LE CLONAGE Procédure
Les enzymes de restrictionCaractéristiques:• la plupart des sites sont des séquences inversées répétées:cas de EcoRI: 5 ’ ...
Les vecteurs de clonage•capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée(origine de réplication de type proca...
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut             être cloné dans chaque vecteur
Les plasmides comme vecteur de clonage
Les cosmides comme vecteurs de clonage
Les phagemedes come vecteurs de clonage
Les YACs comme vecteurs de clonage
Fonctionnement de la ligase
Clonage de l’ADN recombiné dans une cellule en culture L’ADN hybride recombiné et l’ADN non recombiné seront introduits1)...
Identification du clone cellulaire ou du virus contenant l’ADN recombinant
Etude etcriblage del’ADN cloné
1/ Le criblage par des oligonucléotides de synthèseLe principe consiste à utiliser, dans un criblage classique, une sonde...
2/ Le criblage par des anticorpsCette technique ne peut se réaliser que sur une banque d’expressionpuisqu’elle vise à rév...
3/ Electrophorèsepermet de récupérer les fractions d’intérêt pour un séquençage del’ADN inséré. La révélation des différe...
4. Le séquençageIl a pour but la détermination de la séquencenucléotidique de l’ADN isolé pour définir les introns,les exo...
a - La méthode de Maxam et Gilbert: la méthode chimique.1. L’ADN double brin à séquencer est d’abord marqué au 32P au nive...
b - La méthode de Sanger: la méthode enzymatique.La méthode de séquençage enzymatique par l’incorporation dedidésoxyribonu...
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6. La PCRconsiste à amplifier sélectivement une séquence particulière d’ADN par l’action répétéed’une ADN polymérase.Le fr...
7/ Les RFLP (restriction frament length polymorphism)sont des variations de séquence de l’ADN révélées par des modificatio...
8/ Les minisatelites ou VNTR (Variable            Number of Tandem Repeats)Les VNTR sont des séquences particulières. Elle...
9/ Les microsatelitessont plus fréquent et les mieux caractérisés : les SSTR (Short Sequencesof Tandem Repeats).Ils sont f...
10/   SSCP (single Strand Conformation Polymorphism)La mise en évidence des mutations ponctuelles utilise le système de l...
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  1. 1. LE CLONAGE Procédure
  2. 2. Les enzymes de restrictionCaractéristiques:• la plupart des sites sont des séquences inversées répétées:cas de EcoRI: 5 ’ GAATTC 3 ’ 3 ’ CTTAAG 5 ’• Coupure avec formation de bouts collants ou à bouts francs
  3. 3. Les vecteurs de clonage•capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée(origine de réplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)•possède un polylinker ou site multiple declonage•supporte l’insertion d’un fragment d’ADNplus ou moins grand
  4. 4. Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur
  5. 5. Les plasmides comme vecteur de clonage
  6. 6. Les cosmides comme vecteurs de clonage
  7. 7. Les phagemedes come vecteurs de clonage
  8. 8. Les YACs comme vecteurs de clonage
  9. 9. Fonctionnement de la ligase
  10. 10. Clonage de l’ADN recombiné dans une cellule en culture L’ADN hybride recombiné et l’ADN non recombiné seront introduits1) dans des bactéries par transfert (plasmide) ou par infection (bactériophage),2) dans une cellule eucaryote en culture par transfection ou par infection avec un virus à ADN. Isolement des bactéries contenant les plasmides transférés facilement. Détection des bactériophages recombinants par des plages de lyse. L’ADN recombiné peut être cloné dans une cellule en culture.
  11. 11. Identification du clone cellulaire ou du virus contenant l’ADN recombinant
  12. 12. Etude etcriblage del’ADN cloné
  13. 13. 1/ Le criblage par des oligonucléotides de synthèseLe principe consiste à utiliser, dans un criblage classique, une sondeoligonucléotidique marquée synthétisée (courts de 18 à 25 bases ou quelquesoligonucléotides longs de 40 à 45 bases ) à partir des données de séquençage d’unefraction de la protéine. Le code génétique permet de déterminer les séquencespossibles du gène correspondant.Les appareils automatiques permettent actuellement de séquencer une protéineen 24 heures et de synthétiser des oligonucléotides dans le même laps de temps.Les oligonucléotides purifiés sont marqués au 32P et utilisés comme sonded’hybridation in situ d’une banque génomique.
  14. 14. 2/ Le criblage par des anticorpsCette technique ne peut se réaliser que sur une banque d’expressionpuisqu’elle vise à révéler le produit d’expression d’un gène cloné.Il faut pour cela disposer d’un anticorps, de préférence polyclonal dirigécontre le produit du gène.Le complexe antigène-anticorps est révélé par un autre complexe protéiquepossédant soit une activité enzymatique dont les produits sont colorés (B-galactosidase), soit marqué à l’iode 125.
  15. 15. 3/ Electrophorèsepermet de récupérer les fractions d’intérêt pour un séquençage del’ADN inséré. La révélation des différentes bandes est faite soit par :Une utilisation du bromure d’éthidium et une lecture sous uneilluminationultra-violette. Un marquage chimique ou enzymatique des produits obtenus pourle séquençage (utilisation de radio-isotopes, 32P, 35S) suivi d’uneautoradiographie.
  16. 16. 4. Le séquençageIl a pour but la détermination de la séquencenucléotidique de l’ADN isolé pour définir les introns,les exons et les zones de régulation de l’ADN insérédans le vecteur. Deux méthodes classiques sont alorsutilisées.
  17. 17. a - La méthode de Maxam et Gilbert: la méthode chimique.1. L’ADN double brin à séquencer est d’abord marqué au 32P au niveau du phosphate en 5’.2. Il doit ensuite être digéré par une endonucléase de restriction en deux fragments différents de taille, qui sont séparés par électrophorèse.3. On obtient ainsi un fragment dont une seule extrémité 5’ est marquée.4. Il est séparé en 4 lots et dans chaque lot, au moyen de réactifs chimiques différents, on réalise une coupure au niveau d’un type de base différent.5. Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide des 4 produits de réaction et autoradiographie, les positions relatives des différentes bases sont déduites de la comparaison des distances de migration des fragments marqués en 5
  18. 18. b - La méthode de Sanger: la méthode enzymatique.La méthode de séquençage enzymatique par l’incorporation dedidésoxyribonucléotides.Cette méthode met à profit l’absence d’un hydroxyle en 3’ d’unddXTP qui ne permet pas la formation d’une liaisonphosphodiester.La conséquence est un arrêt de l’élongation lorsqu’undidésoxyribonucléotide est incorporé dans un brin d’ADN ensynthèse.
  19. 19. Analyse du génome et de ses modifications: Le Southern blot L’ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de restrictionappropriée Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose, L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude, L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur un support solide(filtre de nitrocellulose ou nylon). Les membranes de nylon sont les plus utiliséescar par un traitement au UV (254 nm), on forme des liaisons covalentes entre leDNA et le nylon de sorte que le support peut être utilisé plusieurs fois avecd’autres sondes. Le support solide est hybridé avec une sonde mono-brin marquée à faiblestringence puis lavé Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de
  20. 20. 6. La PCRconsiste à amplifier sélectivement une séquence particulière d’ADN par l’action répétéed’une ADN polymérase.Le fragment d’ADN à amplifier est compris entre deux séquences (complémentaires desamorces) qui doivent être connues et la longueur ne peut excéder 10 kb.La réaction de la PCR comporte trois étapes qui constituent un cycle au cours duquel laquantité d’ADN à amplifier est doublée.Ces cycles sont renouvelés entre 20 et 50 fois en fonction de la quantité d’ADN cible dedépart et du but recherché.la dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C,l’hybridation avec une amorce, appariement primer, à 64°CL’extension de l’amorce à 70 - 72°C par la Taq polymérase.L’amplification est effectuée par la répétition des cycles qui assure une duplicationexponentielle de chaque brin.
  21. 21. 7/ Les RFLP (restriction frament length polymorphism)sont des variations de séquence de l’ADN révélées par des modifications de la carte derestriction.L’ADN est soumis à une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction suivied’un Southern blot.En d’autres termes : l’hydrolyse d’un ADN par une endonucléase conduit à une série defragments, appelés fragments de restriction.La longueur des fragments est déterminée par la distance séparant les séquencesspécifiques reconnues par cette endonucléase.Une molécule d’ADN donnée coupée par une enzyme de restriction donnée produittoujours les mêmes fragments : cette série de fragments fournit une empreintecaractéristique de l’ADN hydrolysé, on parle de carte d’identité moléculaire.
  22. 22. 8/ Les minisatelites ou VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)Les VNTR sont des séquences particulières. Elles sont répétitives,dispersées et très polymorphes.Elles ont souvent 11 à 16 bp (GGAGGTGGGCAGGA [A/G] G. Ellespermettent la réalisation de l’empreinte genetique (ADN fingerprinting)
  23. 23. 9/ Les microsatelitessont plus fréquent et les mieux caractérisés : les SSTR (Short Sequencesof Tandem Repeats).Ils sont favorisé par des crossing over inégales lors de la méiose. Lachorée de Hungtington qui est une maladie neurodégénérative estprovoquée par des crossing-over inégaux.La technique des SSTR permettent d’établir des polymorphismes à plusde 99,99%.
  24. 24. 10/ SSCP (single Strand Conformation Polymorphism)La mise en évidence des mutations ponctuelles utilise le système de l’analyse despolymorphisme de conformation de l’ADN simple-brin .Une mutation ponctuelle au sein de cette séquence modifie la structure secondairepour qu’il en résulte une modification de la migration en électrophorèse. Processus :- La séquence où l’on souhaite rechercher une mutation est amplifiée par PCR.- Cette séquence ne doit pas dépasser 300 à 500 bp.- L’ADN est marqué par un iso-radioactif au cours de l’amplification.On peut introduire un nucléotide 32P dCTP ou alors utiliser des primers marqués.
  25. 25. 11. Puces à ADN (microarray) ou ADN chipsLa technologie des puces ADN permet l’analyse de l’expression de milliers degènes simultanément.Employer les puces ADN vise à caractériser les relations gène-fonction oudéfinir et comparer les profils d’expression des messagers exprimés dans descellules isolées dans différentes conditions (exemple : cellules normalescomparées aux cellules tumorales) ou soumises à différents traitements(définition du profil d’action d’une drogue). Les puces ADN sont un outil dechoix dans la recherche et la caractérisation de nouvelles molécules à viséethérapeutique.

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