Diu Cytometriegrenoble2011

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Monoclonal antibody, Janossy, Workshops, CDs, Cluster of dfferenciation, Mononuclear cells, lymphocytes, Immunolohy, Membrane molecules

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  • The membrane microdomains include lipid rafts, tetraspanin-enriched microdomains (TEM) and podosomes or invadopodia. The association on the tumour cell membrane of cathepsin B with caveolae, a subset of lipid rafts that contain the structural protein caveolin, is mediated by a direct interaction of procathepsin B with the light chain of the annexin II heterotetramer (AIIT). Membrane microdomains are dynamic with constituents also present in intracellular vesicles such as multivesicular bodies, MHC (major histocompatibility complex) class II compartments (MIIC) and exosomes that also contain cysteine cathepsins such as (pro) cathepsin L and cathepsin S. These associations might enhance secretion of cysteine cathepsins, including at podosomes or invadopodia, at which sites CD63 co-localizes with p61Hck, a 'lysosome-associated' Src family kinase. The urokinase plasminogen activator receptor in association with 1-integrin is found in many of the same membrane microdomains, perhaps indicative of an association between these two proteolytic pathways at this sites.
  • http://1degreebio.org/
  • Diu Cytometriegrenoble2011

    1. 1. MC Béné Grenoble 19 Janvier 2010 GC Faure Grenoble 12/12/2011
    2. 2. Où l’on cherche à identifier les leucocytes…. <ul><li>Identifier : techniques morphologiques </li></ul><ul><ul><li>Étalement </li></ul></ul><ul><ul><li>Séparation (gradients de densité) </li></ul></ul><ul><ul><li>Cytocentrifugats </li></ul></ul><ul><ul><li>Colorations </li></ul></ul><ul><ul><li>Cytochimie </li></ul></ul><ul><li>Compter </li></ul><ul><ul><li>Hémocytomètres </li></ul></ul><ul><ul><li>Appareils de numération </li></ul></ul>
    3. 3. Les limites de la technique <ul><li>Identification des « blastes » </li></ul><ul><li>Sous populations lymphocytaires </li></ul><ul><li>« Rosettes mouton » … et leurs dérivés </li></ul><ul><li>Premiers anticorps … polyclonaux : anti-immunoglobulines (von Behring) , TdT (90’s) </li></ul>
    4. 4. Anticorps polyclonaux : « Gros » animaux <ul><li>Mélange d ’anticorps sériques </li></ul><ul><li>- contre plusieurs épitopes </li></ul><ul><li>certains sans réactivité pour l ’antigène </li></ul><ul><li>Titre de chaque anticorps différent d’un animal à l’autre </li></ul>ANTICORPS POLYCLONAUX Vaccination avec rappels Saignées répétées
    5. 6. TdT+, cALL (CD10)+ lymphoid blast crisis of Ph’+ chronic myeloid leukaemia (Lancet ii: 1058, 1976)
    6. 7. La révolution de César Milstein et Georges Köhler <ul><li>Petite histoire…. </li></ul><ul><li>1976, Milstein travaille sur la diversité des immunoglobulines et va faire une conférence à Bâle </li></ul><ul><li>Générer une lignée cellulaire productrice d’anticorps dirigés … contre des hématies de mouton pour travailler sur les mutations somatiques des gènes d’immunoglobuline </li></ul><ul><li>A l’époque la question de la spécificité des anticorps était encore débattue et on se battait avec la purification des anticorps polyclonaux </li></ul>
    7. 8. Dream No.1 Flow cytometry can be used for clinical leukaemia diagnosis on the ‘immunophenotyping’ platform anti-ALL (24 absorptions!) fetal development: BM is a lymphoid organ Melvyn Greaves, Geoff Brown and George Janossy
    8. 9. Dream No.2 from G.Janossy Monoclonal antibodies can be used for visualizing cells in tissues, normal and pathological (‘monoclonal immunohistology’ platform) CD1 (NA1/34) on human thymus: The first ever tissue section stained by the first anti-human monoclonal antibody CD1 (NA1-34) and CD45 (2D1) for T-ALL diagnosis and thymic origin Ken Bradstock, Gianni Pizzolo Bradstock KF, Janossy G, Bollum FJ, Milstein C. Anomalous phenotype in thymic acute lymphoblastic leukaemia. Nature 1980; 284(5755): 455-7.
    9. 10. Anticorps monoclonaux Lignée de myélome murin Déficiente en HGPRT Immunisation Rate Pas de fusion - - + Sélection des clones réactifs Clones Fusion en milieu HAT HYPOXANTHINE AMINOPTERINE THYMIDINE
    10. 11. Une explosion internationale <ul><li>Production d’anticorps monoclonaux dans tous les laboratoires : liquides d’ascite </li></ul><ul><li>Identification sur les cellules disponibles/connues dans le laboratoire producteur </li></ul><ul><li>Redondances+++ </li></ul><ul><li>Organisation indispensable </li></ul><ul><ul><li>Héritage du HLA </li></ul></ul><ul><ul><li>Culture de la workshop (atelier) </li></ul></ul><ul><ul><li>Premier atelier H uman L eukocyte D ifferentiation A ntigens, 1981/82, 55 équipes de 14 pays, 12 « fournisseurs » </li></ul></ul>
    11. 12. Qu’est-ce qu’une workshop HLDA? <ul><li>Séries d’anticorps « proposés » pour une spécificité donnée </li></ul><ul><li>Aliquotage, anonymisation et dispatching dans labos volontaires (pipette elbow) </li></ul><ul><li>Tests sur des cellules données </li></ul><ul><ul><li>En immunofluorescence </li></ul></ul><ul><ul><li>En Western Blot </li></ul></ul><ul><ul><li>Plus tard avec des techniques moléculaires ou cellulaires plus sophistiquées </li></ul></ul><ul><li>Enregistrement de la réactivité observée </li></ul><ul><li>Génération d’une immense base de données… </li></ul><ul><li>… confiée aux statisticiens! </li></ul>
    12. 13. La technique de Clustering Notion de distance
    13. 14. Et donc, les CLUSTERS de différenciation … ou CD!
    14. 15. Notion de CD <ul><li>Clusters de différenciation </li></ul><ul><ul><li>Groupes de monoclonaux reconnaissant la même molécule </li></ul></ul><ul><ul><li>Par extension, cette molécule </li></ul></ul><ul><ul><li>CD+ numéro + lettre : ex CD1a </li></ul></ul><ul><ul><li>Épitopes intracytoplasmiques cCD ou cyCD </li></ul></ul><ul><ul><li>Antigènes sialylés CDns (ex CD15s) </li></ul></ul>
    15. 16. Première workshop HLDA <ul><li>Réactivité testée sur </li></ul><ul><ul><li>T-PBL Thymus </li></ul></ul><ul><ul><li>PHA Non T-PBL </li></ul></ul><ul><ul><li>Tonsils Spleen </li></ul></ul><ul><ul><li>Monocytes Polymorphs </li></ul></ul><ul><ul><li>Bone marrow </li></ul></ul><ul><li>Anticorps classés en 3 groupes </li></ul><ul><ul><li>Groupe I : T cells, 70 anticorps (79*) </li></ul></ul><ul><ul><li>Groupe II : B cells and CALLA, 24 anticorps (36*) </li></ul></ul><ul><ul><li>Group III : monocytes and myeloid, 45 anticorps (56*) </li></ul></ul><ul><li>*avec duplicates et contrôles </li></ul>
    16. 17. Evolution des Workshops HLDA <ul><li>1982 Paris, 11CD + 4 provisoires </li></ul><ul><li>1984 Boston, 11 CD </li></ul><ul><li>1987 Oxford, 19 CD </li></ul><ul><li>1989 Vienne, 33 CD </li></ul><ul><li>1993 Boston, 31 CD </li></ul><ul><li>1996 Kobe, 55 CD </li></ul><ul><li>2000 Harrogate, 81 CD </li></ul><ul><li>2004 Adelaide, 93 CD </li></ul><ul><li>2010 Barcelone CD307, 351-363 </li></ul>
    17. 18. Adelaide 2004 8th HLDA : 339/350 CD Barcelone 2008 363
    18. 19. Critères HLDA <ul><li>Nouveaux CD </li></ul><ul><ul><li>Initialement, au moins deux anticorps issus de deux laboratoires différents </li></ul></ul><ul><ul><li>Evolution vers une préidentification par le laboratoire proposant l’anticorps, sur la base d’études moléculaires préalables </li></ul></ul><ul><ul><li>Sélection d’anticorps de bonne qualité pour les distributions </li></ul></ul><ul><li>Blind panel </li></ul><ul><ul><li>Anticorps soumis aux workshops sans spécificité identifiée </li></ul></ul><ul><ul><li>101 à Harrogate: 31 « décryptés » </li></ul></ul><ul><ul><li>Souvent des spécificités déjà connues </li></ul></ul><ul><ul><li>Bon outil de vérification des corrélations intercentres </li></ul></ul><ul><ul><li>Beaucoup testés sur des lignées </li></ul></ul>
    19. 20. Jusqu’où? <ul><li>Peut être 4 à 5000 molécules? </li></ul><ul><ul><li>Sur la base des spots des gels 2D </li></ul></ul><ul><ul><li>Sur la base des analyses de mRNA </li></ul></ul><ul><ul><li>Sur la base des analyses en SAGE (serial analysis of gene expression) </li></ul></ul><ul><li>Quelle est la part des antigènes intracellulaires dans ces estimations? Est-ce un réel problème? </li></ul><ul><li>On estime que 20% des gènes codent pour des protéines membranaires </li></ul><ul><li>Des HLDA à l’HCDM : </li></ul><ul><li>Human Cell Differentiation Molecules </li></ul><ul><li>D’après Heddy Zola, Cell Research 2005 </li></ul>
    20. 21. Les CD-anticorps <ul><li>Le plus souvent d’origine murine-souris </li></ul><ul><ul><li>Reconnaissance universelle par des anticorps polyclonaux fluorescents anti-souris (lapin, chèvre, âne, cochon…) </li></ul></ul><ul><ul><li>Isotypes et sous-classes des immunoglobulines de souris </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b…. </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Production actuelle en réacteurs </li></ul></ul><ul><li>Il existe des monoclonaux de rat, notamment pour les CD murins-souris </li></ul><ul><li>Il existe des monoclonaux de lapin </li></ul><ul><li>On peut faire des monoclonaux humains </li></ul>
    21. 22. Les CD-antigènes <ul><li>Surtout des protéines/peptides </li></ul><ul><li>Les épitopes reconnus peuvent être conformationnels </li></ul><ul><li>Les carbohydrates sont les plus souvent reconnus par des monoclonaux IgM </li></ul><ul><li>Essentiellement des molécules de surface </li></ul>B A B
    22. 23. Les CD-antigènes : découverte des familles moléculaires <ul><li>Immunoglobulines et superfamille des Ig </li></ul><ul><li>Récepteurs aux cytokines </li></ul><ul><ul><li>TNF/TNFR </li></ul></ul><ul><ul><li>Récepteurs aux cytokines </li></ul></ul><ul><ul><li>Récepteurs aux chemokines </li></ul></ul><ul><li>Molécules d'adhésion </li></ul><ul><ul><li>Sélectines </li></ul></ul><ul><ul><li>Intégrines </li></ul></ul><ul><ul><li>Tétraspanines </li></ul></ul><ul><li>Immunité innée: TLRs </li></ul><ul><li>CD45 </li></ul><ul><li>Molécules costimulation </li></ul><ul><li>SigLec </li></ul>
    23. 24. La superfamille des immunoglobulines <ul><li>Une structure de base, le « domaine » </li></ul><ul><li>Une centaine d’acides aminés et deux cystéines </li></ul><ul><li>Un disque de feuillets béta plissés antiparallèles </li></ul><ul><li>Des boucles de jonction </li></ul><ul><li>Quel CD avec 1 seul domaine? </li></ul>
    24. 25. ORGANISATION DES FEUILLETS BETA-PLISSES Les feuillets clairs sont sur le dessus (cercle clair), les feuillets foncés en-dessous (cercle foncé) Ils sont reliés entre eux par des boucles dont certaines peuvent porter des CDR PONT DISULFURE Représentation schématique de face Représentation schématique de profil
    25. 29. Superfamilles du TNF et des récepteurs au TNF (TNFSF et TNFRSF) <ul><li>Un grande famille de trimères transmembranaires généralement homotrimériques </li></ul><ul><li>Clivage de la portion extracellulaire par les métalloprotéinases pour générer des formes solubles </li></ul><ul><li>Implication dans l’apoptose, l’activation cellulaire, la prolifération, l’organogénèse… </li></ul>
    26. 30. TNFSF <ul><li>Identification initiale du TNF </li></ul><ul><li>Homologie de structure avec une trentaine d’autres molécules </li></ul><ul><li>Duplication génique probable </li></ul><ul><li>Forme membranaire ou soluble </li></ul>
    27. 31. TNFRSF <ul><li>Protéines transmembranaires de type II </li></ul><ul><li>Portion extracellulaire constituée de domaines riches en cystéine </li></ul><ul><li>Portion intracytoplasmique associant des domaines de mort et des segments TRAF (TNF receptor associated factors) </li></ul><ul><li>Structure spécifique de la famille, sandwich de feuillets beta-plissés </li></ul>
    28. 32. CD95L CD178 CD27L CD70 CD30L CD153 CD40L CD154 TRAILCD253 OX40L CD252 RANKLCD254 APRIL CD256 BAFF CD257 TNFR1 CD12a TNFR2 CD12b
    29. 34. Récepteurs aux cytokines <ul><li>Deux classes </li></ul><ul><ul><li>Classe 1: hematopoietin receptor family </li></ul></ul><ul><ul><li>Classe 2 : interférons et IL-10 </li></ul></ul><ul><li>Classe 1 : associations multimériques générant des récepteurs de spécificité variable </li></ul><ul><ul><li>Premier identifié, CD25, IL-2R alpha </li></ul></ul><ul><ul><li>S’associe en fait à deux autres molécules pour former trois récepteurs différents </li></ul></ul><ul><ul><li>Chaîne commune CD130 commune à IL-6, IL-11, OSM, LIF, CNTF </li></ul></ul><ul><ul><li>Chaîne commune CD131 partagée par les récepteurs des IL-3, IL-5,et GM-CSF </li></ul></ul><ul><ul><li>Chaîne gamma CD132 commune aux récepteurs des IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 </li></ul></ul><ul><li>Classe 2 </li></ul><ul><ul><li>Homodimères </li></ul></ul>
    30. 35. Récepteurs aux cytokines à CD132
    31. 36. Récepteurs aux cytokines à CD130 et CD131
    32. 37. Récepteurs aux cytokines de classe 2
    33. 38. Nomenclature <ul><li>CD réservés à partir de CD120 </li></ul><ul><ul><li>CD 120 a et b: TNF-R 1 et 2 </li></ul></ul><ul><ul><li>CD121: IL-1R </li></ul></ul><ul><ul><li>CD122: IL-2R beta </li></ul></ul><ul><ul><li>CD123: IL-3R </li></ul></ul><ul><ul><li>CD124: IL-4R alphaCD125: IL-5R alpha </li></ul></ul><ul><ul><li>CD126: IL-6R </li></ul></ul><ul><ul><li>CD127: IL-7R </li></ul></ul><ul><ul><li>CD128: IL-8R </li></ul></ul><ul><ul><li>CD129: IL-9R </li></ul></ul><ul><li>CD130: partagée par IL-6R et IL-11R </li></ul><ul><li>CD réservés à nouveau à partir de CD210 </li></ul><ul><ul><li>CD210: IL-10R </li></ul></ul><ul><ul><li>CD213a &b / IL-13R1 &R2 </li></ul></ul><ul><ul><li>CD217: IL-17R </li></ul></ul>
    34. 39. Récepteurs aux cytokines <ul><li>La portion extracellulaire d’une des chaînes donne la spécificité cytokinique </li></ul><ul><li>La portion intracytoplasmique transduit les signaux de réponse à cette cytokine </li></ul><ul><li>Le clivage membranaire génère des récepteurs solubles toujours capables de fixer la cytokine </li></ul><ul><li>Anomalies impliquées dans des déficits immunitaires </li></ul>
    35. 41. Superfamille des récepteurs aux chemokines <ul><li>Molécules transmembranaires intégrales avec 7 passages transmembranaires, serpentines </li></ul><ul><li>Liaison sous membranaire aux protéines G </li></ul>
    36. 42. CD183 CXCR3 CD184 CXCR4 CD194 CCR4 CD195 CCR5 CD197 CCR7 v
    37. 43. Molécules d’adhésion © Pr MC Béné CD34 Sialomucines CD31 Superfamille des Ig CD62E Sélectines CD49a Intégrines CD29 Tetraspanines CD9
    38. 44. Superfamille des sélectines <ul><li>Structure complexe mais similaire </li></ul><ul><ul><li>Succession de SCR = short consensus repeats </li></ul></ul><ul><ul><li>Un domaine EGF = epidermal growth factor </li></ul></ul><ul><ul><li>Domaine C-lectine terminal = reconnaissance de carbohydrates </li></ul></ul><ul><li>Impliquées dans l’adhésion cellulaire et la diapédèse </li></ul><ul><li>Exprimées sur </li></ul><ul><ul><li>Les cellules endothéliales : CD62E </li></ul></ul><ul><ul><li>Les plaquettes : CD62P </li></ul></ul><ul><ul><li>Les leucocytes : CD62L </li></ul></ul><ul><li>Molécules flip-flop des granules alpha et des corps de Weibel-Pallade = CD62E et P sur les deux types cellulaires </li></ul>
    39. 46. Superfamille des intégrines <ul><li>Chaînes alpha et chaînes beta </li></ul><ul><li>« hand » domains et i domains </li></ul><ul><li>« Appareil locomoteur » des cellules </li></ul><ul><ul><li>Portion extracellulaire capable de se fixer à la matrice extracellulaire : collagène, fibrinogène, laminine, vitronectine… </li></ul></ul><ul><ul><li>Portion intracellulaire liée aux molécules du cytosquelette : actine, actinine, taline, vinculine… </li></ul></ul><ul><li>Dépendance ++ aux ions Ca, Mn, Mg </li></ul><ul><li>Déficit immunitaire lié à l’absence de CD18 : LAD </li></ul>
    40. 47. Beta 1 = CD29 Alpha 1 à 6 = VLA 1 à 7 = CD49 a à g Beta 2 = CD18 Alpha L = CD11a Alpha M = CD11b Alpha X = CD11c Alpha E = CD103… RGD receptors = Tripeptide Arg-Gly-Asp
    41. 48. Superfamille des tetraspanines <ul><li>Molécules à quatre passages transmembranaires </li></ul><ul><li>Très conservées dans la phylogénie </li></ul><ul><li>Hélices alpha et ponts disulfure dans les boucles extracellulaires </li></ul><ul><li>Sites de palmitoylation sur les cystéines intracelllulaires </li></ul><ul><li>Signature dans la boucle intracytoplasmique (exclut CD20!!) </li></ul><ul><li>Relations avec les radeaux lipidiques (rafts) </li></ul><ul><li>Formation de microdomaiones enrichis en tetraspanines (TEM) </li></ul><ul><li>Réorganisation des interactions moléculaires de surface : notion de tetraspan-web </li></ul><ul><li>Rôle dans l’adhésion, la mobilité et les métastases </li></ul>
    42. 53. Toll-like receptors TLRs <ul><li>Récepteurs de l’immunité innée </li></ul><ul><li>Très conservés dans l’évolution </li></ul><ul><li>Initialement identifiés chez la drosophile (merci Jules) </li></ul><ul><li>Une dizaine identifiés chez l’homme </li></ul><ul><li>CD286 TLR6 </li></ul><ul><li>CD288 TLR8 </li></ul><ul><li>CD290 TLR10 </li></ul>
    43. 54. Isoformes de CD45 <ul><li>Leukocyte common antigen (LCA) </li></ul><ul><li>Forme CD45 exprimée sur tous les leucocytes </li></ul><ul><li>Isoformes par splicing alternatif </li></ul>
    44. 56. 9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens <ul><li>Barcelona, Spain, 11-13 March 2010 </li></ul><ul><ul><li>P Engel </li></ul></ul><ul><li>From HLDA to HCDM </li></ul><ul><li>B-cell oriented </li></ul>
    45. 57. The old B-CDs <ul><li>CD 19, 20, 21, 22 </li></ul><ul><li>CD 79a, 79b </li></ul><ul><li>CD179a, 179b </li></ul><ul><li>http://www99.mh-hannover.de/aktuelles/projekte/hlda7/hldabase/select.htm </li></ul><ul><ul><li>Database of antibodies assigned from HLDA1 to 6 </li></ul></ul><ul><li>VIIth </li></ul><ul><ul><li>CD267, 269, 307e </li></ul></ul>
    46. 58. The new CDs 307’s…. 363 <ul><li>CD307a,b,c,d,e,f = FCRL1-6 </li></ul><ul><li>CD351 FCA/MR </li></ul><ul><li>CD352 NTBA = SLAMF6 </li></ul><ul><li>CD353 BLAME = SLAMF8 </li></ul><ul><li>CD354 TREM-1 </li></ul><ul><li>CD355 CRTAM (Nectin family) </li></ul><ul><li>No CD number for molecules under the surface (iCD) where there is life FoxP1… bcl6….PRDM1/Blung1? </li></ul>
    47. 59. New CDs <ul><li>TNF superfamily </li></ul><ul><ul><li>CD356 HVEM TNFRSF14 </li></ul></ul><ul><ul><li>CD357 GITR TNFRSF18 </li></ul></ul><ul><ul><li>CD358 ? </li></ul></ul><ul><li>Cytokine receptors </li></ul><ul><ul><li>CD359 IL-15RA </li></ul></ul><ul><ul><li>CD360 IL-21R </li></ul></ul><ul><ul><li>CD(w)210 IL10RA </li></ul></ul><ul><li>CD361 EVI2b </li></ul><ul><li>CD362 Syndecan 2 </li></ul><ul><li>CD363S1PR1, EDG-1 </li></ul>
    48. 61. Marqueurs associés à la lignée B CD19 ITAM CD22 or ITIM ITIM ITIM ITIM ITAM CD20 P CD24 CD21 BCR NH2 COOH CD23
    49. 62. CD1 CD2 TCR      CD3 ITAM ITAM ITAM ITAM ITAM ITAM ITAM ITAM ITAM ITAM CD4 CD5 CD8 CD7
    50. 63. Marqueurs associés aux cellules myéloïdes CD13 E NH2 COOH E CD14 L L L L L L L L L L P CD33 CD11b Mg Mg Mg MPO K CD117 CD15 CD65 3-fucosyl-N-acetyl-lactosamine céramide dodecasaccharide CD36 CD35 CD16
    51. 64. Integrated collaboration Requires strong leadership and a long time-scale (10-15 yrs) Before a new drug But so many underway
    52. 65. http://1degreebio.org/ De la NLM S Shaw PROW … 339 http://www.sciencegateway.org/resources/prow/index.html à Via l’ASSIM … 363 http://www.thefcn.com/cd_list_hlda_9_barcelona_2010.html
    53. 66. References <ul><li>HLDA 1: Leucocyte Typing - Bernard, A., et al. Eds., Springer-Verlag (1984) HLDA 2: Leucocyte Typing II - Reinherz, E.L., et al. Eds., Springer-Verlag (1986) HLDA 3: Leucocyte Typing III - McMichael, A.J., et al. Eds., Oxford University Press (1987) HLDA 4: Leucocyte Typing IV - KnappW., et al. Eds., Oxford University Press (1989) HLDA 5: Leucocyte Typing V - Schlossman, S.F., et al. Eds., Oxford University Press (1995) HLDA 6: Leucocyte Typing VI - Kishimoto, T., et al. Eds., Garland Publishing, Inc. (1997) HLDA 7: Leucocyte Typing VII - Mason, D., et al. Eds., Oxford University Press (2002) Leukocyte and Stromal Cell Molecules The CD Markers - H. Zola, B. Swart, I. Nicholson, E. Voss. Wiley (2007) </li></ul><ul><li>+ </li></ul><ul><li>Immunology Letters </li></ul>

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