VDRL - TPHA

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Sérodiagnostic de la syphilis

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VDRL - TPHA

  1. 1. Abdsalah Sérodiagnostic de la Syphilis VDRL-TPHA Par : S / Abdessemed
  2. 2. Abdsalah INTRODUCTION • Le diagnostic sérologique repose sur la mise en évidence des anticorps induits par l’infection et retrouvés dans le sérum. • Le sérum est traité pour retirer certaines substances qui peuvent gêner la technique ce qui aboutit à une certaine dilution • Le patient doit être de préférence à jeun
  3. 3. Abdsalah Les réactions sérologiques Réaction à antigène non tréponémique (Ag cardiolipidique) Réaction à antigène tréponémique
  4. 4. Abdsalah : VDRL( veneral disease research laboratory) Principe: Réaction d’agglutination passive sur lame en verre. Antigène utilisé est d’origine cardiolipidique constitué de microcristaux de cholestérol sur lesquels sont adsorbés les molécules de cardiolipide = Haptène de Wasserman. Des particules de charbon sont piégés dans la combinaison Ac-Ag pour faciliter la lecture.
  5. 5. Abdsalah Matériel et réactifs Sérum frais.  Eau physiologique.  Antigène VDRL près à l’emploi.  Matériel: Centrifugeuse Micropipettes réglables ( 5-50µL) Plaques en verre Portoir pour tubes à hémolyse Agitateur rotatif de Kline Container de déchets contaminés Eau de Javel
  6. 6. Abdsalah Mode opératoire: Réaction qualitative Réaction quantitative ( dépistage) (dépistage positif) Deux types de réactions
  7. 7. Abdsalah Réaction qualitative Distribuer 50µL de sérum sur chaque puit de la plaque en verre.  Ajouter 16µL d’Antigène VDRL.  Placer la plaque sur l’agitateur de Kline pendant 8mn.  Lire immédiatement au microscope.
  8. 8. Abdsalah Puits Témoin + Témoin - Témoin Ag VDRL Sérum inconnu Sérum 50 µl de S + 50 µl de S - 50µL d’eau physiologique 50 µl de sérum inconnu. Antigène VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl Placer sur un plateau rotatif (agitateur de kline) pendant 8 minutes. Lecture + - -
  9. 9. Abdsalah Pas d‘agglutination Agglutination : + Lecture
  10. 10. Abdsalah Lecture Agglutination : +++ Agglutination : ++
  11. 11. Abdsalah Réaction quantitative Lorsque la réaction qualitative est positive on réalise la même réaction avec une série de dilution du sérum au (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,1/32…) avec de l’eau physiologique.  Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction positive nette.
  12. 12. Abdsalah Puits 1 2 3 4 5 Eau physiologique 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl Dilution 1 / 2 1 / 4 1 / 8 1 / 16 1 / 32 Sérum à analyser En µl 50 reporter reporter 50 reporter 50 reporter 50 jeter 50µl dans l’eau de Javel Ag VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl 16µl agitation pendant 8 minutes. Lecture
  13. 13. Abdsalah TPHA: ( Treponema pallidum hemagglutination assay) Principe:  Réaction d’hemmagglutination passive réalisée sur des microplaques.  L’Antigène utilisé est un lysat de tréponema pallidum adsorbé sur des hématies.  Le dépistage consiste à tester le sérum à la dilution de 1/80.  Des dilutions sont effectuées pour le titre dans le cas du dépistage positif.
  14. 14. Abdsalah Matériel et réactifs Sérum frais Coffret de réactif pour TPHA: o Hématies tests o Hématies contrôles o Diluant o Témoin positif o Témoin négatif
  15. 15. Abdsalah o Centrifugeuse o Micropipette réglable (5 -50 µL),( 50 – 200 µL) o Pipette multicanaux o Plaque de microtitration à fond en U o Portoir pour tubes à hémolyse o Container de déchets contaminés
  16. 16. Abdsalah Mode opératoire: Deux types de réactions Réaction qualitative Réaction quantitative ( dépistage) (dépistage positif)
  17. 17. Abdsalah Technique qualitative • 1. chaque échantillon va utiliser 3 puits de la plaque. • 2. Déposer 190µl de diluant et 10 µl de sérum dans le puit 1. • 3. Avec une pipette, mixer le contenu du puit 1 et en transférer 25µl aux puits 2 et 3. • 4. Homogénéiser complètement le réactif TPHA et le contrôle TPHA. Ajouter 75 µl de contrôle TPHA au puit 2 et 75 µl de réactif TPHA au puit 3.
  18. 18. Abdsalah • 5-Agiter doucement la plaque jusqu’ à obtenir un mélange homogène de manière à être sur d’éviter une contamination croisée. • 6. incuber la plaque pendant 45 à 60 minutes à 18-25°C. Pendant l’incubation, garder la µplaque bien à l’abri de sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations. • 7. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci- dessus respectées.
  19. 19. Abdsalah Cupule A B C Diluant en µl 190 Sérum en µl 10 25 * 25 * HS en µl 75 HNS en µl 75 Lecture + + +
  20. 20. Abdsalah Puit 1 : voile uniforme couvrant tout le puit → Fortement positif. Puit 2 : voile couvrant le 2/3 du puit → Moyennement positif. Puit 3 : voile couvrant le 1/3 du puit → Faiblement positifs. Puit 4 : Anneau très serré à bord nets (absence de voile) → Négatif. Lecture des résultats
  21. 21. Abdsalah Résultats Cupules échantillons Cupules de contrôle Fortement positif Aspect de voile couvrant uniformément le fond de la cupule Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Faiblement positif Aspect de voile couvrant approximativement 1/3 du fond de la cupule Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact indéterminé Aspect de voile montant clairement un anneau central distinct (voile non uniforme) Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Négatif Aspect de bouton compact montrant clairement un petit anneau central clair Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Non spécifique Réaction positive Réaction positive Interprétation des résultats
  22. 22. Abdsalah Technique quantitative • 1. Chaque échantillon va utiliser 8 puits de la plaque labellisés de A à H. • 2. Déposer 25µl de diluant dans les puits de B à H uniquement. • 3. Transférer 25µl de sérum dilué au 1/20 dans les puits A et B uniquement. • 4. Prendre 25 µl du sérum dilué du puit B et effectuer des doubles dilutions du sérum des puits B et H inclus et éliminer les 25 µl de sérum du puit H.
  23. 23. Abdsalah • Ajouter 75µl de réactif TPHA au puit A à H inclus. • 6. Agiter doucement la plaque jusqu’à obtenir un mélange homogène. • 7. Incuber la plaque pendant 45 à60 minutes à 18-25°C. pendant l’incubation, garder la plaque bien à l’abri des sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations. • 8. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci- dessus respectées.
  24. 24. Abdsalah Cupule A B C D E F G H Diluant en µl 25 25 25 25 25 25 25 Sérum 1/20 en µ l 25 25 * 25* 25* 25* 25* 25* 25** HS en µl 75 75 75 75 75 75 75 75 Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240 Lecture + + + + + - - - Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ). * : reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche. **: jeter 25 µl dans l'eau de javel. 25
  25. 25. Abdsalah Absorption non spécifique • 1. Déposer 100µl de l’échantillon dans un petit tube et ajouter 400µl de contrôle TPHA. • 2. Bien mélanger le tube • 3. Centrifuger le tube 15 minutes à 1000 rpm et tester le surnageant par la méthode qualitative.
  26. 26. Abdsalah • 4. Remarque : l’échantillon est maintenant à 1/5 ; ceci doit être pris en compte lors de la préparation des dilutions. • 5. Si le résultat est de nouveau non spécifique, l’échantillon doit être testé par une autre technique telle que le FTA-ABS.
  27. 27. Abdsalah

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