séparément le surnageant et le culot ce qui revient à avoir
séparé les constituants qui les composent. Cette méthode est par exemple couramment
utilisée pour récupérer les éléments figurés (les cellules) du sang qui sédimentent pour
des accélérations très faibles (quelques dizaines de g).
15. 1.7. Appareillages
1.5.1. Centrifugeuses
Une gamme d'appareils a été développée en fonction des besoins expérimentaux,
particulièrement au niveau des accélérations requises, des volumes de matériel à
centrifuger, de la température de travail, etc. La principale limite qui détermine
la vitesse de rotation du rotor est évidemment la force du moteur qui le fait
tourner. Plus le rotor est lourd et volumineux, plus l'effort que doit fournir le
moteur est grand
16. 1.5.1.1. Centrifugeuses de table
Les modèles les plus simples, souvent appelées centrifugeuses cliniques, permettent
d'atteindre de faibles accélérations (1000 à 3000 g) à des vitesses de rotation
relativement basses (moins de 3000 rpm). Certains modèles sont réfrigérés, certains
autres non.
1.5.1.2. Centrifugeuses au sol
Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles permettent d'obtenir des vitesses de
rotation de l'ordre de 30 000 rpm, donnant pour les plus petits rotors des
accélérations d'environ 20 000 g. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces
centrifugeuses permettent de centrifuger des relativement gros volumes. Certains
rotors peuvent même contenir quatre ou six bouteilles de 250 ml.
17. 1.5.1.3. Microcentrifugeuses
On a aussi développé des centrifugeuses spécialement conçues pour les micro-
volumes très souvent employés en biochimie moderne. Les microtubes à
centrifuger sont des petits tubes coniques généralement de 1.5 ml fait de
polypropylène et assez peu dispendieux. Les centrifugeuses de ce type peuvent
être réfrigérées et atteindre des accélérations de l'ordre de 12- 15 000 g. Les
modèles les moins couteux n'ont pas de contrôle de vitesse et ne sont pas
réfrigérés.
18. 1.5.1.4. Ultracentrifugeuses
Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent d'atteindre des accélérations
très élevées (jusqu'à 300 000 g) en faisant tourner des rotors très rapidement (50-85
000 rpm). De telles vitesses de rotation ne peuvent s'obtenir que sous pression très
réduite. Les faibles pressions permettent aussi d'éviter la surchauffe du rotor et de
l'échantillon. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces appareils doivent donc être munis
de pompe à vide et de systèmes de réfrigération. Les volumes sont quelques peu
limités, généralement on ne trouve pas de rotors pouvant contenir plus d'une dizaine de
tubes de 40 ml
19. 1.5.1.5. Ultracentrifugeuses analytiques
Ce sont des appareils de moins en moins utilisés. Ces centrifugeuses servent surtout
à analyser la taille et la masse des particules et des protéines. D'autres techniques
beaucoup moins coûteuses sont utilisées de nos jours: électrophorèse, filtration sur
gel, etc.
On peut déterminer avec une grande précision la masse et le coefficient de
sédimentation des protéines et autres particules par ultracentrifugation analytique.
Les méthodes à équilibre d’ultracentrifugation analytique permettent aussi de
déterminer la masse. Cette technique exige un appareillage (centrifugeuse, rotor,
etc.) spécialisé à cette fin
20. 1.5.2. Rotors
Il existe deux grands types de rotor: à angle fixe, à godets mobiles.
1.5.2.1. Rotors à angle fixe
Les rotors à angle fixe sont faits de blocs de métal (aluminium, titane) avec
des puits creusés à l'intérieur et inclinés avec un certain angle par rapport à
l'horizontale, généralement de l'ordre de 15° à 35° selon les modèles. Les
tubes à centrifuger sont déposés dans ces puits. Comme ces rotors sont
relativement compacts..
1.5.2.1. Les rotors à godets mobiles
Les rotors à godets mobiles se réorientent lors de la centrifugation. En effet,
les godets sont disposés sur des crochets ou un système à bascule. Quand la
rotation du rotor débute les godets (et les tubes qu'ils contiennent), sous
l'effet de la force centrifuge, se réorientent et passent en position horizontale.
21. 2. Précipitation
Les protéines sont des molécules sensibles à leur environnement et peuvent être
facilement dénaturées. C'est à dire que leur structure peut être modifiée jusqu'au point
où elles perdent temporairement ou définitivement leurs propriétés biologiques.
D'autre part, il arrive fréquemment qu'on veuille séparer les protéines d'une solution,
soit pour se débarrasser des protéines et ne garder que les petites molécules de solution,
soit au contraire pour se débarrasser des petites molécules. On peut aussi vouloir se
débarrasser d'une partie des protéines. Une des façons les plus rapides est évidemment
de les précipiter. La précipitation peut aussi être contrôlée de façon à ne toucher que
certaines d`entre elles, par précipitation différentielle ou sélective.
Très souvent la dénaturation cause la perte de la solubilité des protéines. C'est pourquoi
nous verrons ces deux phénomènes ensemble.
22. 2.1. Principe de base
Un changement des conditions D’environnent les protéines leur fait souvent perdre
leurs propriétés biologiques et même physique.
Donc, la solubilité des protéines dans une solution aqueuse dépend, entre autres, des
conditions ioniques et de pH. Trois phénomènes de base agissent pour affecter la
solubilité des protéines en solution aqueuse: l'hydratation, la charge
électrostatique et leur conformation.
.
23. l'hydratation
Les protéines, sauf celles intégrées dans les membranes cellulaires, sont d'autant
plus solubles en solution aqueuse qu'elles sont hydratées. Cette coque
d'hydratation les empêche de s'agréger ensemble.
En ajoutant des produits déshydratants qui compétitionnent avec les protéines pour
l'eau d'hydratation, on peut donc provoquer la précipitation des protéines. Des
produits comme le polyéthylène glycol agissent de cette façon
24. la charge électrostatique
les protéines sont électriquement chargées de la même façon, elles auront tendance
à se repousser, donc à ne pas s'agréger. Au contraire, si elles sont électriquement
neutres, cette répulsion disparaît, et l'agrégation devient possible. On peut utiliser
ce phénomène soit en jouant sur le pH de la solution ou avec des électrolytes. Les
électrolytes employés ici sont des sels très solubles en milieu aqueux. Les cations
peuvent neutraliser les charges négatives des chaînes latérales des acides aminés et
les anions neutralisent les charges positives.
En amenant le pH au pH de certaines protéines, on peut donc aussi précipiter
celles-ci. Dans les deux cas, pH ou électrolytes, les protéines ne précipiteront pas
toutes en même temps puisque leur pH ou le nombre et la nature de leurs charges
ne sont pas identiques. La plupart des électrolytes combinent à la fois la
déshydratation et la neutralisation des protéines.
25. leur conformation
Un troisième phénomène peut aussi entrer en jeu, la structure des protéines et leur
dénaturation. A l’état natif des protéines, les groupes latéraux des acides aminés qui les
composent leur permettent d'être solubles en milieu aqueux. En effet les chaines latérales
chargées (Glu, Asp, Lys, Arg. etc.) ou faciles à hydrater ou formant des ponts hydrogène
avec l'eau (Ser, Thr, etc.) sont souvent dirigés vers l'extérieur de la molécule maximisant
leur contact avec le milieu aqueux. Au contraire, les acides possédant des chaines
latérales hydrophobes (Phe, Trp, Tyr) sont généralement camouflés à l'intérieur,
minimisant ces contacts.
La dénaturation brise cette organisation et ramène à la surface des groupements
hydrophobes qui vont avoir tendance à s'agréger entre eux et avec les
groupements hydrophobes des autres protéines dénaturées. Non seulement les
protéines dénaturées sont agrégées, mais leurs groupements hydrophobes sont
plus exposés au milieu aqueux, diminuant encore plus leur solubilité. Les
solvants organiques (acétone, phénol), les acides forts peu concentrés ou des
températures élevées sont souvent utilisés à cette fin
26. 2.2. Types de précipitation
2.2.1. Précipitation totale
Comme son nom l'indique les méthodes de précipitation totale des protéines visent
à éliminer l'ensemble des protéines d'une solution. Ce résultat s'obtient par des
conditions plutôt draconiennes qui, le plus souvent, dénaturent irréversiblement les
protéines. La précipitation totale est utilisée quand on veut séparer les protéines des
autres petites molécules contaminantes,
acides aminés, sucres, etc.., ou, quelquefois, des autres macromolécules. Cette
approche est donc incompatible à des procédures ou on veut récupérer une protéine
intacte et fonctionnelle.
Les techniques suivantes induisent une dénaturation totale.
27. 2.2.1.1. Précipitation à l'éthanol ou à l'acétone
On peut facilement précipiter les protéines en présence d'éthanol 80%
(Et OH) en les gardant à - 20°C quelques heures ou en amenant le mélange à
ébullition durant quelques minutes. Une centrifugation permet alors de sédimenter les
protéines précipitées. L'éthanol résiduel peut être enlevé par extraction des protéines
resuspendues en milieu aqueux avec du chloroforme.
Le principal inconvénient de cette méthode est le grand volume d'éthanol
qu'on doit utiliser, au moins quatre fois celui de la solution protéique
aqueuse. Il faut souligner en plus que la précipitation n'est pas complète, car
certaines protéines sont plus ou moins solubles dans l'éthanol. Une variante
plus efficace utilise de l'acétone au lieu de l'éthanol. Deux fois le volume de
solution protéique est suffisant. La précipitation à l'acétone est aussi plus
efficace car, contrairement à l'éthanol, très peu de protéines sont solubles
dans l'acétone.
28. 2.2.1.2. Précipitation au phénol
Une méthode a été développée spécifiquement pour extraire des petites quantités de
protéines avec du phénol. Les protéines se dénaturent et beaucoup deviennent
solubles dans le phénol ou s'agglomèrent à l'interface phénol-eau, contrairement aux
petites molécules et aux acides nucléiques qui restent solubles dans la phase aqueuse.
Il faut remarquer que cette méthode est souvent utilisée pour des fins inverses,
récupérer les acides nucléiques débarrassés des protéines.
29. 2.2.1.3. Milieux alcalins ou acides
Les protéines ne sont souvent solubles qu'à l'intérieur d'une gamme restreinte de pH.
Donc acidifier ou alcaliniser fortement une solution rendra les protéines insolubles.
Même des concentrations modérées d'acides peuvent induire une dénaturation et une
précipitation des protéines.
Précipitation à l'acide trichloroacétique (TCA)
Précipitation à l'acide perchlorique (PCA)
Précipitation au sulfate de zinc ou au tungstate de sodium
.
30. 2.2.2. Précipitation différentielle
La précipitation différentielle, ou précipitation fractionnée, est beaucoup plus douce
que la précipitation totale et préserve généralement l'intégrité fonctionnelle des
protéines. C'est donc une approche très fréquemment utilisée comment étape dans
l'isolement des protéines. Elle est basée sur le fait que les conditions ioniques ou de
pH qui rendent les protéines insolubles varient pour chaque espèce de protéine. On
peut donc ajuster les concentrations de l'électrolyte ou le pH pour isoler la protéine
désirée.
La stratégie généralement est très simple. Dans un premier temps on amène la
concentration de l'électrolyte ou le pH à un niveau un peu inférieur à celui de la
protéine d'intérêt. Les protéines insolubles dans ces conditions peuvent donc être
éliminées, par exemple par centrifugation. La principale méthode de précipitation
différentielle est celle qui utilise le sulfate d'ammonium. D'autres méthodes sont
beaucoup moins fréquente (thermique, pH, etc.).
31. 2.2.2.1. Précipitation au sulfate d'ammonium
L'électrolyte le plus employé pour la précipitation différentielle est le sulfate d'ammonium.
Ce sel est très soluble en solution aqueuse et permet d'atteindre des forces ioniques très
élevées. Il est très hydrophile et compétitionne efficacement avec les protéines pour l'eau
causant leur déshydratation. Les ions sulfates et ammonium sont relativement petits et
peuvent facilement s'approcher des résidus chargés des protéines pour les neutraliser. Ce
sel a aussi l'avantage de peu dénaturer les protéines et permet de maximiser l'obtention de
protéines biologiquement actives.
32. 2.2.2.2. Précipitation thermique et au pH
Ce sont des approches beaucoup plus rarement utilisées. Leur inconvénient est qu'elles
sont plus susceptibles de dénaturer irréversiblement les protéines. La précipitation
thermique peut s'appliquer aux rares protéines qui restent solubles au dessus de 40°C.
La précipitation au pI est souvent faite dans un sac à dialyse. La solution de protéines
est dialysée extensivement dans un tampon ajusté au pH correspondant au pI de la
protéine d'intérêt. Cette dernière précipite alors dans le sac et peut être récupérée. Cette
dialyse doit se faire contre de grands volumes de tampon, généralement 20 fois celui de
la solution de protéines, avec de nombreux renouvellements durant deux jours.
33. •Récupération des protéines précipitées
La façon la plus courante de récupérer les protéines précipitées est la
centrifugation. Une autre approche est la filtration.
2.3. Applications à la biochimie
2.3.1. Séparation des protéines d'autres molécules contaminants
Une application très fréquente de la précipitation totale des protéines est la
séparation des protéines marquées des acides aminés radioactifs qui ont servi de
précurseurs pour leur marquage métabolique.
34. 2.3.2. Purification des protéines
Une des étapes initiales des procédures de purification est souvent la précipitation
différentielle au sulfate d'ammonium. Cette méthode relativement peu spécifique
s'applique bien aux grands volumes qu'on obtient souvent en début de processus de
purification. Elle permet d'enlever une bonne partie protéines dont on veut se
débarrasser. Il faut toutefois faire suivre cette étape d'une dialyse ou d'une
ultrafiltration pour éliminer le sulfate d'ammonium résiduel.
35. 4. Filtration
4.1.Définition
La filtration est la séparation de particules en suspension dans un fluide, par
différence de pression à travers une membrane convenable.
La filtration est un procédé de séparation permettant de séparer les
constituants d'un mélange qui possède une phase liquide et une phase solide
au travers d'un milieu poreux.
La filtration est une opération dans laquelle les particules solides restent sur le
filtre et on récupère un mélange homogène. L'utilisation d'un filtre permet de
retenir les particules du mélange hétérogène qui sont plus grosses que les
trous du filtre (porosité). Le liquide ayant subi la filtration se nomme filtrat, et
ce que le filtre retient se nomme un résidu.
36. 4.2. Matériel (les filtres)
Il existe deux types de filtre : les filtres en profondeur ou d’épaisseur et filtres
membranes ou écran.
4.2.1. Les filtre en profondeur
Les filtre en profondeur sont constitués de substances fibreuses [papier
(cellulose, coton, fibre de verre, amiante) ou de substances agglomérées
(verre fritté, sable, charbon)]. Dans les deux cas, les particules qui doivent
être arrêtées par la filtration vont se bloquer dans un labyrinthe de canaux
existant à l’intérieur même du filtre.
L’efficacité d’un filtre en profondeur augmente donc avec son épaisseur, par
contre elle diminue lorsque la pression appliquée sur le filtre augmente.
37. ✓Papier filtre classique
Il est utilisé soit sous forme sans pli pour recueillir un précipité, soit sous forme
de filtres plissés qui possède une surface de filtration plus importante et sont
donc utilisés pour la filtration de gros volume liquidiens. Il existe plusieurs
qualités de papier et, sur le plan pratique, il faut distinguer les filtres pour
filtration rapide et très rapide (n°1 et n°4 de Whatman, respectivement), les
filtres pour filtration moyenne (n°2 et n°3 de Whatman), les filtre pour filtration
lente et très lente (n° 6 et n°5 de Whatman, respectivement). Tous ces filtres sont
utilisés sur un support, le plus souvent un entonnoir conique.
38. ✓ Filtres en fibre de verre
Ils sont utilisés à plat sur un Buchner ou sur un entonnoir avec plaque frittée. Ils
sont toujours utilisés non pliés. Les pores sont plus petits que ceux des papiers
filtre. Ils sont toujours utilisés pour éliminer des particules dont la taille est
inférieure à 1µm. Ces filtres peuvent être préchauffés à 500°C afin d’éliminer
toute trace de contaminants organiques avant une ultérieure utilisation. Leur
vitesse de filtration élevée permet de les utiliser sous un vide modéré.
39. ✓ Papier filtre séparateur de phase
Type Whatman 1PS peut remplacer une ampoule à décanter. C’est un
papier hydrophobe qui permet de séparer facilement et rapidement les
solutions aqueuses des solvants sur le papier filtre placé dans un
entonnoir de verre : la phase aqueuse reste sur le filtre, alors que la phase
organique le traverse.
✓ Plaques frittées
Ce sont des plaques poreuses constituées de poudre de verre agglomérée.
Elles sont très utilisées pour les filtrations sous vide. Après usage, les
plaques frittées doivent être nettoyées par le mélange sulfochromique,
puis lavées très abondamment à l’eau distillée.
40. 4.2.2. Les filtres membranes
Constitués d’une fine lame plastique percée de pores calibrés. Ils
retiennent à leur surface toutes les particules dont la taille est supérieure
à celle des pores du filtre. L’augmentation de l’épaisseur du filtre ne
présente pas d’intérêt, si ce n’est d’augmenter sa résistance mécanique.
L’élévation de la pression exercée sur le filtre accélère le débit sans
diminuer l’efficacité de la filtration. Le seul paramètre modifiant
l’efficacité est la taille des pores. La rétention sur un plan de toutes les
particules conduit cependant à un colmatage rapide de ces filtres
41. 4.3. Classification des filtrations
Les filtrations sont classées selon plusieurs critères :
4.3.1. Le diamètre des pores du filtre
On peut aussi nommer différemment l'opération de filtration suivant la taille des pores
du filtre :
Filtration clarifiante : lorsque le diamètre des pores se situe entre 10 et 450 µm.
Microfiltration : lorsque le diamètre des pores se situe entre 10 nm et 10 µm.
Ultrafiltration : lorsque le diamètre des pores se situe entre 1 et 10 nm.
Osmose inverse : lorsque le diamètre des pores se situe entre 0.1 et 1 nm. L’osmose -
inverse est un système de purification de l'eau contenant des matières en solution par
un système de filtrage très fin qui ne laisse passer que les molécules d'eau,
Filtration stérilisante : lorsque le diamètre des pores est inférieur à 0,22 µm (permet
la rétention de micro-organisme).
42. 4.3.2. Mode de passage du fluide
Il existe deux principales techniques de filtration :
La filtration frontale (fig. 1), la plus connue, consiste à faire passer le fluide à
filtrer perpendiculairement à la surface du filtre. Les particules étant retenues par
le filtre, cette technique est limitée par l'accumulation des particules à sa surface,
qui finissent peu à peu par le boucher (colmatage).
43. La filtration tangentielle (Fig. 2), au contraire, consiste à faire passer le fluide
tangentiellement à la surface du filtre. C'est la pression du fluide qui permet à celui-ci de
traverser le filtre. Les particules, dans ce cas, restent dans le flux de circulation tangentiel, et
le bouchage s'effectue ainsi beaucoup moins vite. Cependant, cette technique est réservée à
la filtration des très petites particules, d'une taille allant du nm jusqu'au µm.
44. 4.3.3. Le type de pression
✓ Filtration gravimétrique
L’entonnoir de laboratoire équipé d’un filtre papier est l’exemple type de cette méthode. La
différence de pression est créée par la hauteur du liquide sur le filtre.
Les filtres papier sont appliqués avec soin contre l’entonnoir ; quand cela est possible on
les humidifie pour faciliter cette application. La filtration est plus rapide lorsque le filtrat
emplit convenablement la tige du filtre sans bulles d’air.
✓ Filtration sous vide
Une dépression est créée en aval du matériau filtrant. C’est le mode de filtration utilisée
d’une manière courante pour les verres frittés et les membranes filtrantes (fig. 3).
45.
46.
47. . L'ultrafiltration
L'ultrafiltration est un procédé de séparation des molécules dissoutes en fonction de
leur taille. Cette technique fait appel à des membranes à perméabilité sélective :
toutes substances de taille inférieure à celle des pores de la membrane passent
(ainsi que les molécules de solvant) alors que les molécules plus grandes sont
retenues et concentrées. Une pression est exercée sur la solution à filtrer. Le
procédé, très simple à mettre en œuvre et ne nécessite ni changement de phase, ni
processus chimique. Les conditions très douces ne détruisent pas l'activité
biologique des molécules les plus fragiles.
L'ultrafiltration couvre un domaine très large équivalent à une
gamme de masse moléculaire allant de 500 à 1 000 000 daltons.
Ce domaine d'application permet de situer l'ultrafiltration
entre l'osmose inverse où les sels sont retenus et la
microfiltration où la taille des pores varie de 0,01 à 10 μm (fig.
6).
49. 4.4. Application
4.4.1. La clarification
Obtention d’un liquide libérée de particule solide.
4.4.2. La stérilisation
De nombreuses molécules biologiques sont sensibles à la chaleur et ne peuvent être
stérilisées à l’autoclave. La solution à ce problème est la stérilisation à froid.
Les filtres de surface qu’on utilise ont des pores de 0,45µm ou de 0,22µm de
diamètre. Les bactéries sont toutes retenues par un filtre de 0,45µm. Ceux de 0,22µm
arrêtent de nombreux virus et des mycoplastes.
4.4.3. Ultrafiltration
• Peptides, protéins.
- Dessalage : fractions obtenues en présence de fortes concentrations de sel.
- Concentration : anticorps monoclonaux, immunoglobulines, urine, liquide
cérébrospinal, sérum ...
• Acides nucléiques.
-Elimination : des oligonucléotides, fragments d'ADN très courts ...
50. Désintégration cellulaire
La désintégration de la cellule ou la lyse est une étape initiale de la préparation de
l'échantillon à analyser. La Lyse vise à rompre la membrane plasmique ou la paroi
pour la cellule végétale et fongique en libérant les substances ou structures
désirées.
Pour se faire, le matériel biologique est mis dans un tampon de pH et force ionique
connus. Les composantes cellulaires se retrouvent donc libérées dans le tampon. Le
mélange résultant du matériel biologique ainsi brisé et du tampon est appelé
homogénat.
Techniques désintégration cellulaire
Il existe plusieurs méthodes de lysats cellules qui se divisent en méthodes
mécaniques, chimiques et enzymatiques.
51. Les techniques mécaniques
Broyeurs mécaniques
Une des approches qui a été développée la première est celle du broyage
mécanique, essentiellement dérivé des mortiers et des pilons utilisés en chimie ou
en pharmacie. Cependant, sauf pour certaines applications spécifiques où le
matériel est sous forme solide, sèche ou congelée, cette approche se prête mal au
matériel biologique, particulièrement si on doit homogénéiser en milieu liquide.
Des appareils répondant mieux aux besoins des biologistes ont donc été conçus. Il
existe plusieurs variantes de ces appareils :
52. Homogénéisateur de type Dounce
Cet appareil (fig. 1) ressemble à une éprouvette (aux parois épaisses) dans
laquelle s’enfonce un piston serré. Le passage des cellules dans l’espace
extrêmement exigu entre le piston et la paroi interne du tube cause leur
éclatement.En faisant tourner et descendre rapidement le piston dans le bol,
on force les cellules à passer dans l'espace libre entre le piston et la paroi du
bol. Par cisaillement, les membranes cellulaires s'ouvrent et libèrent les
organites. Suivant la taille des cellules, on utilise des Dounce de
"clearance" différentes. La "clearance" est l'espace compris entre le piston
et la paroi du bol.
53. Melle
. AOUACHRIA S. Désintégration cellulaire
Fig.1. L’homogénéisateur de type Dounce.
✓ L’homogénéisateur de type Potter‐Elvehjem
Il ressemble à un Dounce motorisé; son piston a souvent une tête de téflon et tourne dans le cylindre contenant
les cellules resuspendues (fig. 2).
Fig.2. L’homogénéisateur de type Potter‐Elvehjem.
En faisant tourner et descendre rapidement le piston dans le bol, on force les cellules à passer dans l'espace libre
entre le piston et la paroi du bol (clearance). Les membranes cellulaires s'ouvrent et libèrent les organites (fig. 3).
Fig. 3. Action des broyeurs mécaniques.
2
54. 1.La presse Aminco-French
Cet appareil (fig. 4) n’est pas français, il a été mis au point par un certain Dr. French (un
nom d’inventeur plus facile à porter). L’appareil vise à forcer les cellules à passer dans un
espace plus petit qu’elles, ce qui déchire leur membrane (et réduit la plupart de leurs
structures). Il consiste en un cyclindre creux en métal, cylindre dans lequel s’enfonce un
piston de métal nanti de plusieurs o-rings d’un caoutchouc très solide. À la base du
cylindre, une petite valve est installée; celle-ci peut être obstruée par une petite bille en
téflon.
55. La suspension de cellules est versée dans le cylindre. Le piston est installé,
obstruant le trou, et une puissante vis sans fin commence à l’enfoncer dans le
cylindre. Comme il n’y a que peu d’air dans le cylindre et qu’un liquide est à toute
fin pratique incompressible, l’enfoncement du piston fait très rapidement grimper
la pression sur les parois du cylindre. Quand on ouvre légèrement la valve, la
suspension de cellules est éjectée et les cellules sont déchiquetées. Plus la pression
est haute dans le cylindre, plus totale est la lyse (fig. 5).
Fig. 5. Mécanisme d’action de la presse
Aminco-French.
56. 2.1.3 Homogénéisateurs à gaz ou la bombe à disruption(fig. 6)
consiste en une chambre pressurisée dans laquelle les cellules sont traitées avec de l'azote à
haute pression (la pression peut atteindre 350 bars). La pression force l'azote à se solubiliser
dans les liquides. On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son
état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater.
Les cellules sont enfermées dans une chambre métallique que l'on pressurise à l'aide d'un
gaz inerte (azote ou argon). Une brusque décompression disloque les structures cellulaires.
En effet, les cellules éclatent à cause de la formation de bulles de gaz. A pression élevée, le
milieu liquide dissout mieux les gaz et un dégazage important se produit en revenant à la
pression atmosphérique
Fig. 6. Homogénéisateur à gaz ou la bombe à
disruption.
L'intérêt de la technique est le fait que l'on
travaille sous une atmosphère inerte ce qui
élimine les risques de réactions d'oxydation, on
ne provoque pas d'échauffement et les organites
cytoplasmiques sont préservés.
57. Les billes de verre
L’appareil utilisé pour cette technique ressemble à un blender à ceci près qu’il est beaucoup
plus petit et ne contient pas de lames. Son contenant amovible est rempli de petites billes de
verre sur lesquelles on verse la suspension de cellules (fig. 7). La suspension se répartit entre
les billes. Il est important de remplir complètement le contenant et de ne pas y laisser d’air
pour éviter de faire de la mousse et d’oxyder les protéines. Le tout est alors scellé et on
lance la machine, qui fait furieusement tourbilloner les billes de verre dont l’action abrasive
a tôt fait de réduire les cellules en charpie.
Séparer les billes du lysat est très facile parce que les billes coulent au fond dès que
l'agitation cesse.
On doit prendre soin de garder le tout au frais; en fait le contenant est souvent nanti d’une
chambre où on installe de la glace. Le mouvement des billes génère en effet beaucoup de
chaleur.
fig. 7. Billes de verre.
58. Sonication
Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons. Ici, une tige de métal le
"sonicateur" ou à l’extrémité très fine. La sonotrode est introduite dans la suspension
de cellules et induite à vibrer violemment, émettant un bruit fort déplaisant même pour
l’utilisateur portant ses cache- oreilles obligatoires (fig. 8).
Fig. 8. Sonicateur
59. Quand un sonicateur fait vibrer les molécules d’eau. Les vibrations ultrasoniques
réussissent à briser les ponts hydrogènes qui assurent l'état liquide de l'eau, ce qui les
convertit en gaz. Il s'agit en quelques sortes d'une ébullition à froid, effectuée en
agitant les molécules d'eau. Le problème avec le sonicateur est qu'il génère beaucoup
de chaleur dans le matériel biologique. L'utilisateur a tout intérêt à garder le tube
dans lequel a lieu la sonication dans un bac à glace. On soumet les cellules à une
source d'ultrasons. Les ultrasons sont générés par un "transducteur" en céramique,
c'est un organe qui transforme l'énergie électrique domestique (50 à 60 Hz) en
énergie ultrasonique (20 kHz).
Fig. 9. Schéma du dispositif du sonicateur.
60. Congélation –décongélation
On peut aussi faire subir au matériel biologique des cycles de congélations et de
décongélations qui briseront les membranes. Des températures de -20°C sont
souvent suffisantes. En général, ces méthodes ne permettent pas de préserver
l'intégrité des structures membranaires et beaucoup d'organites sont endommagées.
Dans certains cas, un refroidissement très rapide et très profond est requis,
particulièrement pour inactiver toute activité enzymatique ou une décomposition de
produits particulièrement labiles. L'azote liquide peut alors être employé. Le
matériel peut par la suite être réduit en poudre. Le clampage à froid est une variante
de cette approche. Cette technique consiste à comprimer des tissus entre les plaques
de pinces refroidies à l'azote liquide.
61. 2.2. Techniques chimique et enzymatiques
2.2.1. Lyse ou choc osmotique
En créant par dilution une hypotonicité du milieu, on provoque l'éclatement des
cellules. Mais il y a le risque, dans cette opération, de faire éclater les organites.
Le choc osmotique permet de briser certaines cellules fragiles avec un minimum de
dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à
rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une
rupture de la membrane plasmique. On peut donner un coup de pouce à la technique
avec un peu de détergent (NP-40, LDAO, triton X-100) et avec un soutien mécanique
(quelques coups de piston dans un homogénéisateur de type Dounce). Une telle
approche permet de récupérer des noyaux presque intacts une fois séparés des débris
de la membrane plasmique.
.
62. 2.2.2. Lyse enzymatique
Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la paroi
cellulaire qui protège la membrane plasmique. Si on n’opte pas pour une
méthode mécanique et violente d’extraction, il faudra d’abord détruire cette paroi
avant de s’en prendre au reste de la cellule.
Différents enzymes comme le lysozyme (du blanc d'oeuf de poule, par exemple)
ou la lyticase de S.aureus sont disponibles pour s’occuper de cette tâche; il suffit
de choisir le plus approprié.
63. 2.2.3. Modification de la force ionique, du pH
On modifie la force ionique du milieu en ajoutant des ions ou en
modifiant le pH. Pour certains types de cellules, on peut par ce
traitement rendre les membranes plus perméables aux constituants du
milieu et modifier ainsi la tonicité du cytoplasme. Ceci entraînera une
rupture de la membrane plasmique.
64. 2.2.4. Utilisation de détergents
Les détergents sont capables de désorganiser les lipides membranaires. Ils
affaiblissent de ce fait les interactions entre les différents constituants de la
membrane. Le résultat est une rupture de la membrane. L'action des détergents est
difficile à contrôler. La technique demande donc une mise au point précise qui
peut être fastidieuse. On peut utiliser un détergent doux (Triton, Tween,
etc., quelquefois déoxycholate) pour libérer les composés de l’intérieur des
compartiments en dissolvant les membranes de ces compartiment.
65. 2. Techniques d'extraction
2.1. Généralité
L’extraction est une opération qui consiste à séparer ou prélever un ou plusieurs
composés d’un organisme (animal ou végétal) selon diverses techniques.
Un grand nombre de méthodes qui utilisent des solvants organiques et / ou aqueux
sont employés dans l’extraction des produits naturels.
Le choix de la méthode d’extraction doit se baser sur les propriétés physico-
chimiques du composé en question. Ceci inclut le coefficient de partition dans l’eau
ou le solvant organique, la polarité de la molécule, la stabilité de cette molécule
dans la lumière ou l’obscurité et sa stabilité thermique. Les produits qui sont
solubles dans l’eau sont extraits dans l’eau ou les solutions tampon. Les produits
qui sont soluble dans les solvants organiques sont extraits dans des solvants, pour
obtenir un extrait organique.
66. L’extraction peut être classée en trois types selon la nature des extraits et des
milieux utilisés pour l’extraction :
Extraction liquide-liquide
Si le (les) composé (s) à extraire est (sont) présente (ent) dans une solution,
l'extraction est réalisée à l'aide d'une ampoule à décanter. Il s'agit alors d'une
extraction liquide-liquide. Elle consiste à extraire composants dissout dans un
solvant, à l'aide d'un autre solvant, appelé solvant d'extraction, dans lequel elle
est plus soluble. Pour que l’opération soit réalisable il est nécessaire:
•que les deux phases ne soient pas complètement miscibles ;
•que leur masse volumique soient différentes ;
•qu’il n’existe pas de réactions chimiques entre les divers constituants du
mélange.
67. Extraction solide-liquide
Si le (les) composé (s) à extraire est (sont) présente (ent) dans un solide,
l'extraction est réalisée par macération, infusion ou décoction. Il s'agit
alors d'une extraction solide-liquide. Elle consiste à dissoudre
sélectivement un ou plusieurs composés contenus dans une phase solide
initiale par un solvant adéquat.
68. 2.2. Extraction aqueuse
Pour préparer un extrait aqueux, il y’a des méthodes traditionnelles et des méthodes
appliquées en laboratoire ou au niveau industrielles.
2.2.1. Infusion
L’infusion d’un matériel végétal se fait par sa dissolution dans l’eau chaude (tisanes) ou
froide. La préparation d’une infusion avec de l’eau chaude peut être faite comme suit :
•Place le matériel végétal dans une théière qui contient un couvercle.
•Ajouter de l’eau bouillante et laisser infuser.
La préparation d’une infusion avec de l’eau froide peut être faite comme suit :
•Placer le matériel végétal dans une bouteille remplie d’eau froide.
•Couvrir la bouteille, pour éviter la contamination avec la poussière ou les insectes.
•Laisser infuser une journée.
Certaines références considèrent cette méthode une macération
69. 2.2.2. Décoction
La décoction est une méthode d’extraction d’un matériel biologique
généralement végétal, consiste à chauffer l'élément avec de l'eau, jusqu'à ce
que cette dernière soit bouillante, pour en extraire les principes actifs. La
décoction permet une extraction des principes actifs plus complète que
l'infusion mais ne s'applique pas partout, la température modifiant ou
dégradant certains principes.
Une décoction peut être préparée comme suit :
•Placer une quantité du matériel végétal dans une casserole, ajouter l’eau
froide.
•Faire bouillir l’eau.
•Laisser mijoter jusqu’à ce que le volume diminue au tiers.
•Filtrer et conserver dans un flacon à 4°C.
70. 2.2.3. Méthodes d’extraction aqueuse aux laboratoires ou industrielles
2.2.3.1. L’hydro-distillation
L’hydro-distillation consiste à distiller un composé par entraînement à la vapeur
d’eau. Cette technique fait intervenir quatre étapes (fig.1).
•Entraînement à la vapeur : on fait bouillir un mélange d'eau et de substance naturelle
contenant le composé à extraire (huile essentielle). La vapeur entraîne les huiles
essentielles contenues dans le produit brut. Enfin on condense ces vapeurs à l'aide
d'un réfrigérant.
71. •Relargage : il consiste à rendre les huiles essentielles moins solubles dans l'eau en
ajoutant duchlorure de sodium. De cette façon il sera plus aisé de récupérer ces
huiles essentielles.
•Décantation : on la réalise dans une ampoule à décanter dans laquelle le mélange
précédent se sépare en deux phases non miscibles. Une phase aqueuse, en général
plus dense, se situe dans la partie inférieure et une phase organique, de densité plus
faible et contenant la (ou les) huile(s) essentielle(s) se situe au dessus.
•Séchage et filtration : afin d'éliminer le peu d'eau susceptible d'avoir été retenue
dans la phase organique, on fait agir un déshydratant. C'est l'opération de séchage.
On filtre ensuite pour ne recueillir que la phase organique exempte d'eau.
72. 2.2.3.2. Entrainement à la vapeur
Elle utilise le même principe d’entrainement par la vapeur des constituants que la
méthode précédente. Cependant, le matériel végétal dans ce cas n’est pas en contact
direct avec l’eau.
A l’échelle industrielle, il s’agit de faire pénétrer la vapeur d’eau à travers le matériel
végétal bien réparti sur des plaques perforées dans l’alambic (fig. 2). Cette vapeur se
charge de substances aromatiques, puis condensée (condenseur à l’eau froide) et
récupérée dans un récipient adéquat. Après, la décantation du distillat refroidi, les huiles
essentielles vont séparées.
Fig. 2. Schéma d'un alambic.
73. •L’ébullition du mélange d’eau et du produit crée un courant de vapeurs.
•Le courant de vapeurs est constitué de vapeurs d’eau et de vapeurs des
huiles du produit.
•Le mélange gazeux est condensé pour obtenir un distillat.
•Le distillat est constitué d’eau à l’état liquide et des huiles essentielles à
l’état liquide.
•Les huiles essentielles étant peu miscibles avec l’eau et moins dense que
l’eau, elles surnagent
74. 2.3. Extraction organique
L'extraction par solvant consiste à dissoudre le composé recherché dans un solvant non
miscible avec l'eau. Le choix du solvant obéit à quatre critères :
•Etat physique du solvant : Le solvant doit être liquide à la température et à la pression
où l'on réalise l'extraction.
•Miscibilité du solvant : Le solvant doit être non miscible à la phase qui contient
initialement le composé à extraire.
•Solubilité : Le composé à extraire doit être très soluble dans le solvant. C'est-à dire,
beaucoup plus soluble dans le solvant que dans le milieu où il se trouve initialement
(milieu aqueux en général).
•Densité du solvant: Il est nécessaire de connaître ce paramètre car c'est lui qui
détermine si la phase organique, contenant le composé à extraire, se trouve au dessus ou
en dessous de la phase aqueuse (à éliminer) dans l'ampoule à décanter.
75. 2.2.3.3. Critères d'une bonne distillation
Pour obtenir une huile essentielle de première qualité, les critères suivants doivent être
respectés :•L'alambic: il doit être en acier inoxydable, le cuivre et le fer pouvant former
des oxydes.
•Basse pression : la distillation doit s'effectuer à basse pression, entre 0.05 et 0.10 bars,
des suroxydations se produisant sous haute pression. Ainsi, la couleur de l'huile
essentielle varie en élevant la pression.
•Durée de la distillation : elle doit être prolongée pour permettre de recueillir le
"totum"(totalité) des molécules aromatiques.
•L'eau : l'eau employée doit être une eau de source peu ou non calcaire pour éviter de
recourir aux détartrants chimiques.
•Stockage et conservation : après distillation, les huiles essentielles doivent être filtrées,
puis stockées dans des cuves hermétiques inaltérables entreposées dans une cave fraîche.
Leur mise en bouteille doit se faire uniquement dans des flacons en verre opaque brun ou
bleu pour assurer leur conservation à l'abri de la lumière et de l'oxygène.
76. L’extraction par un solvant peut se fait en appliquant plusieurs techniques dont :
2.3.1. La macération
C’est un procédé qui consiste à laisser séjourner un solide dans un liquide (dans
un récipient fermé) pour en extraire les composés solubles. La macération se fait
à température ambiante pour éviter la dégradation des composés thermolabiles.
L’agitation du mélange au cours de l’extraction pour garantir un homogénéisation
peut augmenter la vitesse de l’extraction.
L’extraction s’arrête quand l’équilibre est atteint entre la concentration des
composés dans l’extrait et celle dans le solide utilisé pour la macération.
Après la macération, le reste du solide utilisé pour l’extraction (résidu) est
séparé du solvant. Ceci implique la clarification par décantation, qui est
toujours suivie par une filtration. Une centrifugation peut être nécessaire si
la poudre est si fine pour être filtrée. Le majeur désavantage de la
macération est que le processus peut durer trop de temps; entre quelques
heures à plusieurs semaines.
77. Exemples de macérations
•Extraire les composés solubles : en phytothérapie, pour la préparation
d’extraits végétales ; phénols, alcaloïdes et les huiles essentielles.
•Conservation des aliments : cornichons dans le vinaigre, sardine dans l'huile,
...
•Attendrir et assaisonner un aliment : marinade.
•Décomposition : macération des os pour nettoyer un squelette, macération
acide pour extraire des microfossiles.
•En vinification, on laisse les peaux de raisin macérer dans le moût.
78. 2.3.2. Extraction avec une ampoule à décanter
le mélange dont on veut effectuer la séparation est mit en contact avec un deuxième
liquide non miscible appelé solvant et retenu pour sa capacité à extraire
préférentiellement l'un des éléments du mélange.
Après l'opération, on récupère deux phases séparées par décantation: l'extrait formé
du solvant enrichi en soluté, et le raffinat, soit le mélange appauvri en soluté.
Au laboratoire, c'est aussi une technique de purification très employée : dans une
ampoule à décanter, les deux liquides séparent les solutés en fonction de leur
solubilité dans chaque solvant.
79. Cette technique fait intervenir trois étapes (elle peut compléter l’hydro-
distillation).
•La mise en contact du solvant avec la substance contenant le composé à
extraire.
•La décantation : il s'agit de l'opération réalisée à l'aide de l'ampoule à
décanter. En fonction de la nature du solvant utilisé et en particulier de sa
densité par rapport à celle de l'eau, la phase organique à récupérer se situera
au dessus ou en dessous.
•Le séchage et la filtration
80. 2.3.3. Extraction avec un Soxhlet
Un extracteur de Soxhlet (ou appareil de Soxhlet) est une pièce de verrerie qui permet de
faire une extraction continue par solvant d'un composé ou espèce chimique contenue
dans une poudre solide. Cet appareil porte le nom de son inventeur : Franz von Soxhlet.
Dans cette méthode, le solide est soumis à l’extraction plusieurs fois avec un solvant.
Un Soxhlet (fig. 3) se compose d'un corps en verre (4) dans lequel est placée une
cartouche en papier-filtre épais (5), d'un tube siphon (6-7) et d'un tube d'adduction (3).
Dans le montage, l'extracteur est placé sur un ballon (2) contenant le solvant d'extraction
(1). Dans l'extracteur est insérée une cartouche dans laquelle est placé la poudre
contenant l'espèce à extraire ; puis un réfrigérant (9-10-11) est adapté au-dessus de
l'extracteur
81. Quand le ballon est chauffé, les vapeurs de solvant passent par le tube adducteur, se
condensent dans le réfrigérant et retombent dans le corps de l'extracteur, faisant ainsi
macérer le solide dans le solvant (chauffé par les vapeurs se trouvant en dessous). Le
solvant condensé s'accumule dans l'extracteur jusqu'à atteindre le sommet du tube-
siphon, qui provoque alors le retour du liquide dans le ballon, accompagné des
substances extraites, et le solvant contenu dans le ballon s'enrichit donc
progressivement en composés solubles.
Le solvant continue alors de s'évaporer, alors que les substances extraites restent
dans le ballon (leur température d'ébullition doit être nettement supérieure à celle du
solvant extracteur)
Fig. 3. Appareil de de Soxhlet
82. Avantages
Le cycle se répète indéfiniment. On peut ainsi épuiser complètement le solide en
quelques cycles sans intervention. Le résultat est équivalent à une série de
macérations successives.
De plus, cette méthode requiert nettement moins de solvant que la méthode des
macérations successives pour une même efficacité d'extraction. L'intérêt est donc
également économique.
Le solvant est constamment distillé, de sorte qu'il ne se sature jamais. Même si la
substance extraite est en trop grande quantité par rapport au solvant et qu'elle
dépasse sa solubilité maximale, c'est toujours du solvant pur qui retombe de
l'évaporateur.
Inconvénients
La taille de la cartouche étant limitée, il peut être nécessaire de réaliser plusieurs
extractions successives avec plusieurs cartouches, ce qui peut prendre un temps
considérable. L'extraction à chaud peut dégrader certaines substances chimiques
83. 2.3.4. La percolation
Au cours de la percolation, le tissue de la plante en poudre est initialement imbibé de
solvant dans un percolateur (un récipient cylindrique ou conique avec un robinet en bas).
Une quantité de solvant est versé en dessus de la poudre de plante et laisser percoler
lentement (sous forme de goutes) en dehors du percolateur.
La taille des particules de la poudre a une influence sur l’utilisation de la technique.
Alors les poudres fines des tissus de plantes et les tissus qui contiennent des mucilages,
peuvent colmater le filtre du percolateur.
D’un autre côté, si la poudre n’est bien distribuée dans le récipient, ou si elle est trop
dense; le solvant ne peut pas atteindre toutes les particules et l’extraction ne sera pas
complète.
Un autre inconvénient de la percolation est l’utilisation de grand volume de solvant, et
que le processus dure longtemps.
84. 2.3.5. Extraction avec un solvant pressurisé
aussi appelé extraction accélérée. L’extraction est appliquée à haute température et a
besoin de haute pression pour maintenir le solvant sous forme liquide à haute
température.
La poudre de plante est chargée dans une cellule qui est placé dans une étuve. Le
solvant est alors pompé d’un réservoir pour remplir la cellule, cette dernière est
chauffée pressurisé selon un programme déterminé au préalable.
De hautes températures et pressions augmentent la pénétration du solvant dans les
cellules et améliorer la solubilisation des métabolites. Ceci augmentera la vitesse de
l’extraction. En plus, avec de petites quantités de solvant pressurisé, l’extraction
offre des alternatives plus économiques et amies de la nature.
85. 2.3.6. Extraction (avec des solvants) assistée par les ultrasons
C’est une méthode modifiée de la macération où l’extraction est facilitée par
l’utilisation des ultrasons.
La poudre de plante est placée dans une fiole. La fiole est placée dans un
bains d’ultra-sons. Les ultrasons induisent un stress mécanique sur les cellules
par production de cavitation dans le milieu. L’efficacité de la technique dépend
des longueurs d’ondes et de la température de la sonication. La sonication est
appliquée dans le cas de petites quantités de matériel végétal
86. 2.37. Extraction (avec des solvants) assistée par les micro-ondes
Elle constitue une autre méthode d’extraction des composés phytochimiques. Un
nombre de composés a été extrait avec cette méthode, parmi lesquels, les huiles
essentielles et les alcaloïdes. L’extraction avec les micro-ondes est comparable à
l’extraction avec un soxhlet, mais en un temps moindre.
En général, l’extraction (avec des solvants) assistée par les micro-ondes est appliquée
sur des échantillons de 1 à 10 g, avec un solvant approprié, et des radiations entre 100
à 150 W. L’irradiation est toujours appliquée avec des intervalles courts avec des
intervalles de refroidissement pour ne pas arriver à l’ébullition.
87. L’inconvénient de l’extraction avec un solvant, est en fait son principal
composant : le solvant. En effet, étant donné les quantités mise en œuvre, les risques
de pollution et d’inflammation ne peuvent être réduits à zéro.
De plus, les composés à extraire étant emprisonnés dans la cellule par la membrane
cellulaire, il faudra donc des solvants capables de la traverser. Enfin, il arrive que des
traces de solvant soient présentes dans le produit final (les molécules à extraire) ou
bien dans la matière végétale après traitement.
88. Une nouvelle science est en cours de développement, l’éco-extraction.
L’extraction avec des conditions qui respectent la nature, et qui ne consomme
pas d’énergie.
Voici quelques une des techniques appliquées actuellement en laboratoire :
Distillation accélérée par des micro-ondes.
Hydro-diffusion par micro-ondes et gravité.
Nouveau Soxhlet assisté par micro-ondes.
