REPUBLIQUE ALGERIENNE
DEMOCRATIQUE ET
POPULAIRE
MINISTERE DE
L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
Univ...
Plan de travail
Introduction
Généralité sur les enzymes
Méthodes d’extraction
Méthodes de purification
conclusion
1878 par
Willy
Kuhne
Vient du grec
« en zume » et
signifie « dans
la levure »
L’industrie
agro-
alimentaire
Gluco-
amylase...
enzyme
définition
propriétés
Protéine présentant des propriétés de catalyse
spécifiques d’une réaction chimique du
métabol...
Biocatalyseurs de nature protéique qui accélèrent une réaction
biochimique et se retrouvent intact en fin de réaction et p...
enzyme
Classification
et
nomenclature
1 • Oxydoréductases
2
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4
5
6
• Transférases
• Hydrolases
• Isomérases
• Lyases
• Li...
enzyme
Source
Industrie
 Les enzymes jouent plusieurs rôles dans les productions
alimentaires industrielles.
enzymes sour...
Définition :
 l’extraction désigne l’action de séparer une enzyme du composé dont elle fait partie.
Cette méthode consist...
Choc osmotique
Les cellules sont incubées dans une solution
hypo-osmotique. Cherchant à rétablir
l’équilibre osmotique, l’...
Méthodes mécaniques
Congélation-décongélation
Refroidissement
brusque
La
concentration
du soluté intra
et
extracellulaire
...
Broyage ou agitation avec des abrasifs
Agitation violente Microbilles de verre
désintègre les
microorganismes
avec rupture...
Bombe à disruption
 La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides.
 On libère alors la pression tout d'un...
Homogénéisateur d'Elvejm de potier
Equipement
simple
Pilon sous forme de
tige de verre
Des dents sur son
bout
 La manipul...
Les billes de verre
La suspension se répartit entre les billes, le tout est alors scellé et
on lance la machine, qui fait ...
Liquide CavitationDes ultrasons
Sonication
 Des aires de compression et raréfaction apparaissent,
et les cavités s’effond...
Méthodes chimiques
Extraction chimique
 Consiste à mélanger le produit en solution aqueuse
avec un petit volume de solvan...
Enzymes lytiques
 Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir
compte de la paroi cellulaire qui protège l...
Extraction liquide-liquide
Extraire un ou
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constituants
Solvant initial
Solvant
d’extraction
 Pour lequel le ou ...
Extraction liquide-solide
Se déroule en deux étapes
Consiste en un
passage d’un soluté
du milieu liquide au
milieu solide
...
Définition :
Est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes
les impuretés d’un extrait brut contenant l’enzyme
d’int...
Méthodes de purification
Méthodes basées sur les
différences de solubilité
Méthodes basées sur la taille
des molécules
Mét...
Méthodes basées sur les différences de solubilité
Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium
C’est une technique d...
 Les ions sulfates et ammonium sont petits et neutralisent
efficacement les charges des protéines. Cette méthode devra
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Méthodes basées sur la taille des molécules
Dialyse
Permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective...
 Il est placé dans un récipient contenant le liquide contre
lequel s’effectue la dialyse ou liquide de contre-dialyse.
Centrifugation
Différences
de densité
Un solvant Force de
gravité
 En effet, si la particule à une densité plus élevée qu...
Filtration membranaire
 Consiste à séparer les particules solides qui se trouvent en
suspension dans un liquide par une m...
Méthodes basées sur les propriétés ioniques
chromatographie
 Est une méthode relativement simple de séparation du
composé...
Types de chromatographie
Chromatographie par adsorption
La phase
solide
La phase
mobile
constituée d’une résine
adsorbante...
Chromatographie par échange d’ions
 Résines échangeuses d’anions (charges +) séparer les composés
chargés négativement.
...
Chromatographie de partage
fonctionne par partage de
solutés entre deux phases
non miscibles
Stationnaire
Mobile
 Plus la...
Chromatographie d’exclusion
Phase stationnaire
(gel ou un réseau
macromoléculaire)
Exerçant un véritable
effet de tamis vi...
Chromatographie d’affinité
On utilise ici un système biologique, un ligand ayant
la propriété de fixé spécifiquement une m...
L’électrophorèse
 Le principe de l’électrophorèse repose sur le
mouvement d’un ion à charge dans un champ
électrique.
 S...
Ce sont les caractéristiques intrinsèques de l’enzyme cible, qui permettront
de la séparer de ses congénères cellulaires.
...
 Tous ces critères peuvent être utilisés dans le choix de la
stratégie de purification.
 Une bonne stratégie d’obtention...
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  • Nous avons l’honneur de vous présenter notre travail de mircoprojet intitulé sur le thème de
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    1. 1. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Constantine 1 Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des Technologies Agro-Alimentaires (INATAA) Microprojet Thème: Méthodes d’extraction et de purification des enzymes Présenté par :  CHEBIRA Hadjar  MOUSSAOUI Rahima Année universitaire 2014-2015 5e Année ingénieur
    2. 2. Plan de travail Introduction Généralité sur les enzymes Méthodes d’extraction Méthodes de purification conclusion
    3. 3. 1878 par Willy Kuhne Vient du grec « en zume » et signifie « dans la levure » L’industrie agro- alimentaire Gluco- amylase Extraction et purification Enzyme Objectif: passer en revue les différentes méthodes d’extraction et de purification des enzymes industrielles. Améliorer les qualité de l’aliment Une meilleur conservation Augmenter le rendement et la pureté Glucose produit à partir de l’amidon
    4. 4. enzyme définition propriétés Protéine présentant des propriétés de catalyse spécifiques d’une réaction chimique du métabolisme de l’être vivant qui la produit
    5. 5. Biocatalyseurs de nature protéique qui accélèrent une réaction biochimique et se retrouvent intact en fin de réaction et peuvent être réutilisées Les enzymes sont spécifiques, chaque enzyme possède un site actif décomposer en site catalytique et site pour le substrat Les enzymes sont sensibles à la température et au PH De nombreuses enzymes ont besoin de cofacteurs pour fonctionner (NAD)
    6. 6. enzyme Classification et nomenclature 1 • Oxydoréductases 2 3 4 5 6 • Transférases • Hydrolases • Isomérases • Lyases • Ligases Selon l’enzyme commission une nomenclature des enzymes basée sur quatre nombres précédés de EC : EC .1. 2. 3. 4
    7. 7. enzyme Source Industrie  Les enzymes jouent plusieurs rôles dans les productions alimentaires industrielles. enzymes source Action Usage Lipases Pénicillium roqueforti, hydrolyse les lipides en acides gras et glycérides Produire davantage de composés d'arômes dans les fromages et autres produits laitiers Amylases Aspergillus oryzae (moisissure) Bacillus subtilis (bactérie) hydrolyse de l'amidon en sucres solubles Améliorer la fermentation (pain, bière) Clarifier les jus de fruits et de légumes, etc. Invertase Saccharomyces cerevisiœ hydrolyse le saccharose en glucose et fructose Réduire la cristallisation dans les sirops et Produire du sucre inverti
    8. 8. Définition :  l’extraction désigne l’action de séparer une enzyme du composé dont elle fait partie. Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou de la membrane cellulaire par des procédés mécanique, physique ou chimique.  Pour l’isolement d’une enzyme, il est toujours préférable de choisir une source enrichie en cette enzyme particulière. physique chimiqueMécanique Méthodes d’extraction:
    9. 9. Choc osmotique Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la membrane plasmique.
    10. 10. Méthodes mécaniques Congélation-décongélation Refroidissement brusque La concentration du soluté intra et extracellulaire Formation des cristaux intra et extracellulair e Cassures dans la cellule
    11. 11. Broyage ou agitation avec des abrasifs Agitation violente Microbilles de verre désintègre les microorganismes avec rupture de la paroi
    12. 12. Bombe à disruption  La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides.  On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater. Chambre pressurisée Cellules Azote à haute pression
    13. 13. Homogénéisateur d'Elvejm de potier Equipement simple Pilon sous forme de tige de verre Des dents sur son bout  La manipulation du pilon se fait manuellement ou par dispositif mécanique.
    14. 14. Les billes de verre La suspension se répartit entre les billes, le tout est alors scellé et on lance la machine, qui fait furieusement tourbillonner les billes de verre dont l’action abrasive fait de dégrader les cellules.
    15. 15. Liquide CavitationDes ultrasons Sonication  Des aires de compression et raréfaction apparaissent, et les cavités s’effondrent rapidement.  Les bulles produites dans les cavités sont compressées à plusieurs centaines d’atmosphère.  Ces chocs constituent les éléments de destruction des tissus cellulaires.
    16. 16. Méthodes chimiques Extraction chimique  Consiste à mélanger le produit en solution aqueuse avec un petit volume de solvant organique dans lequel il est très soluble.  On agite ensuite vigoureusement le mélange pour permettre au produit de se déplacer de la phase aqueuse vers la phase organique, puis on récupère celle-ci.
    17. 17. Enzymes lytiques  Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la paroi cellulaire qui protège la membrane plasmique.  Pour ceci les enzymes lytiques comme les cellulases, Pectinases, etc., peuvent être employées pour rompre les parois de ces cellules.
    18. 18. Extraction liquide-liquide Extraire un ou plusieurs constituants Solvant initial Solvant d’extraction  Pour lequel le ou les constituants à isoler ont une grande affinité par rapport au liquide initial.  Les deux solvants A et B sont non miscibles.
    19. 19. Extraction liquide-solide Se déroule en deux étapes Consiste en un passage d’un soluté du milieu liquide au milieu solide Consiste en une élution du soluté d’intérêt, par un solvant approprié, permettant de rompre les interactions soluté- matrice de la phase solide
    20. 20. Définition : Est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes les impuretés d’un extrait brut contenant l’enzyme d’intérêt. Elle a comme objectifs essentiels d’avoir:  un maximum du rendement de l’enzyme;  un maximum de pureté possible;  un maximum de son activité catalytique.
    21. 21. Méthodes de purification Méthodes basées sur les différences de solubilité Méthodes basées sur la taille des molécules Méthodes basées sur les propriétés ioniques
    22. 22. Méthodes basées sur les différences de solubilité Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium C’est une technique douce (préserve en générale la structure, et donc la fonction des enzymes.) solution protéique sulfate d’ammonium déshydratation et précipitation des protéines, induisant ainsi le phénomène de relargage.
    23. 23.  Les ions sulfates et ammonium sont petits et neutralisent efficacement les charges des protéines. Cette méthode devra être suivie d’un lavage pour éliminer le sel résiduel.
    24. 24. Méthodes basées sur la taille des molécules Dialyse Permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane de dialyse. cylindres allongés fermer aux deux extrémités contiennent le liquide à dialyser « boudin » de dialyse
    25. 25.  Il est placé dans un récipient contenant le liquide contre lequel s’effectue la dialyse ou liquide de contre-dialyse.
    26. 26. Centrifugation Différences de densité Un solvant Force de gravité  En effet, si la particule à une densité plus élevée que le fluide en lequel elle est immergée, elle tend à émigrer en bas, suivant la direction de force de pesanteur.
    27. 27. Filtration membranaire  Consiste à séparer les particules solides qui se trouvent en suspension dans un liquide par une membrane, tout en limitant son colmatage pour obtenir un fonctionnement stable.  On distingue de type de procédés:  filtration tangentielle  filtration frontale
    28. 28. Méthodes basées sur les propriétés ioniques chromatographie  Est une méthode relativement simple de séparation du composé désiré de ses impuretés basée sur les différentes affinités d’un composé à l’égard de deux phases.  L’une, dite stationnaire est emprisonné dans une colonne ou fixé sur un support et l’autre, dite mobile se déplace au contact de la première.
    29. 29. Types de chromatographie Chromatographie par adsorption La phase solide La phase mobile constituée d’une résine adsorbante qui fixe certains composé en solution par l’entremise de liaisons de Van der Waals lorsqu’on charge la colonne modifie ensuite les propriétés de la résine, ce qui force la désorption des composés qui y étaient adsorbés et permet leur séparation
    30. 30. Chromatographie par échange d’ions  Résines échangeuses d’anions (charges +) séparer les composés chargés négativement.  Résines échangeuses de cations (charges -) séparer les molécules chargés positivement.
    31. 31. Chromatographie de partage fonctionne par partage de solutés entre deux phases non miscibles Stationnaire Mobile  Plus la répartition des composés d’un mélange dans la phase stationnaire est grande plus leur rétention est grande et inversement.
    32. 32. Chromatographie d’exclusion Phase stationnaire (gel ou un réseau macromoléculaire) Exerçant un véritable effet de tamis vis-à-vis de grosses molécules  Les grosse molécules migrants plus vite que les molécules de plus faible poids moléculaire qui elles peuvent diffuser librement dans la phase stationnaire alors que les premières ne le peuvent pas.
    33. 33. Chromatographie d’affinité On utilise ici un système biologique, un ligand ayant la propriété de fixé spécifiquement une molécule est lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi, au moment du chargement de la colonne les composés qui ont une affinité pour le ligand sont fixés alors que les impuretés sont éliminées.
    34. 34. L’électrophorèse  Le principe de l’électrophorèse repose sur le mouvement d’un ion à charge dans un champ électrique.  Si on dépose une espèce anionique, elle migrera vers l’anode (+) et une espèce cationique migrera vers la cathode (-).
    35. 35. Ce sont les caractéristiques intrinsèques de l’enzyme cible, qui permettront de la séparer de ses congénères cellulaires. Protéine Des structures Densité charge Masse forme retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une organelle donnée certain degré d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité*
    36. 36.  Tous ces critères peuvent être utilisés dans le choix de la stratégie de purification.  Une bonne stratégie d’obtention d’une enzyme dans les meilleures conditions possibles comportera donc le bon choix du matériel biologique de départ, le choix des techniques d’extraction les plus adaptées à ce dernier et les techniques de séparation et de purification adéquates aux propriétés physico-chimiques de l’enzyme.
    37. 37. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Constantine 1 Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des Technologies Agro-Alimentaires (INATAA) Microprojet Thème: Méthodes d’extraction et de purification des enzymes Présenté par :  CHEBIRA Hadjar  MOUSSAOUI Rahima Année universitaire 2014-2015 5e Année ingénieur

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