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Virginie Rougeron - Sexuality and clonality in Leishmania
- 1. "Everything you always wanted to know about sex (but were afraid to ask)" in Leishmania after two decades of laboratory and field analyses. Rougeron V., De Meeûs T., Kako Ouraga S., Hide M., Bañuls A-L. Laboratoire d’accueil Institut de Recherche pour le Développement Génétique et Evolution des Maladies Infectieuses (UMR CNRS/IRD 2724)
- 2. Contexte des maladies infectieuses et parasitaires - 2 ème cause de mortalité dans le monde - OMS : ¼ des décès dus aux maladies infectieuses et parasitaires
- 6. Chez le vertébré Chez le phlébotome Repas sanguin Promastigote de multiplication Amastigotes dans un macrophage Promastigote métacyclique : forme indivisible Un cycle biologique complexe (Schéma du cycle biologique des Leishmania , modifié d’après http://dpd.cdc.gov/dpdx)
- 7. Chez le vertébré Chez le phlébotome Repas sanguin Promastigote de multiplication Amastigotes dans un macrophage Promastigote métacyclique : forme indivisible Formes cliniques majeures Leishmaniose cutanée Leishmaniose mucocutanée Leishmaniose viscérale PKDL Post-Kala-Azar Dermal Leishmaniasis
- 8. Outils moléculaires peu adaptés Soit pas assez résolutifs (MLEE, RFLP), soit dominants (RAPD), soit multifactoriels (PFGE). Echantillons mal adaptés Petite taille, répartitions géographique et temporelle larges Déséquilibre de liaison Estimation précise de la proportion de reproduction sexuée ou de clonalité mal aisée (De Meeûs et Balloux 2004) Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité Deux hypothèses s’opposent : - Majoritairement clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels. - Reproduction sexuée, de type automictique (fusion de gamètes descendants d’un même germe cellulaire). (Tibayrenc et al., 1990) (Bastien et al., 1992) MAIS…
- 9. Théoriquement, dans un modèle clonal strict Accumulation indépendante de mutations Production d’excès en hétérozygotes Modèle clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels. Postulat : les descendants sont génétiquement identiques à leurs parents Faibles taux de locus hétérozygotes et une structure génétique non strictement subdivisée en lignées individualisées. Résultats en contradiction Cependant… (Balloux et al. 2003; De Meeûs et al. 2006) Théorie clonale : (Tibayrenc et al., 2000) (Judson and Normak, 1996; Welch et al. 2000) (Bañuls A-L., 1998) Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité
- 15. Forts déficits en hétérozygotes - Valeur moyenne F IS = 0,504 - Taux d’autofécondation estimé correspondant : s = 0,67 Graphe n°1 : Déficit en hétérozygotes dans chacune des populations Graphe n°2 : Déficit en hétérozygotes pour chacun des 12 locus étudiés Résultats : (Rougeron et al., PNAS, 2009)
- 16. Effet Wahlund Graphe n°3 : Déficit en hétérozygotes pour chaque population et et après clusterisation des populations (BAPS) - Nombre de clusters : 13 à 15 / population - Forte diminution des F IS au sein des 4 populations étudiées MAIS , les valeurs de F IS restent importantes : F IS = 0,307 Taux d’autofécondation s = 0,47. Déséquilibres de liaison significatifs DL significatifs pour 13 des 66 paires de locus étudiées Résultats : (Rougeron et al., PNAS, 2009)
- 17. Forts F IS = faible hétérozygotie, DL significatifs Effet Wahlund Diminution des valeurs de F IS Sous-structuration géographique Barrières géographiques Biologie des réservoirs mammifères et des vecteurs Présence d’un effet Wahlund, MAIS… Clonal = faible F IS = forte hétérozygotie, DL significatifs (Rougeron et al., PNAS, 2009)
- 21. Confirmation de l’hypothèse d’endogamie Mise en évidence de phénomènes de recombinaison génétique entre individus issus de deux souches différentes de L. major . Résistante à la drogue A Résistante à la drogue B Hybrides résistants aux deux drogues Première étude à mettre en évidence expérimentalement l’existence de reproduction sexuée chez les leishmanies.
- 22. 2/ Valider expérimentalement l’existence d’endogamie 1/ Mener le même type d’étude de génétique des populations sur d’autres espèces de leishmanies Quelles sont les prochaines étapes? Résultats en désaccord avec la théorie clonale pour certaines espèces du genre Leishmania Mode de reproduction mixte Alternance de différents modes de reproduction
- 23. BUTS : Etudier la composition génotypique d’une souche hétérozygote. Suivre au cours du temps l’évolution des génotypes. HYPOTHESE : L’attendu d’un mode de reproduction endogamique est une diminution de l’hétérozygotie au cours du temps. Une souche = une population de génotypes ≠ un seul génotype Jusqu’à présent les études de génétique des populations considéraient une souche comme un seul individu. Etude préliminaire : Kako et al. (Session Poster) Quelles sont les prochaines étapes?
- 24. Quelles sont les prochaines étapes? 3/ Le vecteur = unité de reproduction ? Isoler les parasites Etudes de génétique des populations Développer une technique de biologie moléculaire Exemple : P. falciparum
Notes de l'éditeur
- Les maladies infectieuses et parasitaires sont considérées comme la deuxième cause de mortalité dans le monde. En 2002, l’OMS a estimé qu’1/4 des 57 millions de décès recensés étaient du aux maladies infectieuses et parasitaires.
- L’étude des maladies infectieuses constitue un domaine de recherche complexe, en raison de la diversité de systèmes existants à toutes les échelles. En effet, cette diversité peut s’observer à un niveau global avec des organisations et des dynamiques de systèmes variées. De même à l’échelle d’un foyer de transmission, il peut exister plusieurs systèmes complexes dans lesquels de nombreux paramètres ou facteurs sont impliqués, tels que les réservoirs, les vecteurs dans le cas de maladies vectorielles et les pathogènes circulants. Pour finir il faut ajouter qu’au niveau de l’agent infectieux, il existe aussi une grande diversité en raison des processus variés et variables mis en jeu, influençant la structure des populations et donc indirectement la transmission de la maladie. Et dans le contexte des pathogènes parasites, un des challenge majeur est de déterminer l’épidémiologie de la maladie et de mieux comprendre les cycles de transmission.
- Dans ce contexte, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au système de reproduction de l’agent infectieux. En effet, ce processus biologique est l’élément clef dans le domaine des maladies infectieuses car c’est lui qui conditionne la multiplication et donc la transmission des gènes et donc la propagation de la maladie dans le système. Il a largement été démontré qu’améliorer nos connaissances sur la structure des populations et les stratégies de reproduction des pathogènes permettait d’obtenir des informations clefs aussi bien pour la compréhension des patterns et des cycles de transmission que pour le diagnostique, les enquêtes épidémiologiques ou le développement de vaccins ou de médicaments. Toutefois, las stratégies de reproduction des microorganismes sont difficilement voir non observables d’un point de vue expérimental. En effet, pour la majorité des pathogènes, donc ceux de la famille des Trypanosomatidés, la stratégie de reproduction a principalement était déduite d’analyses de génétique des populations. Ainsi dans cette revue, notre but principal était de détailler, de faire un bilan des progrès dans la connaissance du système de reproduction du modèle leishmania depuis les 20 dernières années.
- Les leishmanies constituent un modèle de recherche captivant. Tout d’abord, comme vous pouvez le voir sur cette carte, ces parasitoses sont largement réparties sur l’ensemble des continents à l’exception de l’antarctique. En 2002, l’OMS a estimé à environ 350 millions le nombre de personnes à risque et à 2.357.000 le nombre de nouveaux cas chaque année. Malgré les progrès et les avancées dans la recherche, des études ont montré la réactivation de nombreux foyers, l’émergence de nouveaux foyers et la sous-estimation de la gravité et de la sévérité de ces parasitoses et de leur impact socio-économique. Par ailleurs, des co-infections leishmanioses/VIH constituent un problème de plus en plus important. Ainsi, les leishmanioses constituent un important problème de santé publique.
- Le cycle de vie des leishmanies est dit digénétique, c’est-à-dire qu’il est composé de 2 stades obligatoires : un stade chez un hôte invertébré, l’insecte vecteur, le phlébotome, et un stade intracellulaire obligatoire chez un hôte vertébré mammifère. La transmission s’effectue lors du repas sanguin d’un phlébotome femelle infecté sur un hôte vertébré sain par l’inoculation des parasite. Le cycle est complété quand lors du repas sanguin, un phlébotome femelle sain ingère des cellules hôtes infectées.
- Chez les hommes, la majorité des infections leishmaniennes aboutissent à des cas asymptomatiques. Toutefois, pour les hôtes moins bien adaptés, ces infections peuvent se déclarer et s’exprimer sous différentes formes plus ou moins graves : leishmaniose cutanée, leishmaniose mucocutanée et la forme la plus sévère, pouvant être mortelle, la LV pouvant être mortelle, et après traitement pouvant apparaitre sous une forme secondaire appelée en PKDL. Pour l’ensemble de ces raisons, les leishmanies constituent un modèle d’étude complexe, aussi bien d’un point de vue écologique, que génétique ou phylogénétique.
- En dépit des nombreuses études menées depuis 1990 et des récentes avancées en biologie moléculaire et cellulaire, on est encore loin de comprendre comment fonctionnent ces organismes en populations naturelles. Plus particulièrement le mode de reproduction des leishmanies est encore un sujet débattu. En effet, depuis les années 1990, 2 hypothèses se sont confrontées : l’une suggérait que les leishmanies suivaient une structure des populations majoritairement clonale associée à des évènements de recombinaison occasionnels; et l’autre proposait l’existence de reproduction sexuée de type automictique qui correspond a la fusion de gamètes descendant d’un même germe cellulaire. Mais les conclusions de ces hypothèses peuvent être discutées. Tout d’abord, les outils moléculaires utilisés présentent certaines limitations. En effet, ce smarqueurs moléculaires soit ne sont pas assez résolutifs, soit sont dominants soit sont multifactoriels. Ce qui ne permet pas d’obtenir des indications sur la distribution de l’information génétique en termes de fréquences alléliques entre et au sein des populations étudiées. D’autre part, les analyses de génétique des populations sur les leishmanies sont souvent basées sur des échantillons mal adaptés en termes de taille, d’aire d’échantillonnage. Ce type d’échantillonnage peut avoir d’importantes conséquences sur l’interprétation de la structure des populations. Pour finir, ces études s’appuient surtout sur le déséquililbre de liaison. Or des simulations ont montré qu’aucun estimateur de DL disponible ne permettait d’estimer de façon précise la proportion de clonalité ou de reproduction sexuée dans une population.
- Toutefois, en raison de manque de preuves évidentes expérimentales ou théorique de recombinaison sexuée, l théorie clonale associée à des évènements de recombinaison occasionnels était admise. Cette théorie était principalement basée sur le postulat que les descendants étaient génétiquement identiques à leurs parents. Or théoriquement, dans un modèle clonal stricte, l’équipe de Birky a démontré que pour des lignées anciennes, les deux allèles d’un même locus d’un même individu devaient être divergents car au cours du temps ils accumulent indépendamment des mutations. Un excès d’hétérozygotes est donc attendu dans un modèle clonal stricte. Cependant, des travaux de la littérature ont révélé des résultats en contradiction avec un modèle clonal stricte. Plus particulièrement, ces étude sont montré de faibles taux de locus hétérozygotes et une structure génétique non strictement divisée en lignées individualisées au niveau intraspécifique.
- Dans ce contexte, nous avons mené une étude de génétique des population qui avait pour hypothèse de base que le leishmanies auraient une structure des populations en désaccord avec la théorie clonale. Plus précisément nous avons mené une étude sur un échantillon composé de 124 souches humaines de leishmania braziliensis, espèce à l’origine des leishmanioses cutanée et mucocutanée en Amérique du Sud. L’échantillon est composé de 4 sous échantillons : 2 du pérou, un de 1993 et un de 1994, et deux de Bolivie, un de 1994 et un de 1998. Ces sites d’étude correspondent à des départements caractérisés par la présence de la forêt amazonienne et donc par une grande diversité en terme de faune et de flore. Au total, les 124 souches humains ont été cultivées, l’adn en a été extraits et tous les échantillons ont ensuite été génotypés sur 12 locus microsatellites.
- Une fois els données génotypiques récupérées, des analyses de génétique des populations ont été effectuées. Nous avons tout d’abord utilisé le logiciel Fstat, qui a pour hypothèse nulle que le mode de reproduction est panmictique c’est-à-dire que le zygote est produit par l’association aléatoire des gamètes, qui nous a permis d’estimer et de tester différents paramètres de génétique des populations, tel que : Le Hs, qui est une estimation non biaisée de la diversité génétique observée dans les sous-échantillons - le FIS qui est une mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous échantillons, reflétant l’écart à la panmixie
- - Le FIS varie de -1 à +1, lorsqu’il est égal à 0 cela correspond à un mode de reproduction panmictique, lorsqu’il est inférieur à 0 on s’approche d’un mode de reproduction clonal et lorsqu’il est supérieur à 0 d’un mode de reproduction autoféondant.
- De ce paramètre peut être extrapolé le taux dit d’autofécondation estimé s par cette formule… Le FST qui est une mesure de la différentiation génétique entre les tous échantillons variant de 0 à +1 et le DL qui correspond à l’association non aléatoire de différents allèles à différents locus.
- Pour l’étude du mode de reproduction et la compréhension de la structuration des populations, il est fondamental de tester si l’existence d’un effet wahlund permet d’expliquer d’éventuels déficits en hétérozygotes. Cet effet se produit lorsque l’échantillon considéré comme une seule et même population est en réalité composé de plusieurs sous populations, ce qui peut conduire à une interprétation biaisée. Pour tester cet effet, nous avons utilisé le logiciel BAPS qui permet d’inférer la structure génétique d’une population et de déterminer l’existence de clusters intra populations sur la base des génotypes multilocus. Une fois l’échantillon clusterisé, nous avons recalculé avec le logiciel Fstat, el FIS afin ensuite de la comparer au FIS de la population initiale non clusterisée. Pour finir le logiciel Easy pop a également été utilisé pour tenter de vérifier si les hypothèses proposées étaient cohérentes.
- Les résultats ont tout d’abord révélé de forts déficits en hétérozygotes au sein de s4 populations étudiées, comme vous pouvez le voir sur ce graphique avec en abscisse les 4 populations et en ordonnées les valeurs de FIS. Ces forts FIS sont également observables pour chacun des 12 locus étudiés comme opn peut le voir sur ce deuxième graphe avec en abscisse les locus et en ordonnées à nouveau les valeurs de FIS. En effet, nous avons obtenu un FIS moyen de 0.504 et un taux d’autofécondation estimé correspondant à une valeur de 0.67. Or théoriquement ce résultat est en contradiction avec un modèle de reproduction clonal strict.
- Pour expliquer ces FIS, nous avons donc tester l’existence d’un effet wahlund. Les résultats ont révélé un nombre de clusters variant de 13 à 15 par populations ainsi qu’une forte diminution des valeurs de FIS au sein des 4 populations clusterisées, comme vous pouvez le voir sur ce graphe avec en abscisse les populations clusterisées ou non, et en ordonnées les valeurs de FIS. Ce résultat va dans le sens de l’existence d’un effet Wahlund. Toutefois els valeurs de FIS restent importantes de même que le s estimé, ce qui reste toujours en contradiction avec un modèle de reproduction clonal stricte. Pour les DL nous avons obtenu 13DL significatifs sur 166 paires de locus étudiées.
- A l’issu des ces résultats, on a donc de forts FIS et des DL significatifs en contradiction avec un modèle de reproduction clonal strict. Nos résultats ont suggéré l’existence d’un effet wahlund, donc d’une forte sous structuration en microfoyers. Celle-ci peut être due à une sous-structuration géographique (en effet nos échantillons ont été collectés dans de grandes aires géographiques). En plus des barrières géographiques qui pourraient influencer la dispersion des parasites, nous proposons que la biologie des vecteurs et des réservoirs pourrait interférer avec une dispersion homogène des génotypes au travers des régions d’échantillonnage. Il existe donc un Effet wahlund, mais…
- Les valeurs de FIS restant fortes après clusterisétion des populations, nous proposons donc l’hypothèse que les leishmanies seraient caractérisées par un mode de reproduction mixte et plus particulièrement que les parasites L. braziliensis seraient capables d’alterner différents modes de reproduction : la clonalité, des recombinaisons sexuée entre individus apparentés et des évènements de recombinaison sexuée entre individus non apparentés. Comme c’est le cas par exemple chez P. falciparum qui alterne reproduction sexuée chez le vecteur et clonalité chez l’homme. Nous avons testé la cohérence de cette hypothèse grâce au logiciel easypop. Les simulations ont suggéré que nos données étaient compatibles avec de petites sous populations structurées, caractérisées par un mode de reproduction mixte avec en proportion 50% de clonalité, 47% de recombinaison sexuée entre individus apparentés et 3% entre individus non apparentés.
- A l’issu de cette étude de génétique des populations, nous avons donc suggéré, l’hypothèse que les leishmanies semblaient être caractérisées par plus de sexe que ce que prédisait le modèle clonal, et plus précisément nous proposons que ces parasites seraient caractérisés par un mode de reproduction mixte, c’est –à-dire qu’ils seraient capables d’alterner différents modes de reproduction qui sont la clonalité et les évènements de recombinaison sexués entre individus non apparentés ce qui correspond à de l’allogamie. Ceci était déjà connu, et à l’issu de nos travaux, nous proposons que les leishmanies seraient également capables d’effectuer des évènements de recombinaison sexué entre individus apparentés ce qui correspond à de l’endogamie.
- Nous proposons plus particulièrement comme hypothèse que les leishmanies seraient capables d’alterner de la clonalité chez le vecteur et l’hôte vertébré mammifère, et des évènements de recombinaison sexuée allogamique ou endogamique chez le vecteur. Comme c’est par exemple le cas chez P. falciparum ou encore T. brucei brucei.
- Il faut souligner que cette hypothèse d’endogamie chez les leishmanies au stade invertébré, sur la base d’étude de génétique des populations, a récemment été appuyée par une publication dans Sciences qui a mis en évidence expérimentalement l’existence d’échanges génétiques chez le vecteur. Plus particulièrement, cette équipe a mis en évidence l’existence de recombinaison génétique entre individus issus de deux souches différentes de l’espèce L. major. En effet, en utilisant des souches de leishmanies transgéniques, l’une résistante à la drogue A par exemple et l’autre à la drogue B, ils ont réussi à infecter les vecteurs naturels et ensuite à isoler des parasites hybrides résistants aux deux drogues. Ils ont ainsi produit des progénitures hybrides, caractérisées par un génome nucléaire composé d’élément provenant des deux parents. Pour finir, les auteurs ont réussi à prouver que ces progénitures hybrides pouvaient être transmises aux hôtes mammifères. Cette étude est la première à démontrer expérimentalement l’existence de reproduction sexuée chez les leishmanies.
- Pour conclure, à l’issu de cette première étude de génétique des population sur L. braziliensis, nous avons donc obtenu des résultats en désaccord avec une structure des population clonale associée à des évènements de recombinaison occasionnels. En effet, nous avons suggéré l’hypothèse que les leishmanies seraient caractérisées par un régime de reproduction mixte, dans lequel elles alterneraient clonalité, allogamie et endogamie. Pour ce qui est des prochaines étapes, il serait intéressant de mener d’une part le même typer d’étude de génétique des populations sur d’autres espèces de leishmanies et également de valider expérimentalement l’existence d’endogamie.
- Et pour cette partie, une étude préliminaire a été réalisée, et présentée hier à la session poster. Les buts de cette expérience étaient d’étudier la composition génotypique d’une souche hétérozygote et de suivre au cours du temps l’évolution des génotypes. L’hypothèse était que l’attendu d’un mode de reproduction endogamique est une diminution de l’hétérozygotie au cours du temps. Les résultats ne nous ont pas permis clairement de répondre qu’en à l’existence d’endogamie dans nos échantillons, par contre ils ont permis de mettre en évidence qu’une souche était composée d’une population de génotype et non pas d’un seul et unique génotype, comme considéré dans les étude de génétique des populations de leishmanies jusqu’à aujourd’hui. Ce résultat est fondamental pour une meilleure compréhension de la stratégie de reproduction de reproduction des leishmanies et devra donc être considéré pour les prochaines études de génétique des populations.
- Pour finir, une dernière perspective qui nous intéresse particulièrement à l’issu de toutes ces études, est le compartiment vecteur, car à l’heure actuelle on connait peu sur ce compartiment, sur leur rôle dans l’organisation de la structuration des populations de leishmanies. Plus particulièrement, il se pourrait que le vecteur soit l’unité de reproduction chez les leishmanies, comme c’est le cas pour P. falciparum ou l’anophèle est l’unité de reproduction. Pour tester cela, l’idée serait de développer une technique fine et sensible dans laquelle, on isolerait chaque populations de parasites et même chaque parasite de chaque vecteur. Puis ces populations serait génotypées par des marqueurs microsatellites pour mener des études de génétique des populations.