Perturbateurs Endocriniens Colloque 2020 ARET- EHESP Webinaire - Conf Yvon Gervaise

Yvon Gervaise
S.E.C.F
Animateur GT SECF #LaboratoireduFutur
http://www.expertscience.fr
LES TESTS EN RECHERCHE ET DEVELOPPEMENT INDUSTRIEL
DIVERSITE DES APPLICATIONS …
PANORAMA DES METHODES QUANTITATIVES DOSAGE DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS
COLLOQUE 2020
LES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS:
BILAN D’UNE GÉNÉRATION DE RECHERCHE ET
PERSPECTIVES”.

ANALYSES des Perturbateurs Endocriniens …
lesTESTS à l’aune du LABORATOIRE DU
FUTUR :
▪ Convergence – robotisation technique de
préparation extraction/purification. ex. pesticides
▪ Système intelligent
• Type @ResiduManager
▪ Instrumentation nouvelle génération
• Technique de couplage GC/MS/MS, HPLC/MS/MS,
MS/Q-TOF
@Yvon GERVAISE Colloque ARET - EHESP Webinaire 21 &22 Octobre 2020

PE : DES TESTS ,pour quelles Molécules ?
Et QUELS APLLICATIONS ? (Industrie , R&D
Environnement , consommation, )
Exemples de familles de molécules à effet perturbateur endocrinien et leurs sources
potentielles
Famille chimique Sources potentielles Exemples
Phtalates Plastiques, cosmétiques Dibutyl phtalate
Alkylphénols Détergents, plastiques, pesticides Nonylphenol
Hydrocarbures aromatiques
polycycliques
Sources de combustion: fumée de
cigarette, émission des moteurs diesels,
incendies
Benzo(a)pyrène
Polychlorobiphényls Transformateurs électriques
PCB, Arochlor
Anciens pesticides
Résiduels de stockage, pollution
rémanente
DDT, Dieldrine, Chlordane
Autres pesticides
Agriculture, nettoyages urbains, jardins
particuliers
Atrazine, Ethylène thiourée,
Heptachlor, Lindane, Malathion
Retardateurs de flamme
Mousses pour les mobiliers, tapis,
équipements électroniques
Polybromodiphényles (PBDE)
Dérivés phénoliques Désinfectants, plastiques, cosmétiques
Bisphénols A, Parabens, Halogéno-
phénols

ÉVOLUTION des PERFORMANCES ANALYTIQUES ..
En RÉPONSE à L’ EXIGENCE TESTS des P.E.
▪ L’évolution instrumentale(MS/MS …
▪ Evolution des processus de traitement échantillons
➢ Technique de préparation utilisation @ResiduManager,
• ROBOT TAYLOR viking processus extraction, purification automatisés
▪ L’évolution des performances analytique
➢ Les limites de quantification : atteinte du PPT
➢ Développement des méthodes multiparamétriques

◼ Méthode QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)
➢ Avantage : une seule préparation pour plusieurs matrices (céréales, fruits, légumes…).
Extraction solide-liquide
Echantillon
+ solvant organique + sels tampons
Agitation
Centrifugation et récupération du
surnageant
Purification SPE dispersive
Mise en contact du surnageant avec
les sels de purification
Agitation Centrifugation et
récupération du
surnageant purifié
DOSAGE DES RESIDUS PESTICIDES P.E. : LA METHODE
MULTIPARAMETRIQUE :

TEST en Agroalimentaire Residus Pesticides PE:
ÉVOLUTION DES MÉTHODES DE PRÉPARATION
AUTOMATISATION QuEChERS ROBOT DE PRÉPARATION
◼ Optimisation du process de préparation des
échantillons
◼ Méthodes de préparation QuEChERS :
• AOAC 2007.01 (Pesticide residues in Food
by Acetonitrile Extraction and Partitioning with
Magnesium Sulfate)
• EN 15662.2008 (Foods of Plant Origin-
determination of Pesticide residues Using GC-
MS and/or LC –MS/MS following Acetonitrile
Extraction/Partitioning and Clean up by
Dispersive SPE-QuEChERS Method)

GC/MS-MS
Source Electronic Impact
Triple QuadripoleGC/ECD
GC/FPD
GC/TSD
Une seule injection pour plus de 150
molécules en 30 minutes
Plusieurs injections par famille de
dizaine de pesticides OC, OP, PYR, PCB…
DETECTIONS
SPECIFIQUES
DETECTION par
SPECTOMETRIE de MASSE MS-MS
TEST DES PESTICIDES PE : GENESE INSTRUMENTALE
INNOVATION CRÉATION DES MÉTHODES MULTIPARAMÉTRIQUES

Analyse de 200 pesticides dans les
céréales
ANALYSE MULTIPARAMÉTRIQUE Screening pesticides
LC-MS/MS

MULTIPARAMÉTRIQUE MYCOTOXINES (HPLC/MS/MS)
8 injections
HPLC/UV ou
Fluo
• Aflatoxines B1, B2, G1, G2
• Ochratoxine A
• Déoxynivalenol (DON)
• Zéaralénone
• Fumonisines B1 et B2
• T2-toxine et
Diacetoxyscirpenol* (DAS)
• HT2-toxine
1 extraction solide/liquide
suivi d’une dilution
8 extractions solides/liquides
+
7 purifications par immunoaffinité
et 1 purification SPE
1 injection HPLC/MS/MS
• Gain de temps
• Gain de productivité
• Simplification

Polyphénols
Acides phénoliques Flavonoïdes Tanins Stilbènes Lignanes Saponines Phytostérols/ Phytostanols
Dérivés acide benzoïque Polymères de Resvératrol Matairésinol Glycosides Campestérol
Ex: acide gallique flavonoïdes triterpéniques Stigmastérol
Dérivés acide cinnamique
Ex: acide caféique
Flavones Flavonols Isoflavones Dihydroflavonols Flavanones Anthocyanidines Flavanols
Apigénine Kaempferol Génistéine Dihydroquercétine Naringénine Cyanidine Catéchine
Chrysine Myricétine Daidzéine Hespérétine Péonidine Epicatéchine
Lutoléine Quercétine Génistine Taxifoline
Daidzine
O
OOH
OH
Chrysine
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
Quercétine
O
OOH
OH
OH
Génistéine
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Catéchine
OOH
OH
OH
OH
OH
+
Cyanidine
O
OOH
OH
OH
Naringénine
O
O
OH
OH
OH
OH
Dihydroquercétine
OH
OHOH
COOH
Acide gallique
OH
OH
OH
Trans- resveratrol
O
OH
CH3CO
OH
O
OMe
Matairésinol
OH
Campestérol
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
OH
Tanin condensé
O
CH2
OH
CH2OAc
O
COOH
OH
OH
O
O
OH
OHCH2OH
O H
Saponine de soja

EXEMPLE 1 DE PROTOCOLE D’EXTRACTION ET DE
QUANTIFICATION DES ISOFLAVONES (TECHNIQUE DE WANG ET MURPHY)
Échantillon
(à l’abri de la lumière directe)
Peser m = 200 mg
Acétonitrile 10 ml
+ HCI 0,1 M (2 ml)
+ H20 (5 ml)
Extraction durant 2 heures par agitation
Filtration
Evaporation du filtrat
au rotavapor
Reprise du résidu sec dans
10 ml méthane 80 %
Filtration sur membrane de
0,45 µm
Injection en HPLC de 10
µl
détection à 260 nm
Eluant  : eau à 0,1 %
d’acide acétique
Eluant  : acétonitrile
à 0,1 % d’acide acétique
Quantification
des
isoflavones
grâce à la
gamme
d’étalonnage

daidzéine
génistéine
daidzine
génistine
Isoflavones

MONOMERE DE POLYCONDENSATION
(industrie des polymères)
LES DÉRIVÉS DU BISPHÉNOL A
BADGE : Bisphénol A diglycil éther BAFGE : Bisphénol F diglycil éther
QU’EST-CE QUE LE BISPHÉNOL A?
POLYCARBONATE RÉSINES EPOXY

POURQUOI L’EXIGENCE DE QUANTIFICATION
DU BISPHÉNOL EN HPLC/MS/MS ?
▪ Quelques rappels :
• Bisphénol
• Migration selon la norme NF EN 14350 -2 : analyse en HPLC/Fluo
• Analyse d’un simulant aqueux : H2O ou H2O à 3% CH3COOH
▪ Pourquoi la technique HPLC/MS/MS ?
• Exigence de spécificité pour les matrices plus complexes
• Application pour les matrices alimentaires et les matières
plastiques

Energy
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Minutes
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00
BISPHENOLA
BADGE.H2O.HCl
BADGE.HCl
BFDGE
BFDGE.2HCl
BFDGE.2H2O
BADGE.H2O
BADGE
NODGE(mélange3,4,5et6cycles)
BADGE.2H2O
DOSAGE DU BPA ET DE SES DÉRIVÉS PAR
HPLC/FLUORIMÉTRIE
◼ Textes de référence:
• NF EN 14350-2 (Décembre 2004) : « Articles de puériculture – Articles pour
l’alimentation liquide »
• NF EN 155136 (Avril 2006) : « Matériaux et objets en contact avec les denrées
alimentaires – Dérivés époxy soumis à des limitations – Détermination du BADGE,
du BFDGE et de leurs dérivés hydroxylés et chlorés dans les simulants
d’aliments »
◼ Conditions chromatographiques
• Colonne : Silice greffée C18
◼ Phase mobile : eau/acétonitrile en mode gradient
• Détection : λex=275 nm, λem=305 nm

POURQUOI L’EXIGENCE DE QUANTIFICATION
DU BISPHÉNOL EN HPLC/MS/MS ?
◼ Conditions chromatographiques :
• Colonne C18
• Mode gradient H20/CH3CN
◼ Système de détection MS/MS
• Mode d’ionisation : électrospray négatif
• Analyseur : triple quadripôle
Transition de quantification : 226,9 > 211,8
Transition de confirmation : 226,9 >132,8
Transition de l’étalon interne : 240,9 > 222,9
LQ = 10 µg/kg

MODE OPÉRATOIRE POUR LES MATRICES
ALIMENTAIRES
• Pesée de l’échantillon et ajout de l’étalon interne deutéré
• Extraction dans de l’acétonitrile aux ultrasons
• Ajout d’eau et ajustement du pH à 3
• Ajout de dichlorométhane et agitation
• Récupération de la phase organique
• Évaporation à sec et reconcentration à l’acétonitrile
• Injection de 20 µl en LC/MS/MS

CHROMATOGRAMMES D’UN ÉCHANTILLON DE
TOMATE PELÉE DOPÉ ET NON DOPÉ( DOSAGE
BISPHENOL)

P.E. : composés PERFLUORES : PFOA / PFOS ET
ISOMÈRES
▪ PFOS: PerFluoroOctanSulfonique acide CAS: 1763-23-1
▪ PFOA: PerFluoroOctanoique Acide CAS: 335-67-1
▪ PFHxS: Perfluorohexane sulfonate
▪ PFDS: Perfluorodécane sulfonate
▪ PFOSA: Perfluorooctane sulfonamide
▪ N-Me PFOSA: N-méthyle perfluorooctane sulfonamide
▪ N-Ét PFOSA: N-éthyle perfluorooctane sulfonamide

DERIVES PERFLUORES P.E. CONTEXTE
NORMATIF ET RÈGLEMENTAIRE
▪ PFOS règlementé suivant directive 2006/122/CE
• Substance ou composante de préparation : < 0,005 % (m/m)
• Entrant dans la composition d’un produit ou article semi fini ou
dans une partie d’un article < 0,1 % (m/m)
• Textile < 1 µg/dm²
• Interdit dans les mousses incendies à partir de 2011
▪ Normes
• ISO 25101-2009 : Qualité de l’eau. Dosage par extraction SPE,
quantification en HPLC/MS/MS

TEST DÉVELOPPÉE AU LABORATOIRE et EN
INDUSTRIE PFOA/PFOS (Perflurés )
▪ Extraction de l’échantillon suivant la matrice
• Ajout d’un étalon interne de préparation à l’échantillon
• EI : PFOA C13 et PFOS C13l’efficacité de l’extraction
• EI permet de surveiller efficacité extraction
• Eau : Solid Phase Extraction (SPE)
• Textile : Extraction aux Ultrasons par CH2Cl2
• Revêtement teflon pour poêle : Grattage puis extraction aux
Ultrasons par Acétonitrile

MÉTHODE DÉVELOPPÉE AU LABORATOIRE
▪ Conditions du spectromètre de masse :
• Transition PFOA :
• 1ère transition Quantification : ion Parent
• m/z: 412,8 ➔ 368,9
• 2ème transition Confirmation : ion Fils
• m/z: 412,8 ➔ 168,9
• Transition PFOS :
• 1ère transition Quantification : ion Parent
• m/z: 498,9 ➔ 80
• 2ème transition Confirmation : ion Fils
• m/z: 412,8 ➔ 99

EXEMPLE DE CHROMATOGRAMME ÉCHANTILLON
▪ Chromatogramme d’échantillon de textile à base de TEFLON

Analyse des alkylphénols et de leurs
éthoxylates
▪ Alkylphénols et éthoxylates :
• Utilisés comme tensioactifs
Nonylphénol Nonylphénol
éthoxylate
▪ Composés d’intérêt réglementés directive RSDE :
• Nonylphénol (NP), octylphénol (OP), nonylphénol
monoéthoxylate (NP1EO), nonylphénol diéthoxylate
(NP2EO), octylphénol monoéthoxylate (OP1EO) et
octylphénol diéthoxylate (OP2EO).
▪ Extraction en phase solide, dérivation et analyse
en GC/MS, selon la norme ISO/DIS 18857-2.
▪ Limite de quantification : 0,1 µg/L d’eau.

Analyse des PBDE
▪ PBDE (PolyBromoDiphénylEthers) :
• Retardateurs de flamme
• Structure analogue aux PCB
▪ Analyse dans les eaux si MES > 50 mg/L
▪ Analyse des composés réglementés dans la directive RSDE :
• BDE 47, 99, 100, 153, 154, 183, 209
▪ Extraction à l’ASE du filtre MES selon la méthode Aquaref MA-7
▪ Limites de quantifications :
• 0,05 µg/L d’eau pour chaque BDE
PBDE PCB

Revue des méthodes d’analyse : cas des contaminants
« émergents » perturbateurs endocriniens
Composés d’intérêt Méthodes d’analyses
Contaminants émergents Technique de spectrométrie de masse et couplage
GC / MS / MS et HPLC / MS / MS
Alkylphénols LC / MS et GC / MS, matrice environnementale
eau, sédiment, boue, préparation des échantillons
Résidus pharmaceutiques Analyse suivant composés
Méthode séparative HPLC, détection spécifique et
LC / MS / MS
Stéroïdes et hormones Extraction + dérivation puis GC / MS
Plastifiants phtalates, bisphénol A LC / MS et GC / MS
Musks Analyse musk polycyclic, tonalide (AHTN), musk
xylène, musk cétone
BFR, retardateur de flamme Méthode GC / MS et LC / MS possible

Dosage simultané de 7 molécules de la liste candidate 15
substances REACH en GC/MS (musk xylene,phtalates, HPA)

Spectre de
Masse
du musk xylène

Dosage par GC/MS du TBT (Tributyl Etain) et
TBTO ORGANOSTANNEUX P.E.

EXEMPLE ILLUSTRE Evolution DU DOSAGE d’un
PESTICIDE P.E.: L’ATRAZINE
▪ Triazines :
• Atrazine, terbutryne, terbutylazine,
secbumeton, desmetryn …
• Leurs métabolites : Desisopropylatrazine,
Desethylatrazine, Desethylterbutylazine
▪ Hier : analyse en GC/TSD
▪ Existence de la norme NF EN 11264 en HPLC/UV qui
devra évoluer … :
 Aujourd’hui, analyse en LC/MS/MS
Atrazin
e
Desmetry
ne
Terbutylazi
ne
Secbumet
on
Desethylatraz
ine
Desisopropylatraz
ine

CONCLUSION
> Le développement des méthodes
quantitatives de dosage des P.E. amène
aujourd’hui à une meilleure connaissance
et surveillance de l’exposome chimique .
> Les P.E composés ubiquitaires
constituent un défi pour l’analyste
:complexité analytes /matrices et ultra-
traces à quantifier.
> Tests des P.E. un vaste champ
d’application
CONTACT: Yvon GERVAISE 0660679150
http://www.expertscience.fr

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