Caractérisation de l’écosystème broncho-pulmonaire
chez les patients atteints de mucoviscidose : Structure et
Dynamique du...
Introduction
 Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique
- Troubles respiratoires: 1er
motif de consultati...
 Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique
- Troubles respiratoires: 1er
motif de consultation dans le mo...
Mucoviscidose:
Introduction
Notion de co-colonisation
co-infection pulmonaire
Objectif : Quel microbiote pour quel
patient...
Extraction d’ADN dépendante de la matrice
PCR ciblant des gènes conservés pour amplifier
des espèces phylétiquement éloign...
- Pyroséquençage (454 FLX)
-326 277 pyroséquences /
450-500 bp (93%)
[V3 du 16s rDNA]
-133 317 pyroséquences /
300-450 bp ...
Quel microbiote pour quel patient
dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
 Diversité bactérienne
 Diversité fong...
Quel microbiote pour quel patient
dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
 Diversité bactérienne
Patient 2
Mars 2...
Quel microbiote pour quel patient
dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
 Diversité fongique
Patient 2
 Parmi l...
Quel microbiote pour quel patient
dans la mucoviscidose ?
Résultats et Discussion
 Diversité fongique
Patient 2
Mars 2008...
Patients 2
Pat. 3 (09/2007)
Patient 1 (01/2008)
Patient 4 (10/2008)
Pat. 3 (09/2008)
Patient 1 (01/2009)
Patient 4 (08/200...
% Capacité Ventilatoire Forcée
(CVF)
VEMS1
Pat. 3 (09/2007)
Pat. 3 (09/2008)
Patient 1 (01/2008)
Patient 1 (01/2009)
Patie...
 Etude modeste (8 expectorations)
mais prometteuse
Conclusion et Perspectives
Delhaes et al. PloS One 2012 ; 7 (4): e3631...
Institut Pasteur-Lille / Université de Lille 2
• Dr. Laurence Delhaes (laurence.delhaes@pasteur-lille.fr)
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Caractérisation de l’écosystème broncho pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose

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  • Bonjour
  • La fonction respiratoire est l’un des plus grands enjeux de demain en matière desanté publique: - Les troubles…
    -la BPCO sera la 4ème
    -la prévalence de l’asthme est en augmentation dans Pays développés (25 millions d’américains atteints asthme)
    -la mucoviscidose, pathologie à laquelle nous nous intéressons plus particulièrement, est la maladie génétique la plus fréquente dans la population caucasienne. (1/3000 -4000 Nnés en France).
    L’épaississement du mucus observé dans la mucoviscidose, a comme conséquence directe une accumulation (un piégeage) des microorganismes (bactérie champ) au niv pulmonaire, ce qui entrave fortement la fonction respiratoire, est responsable d’infection/ sur-infections pulmonaires (notamment les infections à Pseudomonas aeruginosa)
    = cause majeure de mortalité dans la mucoviscidose
    Au même titre que les sols, les océans (et autres milieux), il existe un microbiote de l’organisme humain: le plus étudié et documenté étant le microbiote intestinal . environ 100 000 milliards, soit au moins deux fois plus que le nombre moyen de cellules de l'organisme
    Mais de la même façon, il existe un microbiote cutané, vaginal, et biensur pulmonaire
    A ce jour c’est essentiellement le microbiote bactérien qui est étudié
    Rationnel: Aspergillus scedos : 2 plus frequent champ chez la muco
    P jiroveci: portage très fréquent muco + BPCO - Portage Pj associé aux stades sévères (III, et IV) de BPCO: role dans la réponse inflammatoire ?; 2.5% d’API chez les patients atteints de BPCO avec une mortalité très élévée 70-95%: signifcation de la colonisation sensibilisation ?
  • Dans le continuité de notre étude multicentrique (PHRC mucofong) focalisée sur le « risque fongique dans la mucoviscidose » que j’ai coordonné,
    Qui montre comme d’autres nombreux travaux l’importance des co-colonisation / co-infection (bactéries en bleu, levure en jaune, et champignons filamenteux en vert) concomitante de la dégradation de la fonction pulmonaire mesurée ici par spirométrie
    Nous nous sommes intéressée: Au microbiote fongique pulmonaire
    Et pour rebondir sur le titre de la session :
    Quels champ …
  • Nous nous sommes attachés à déterminer la composition du microbiote fongique du patient atteint de muco, en prenant également en compte les bactéries,
    Avec comme questions biologiques sous-jacentes (aux quelles nous avons essayé de répondre) :
    -Le microbiote du patient atteint de muco est-il différent de celui du patient sain?
    -Quelle est sa stabilité dans le temps?
    -Est-il corrélé à l’état clinique/évolution du patient?
    Et nous avons utilisé les outils qui nous semblaient les plus adaptés au contexte càd les approches DE SEQUENCAGE HAUT-DEBIT
  • Notre stratégie méthodologique était basée sur le pyroséq sur automate 454 (roche)
    Je vais en donner les grandes étapes de cette méthodologie
    Si vous souhaitez nous pourrons en reparler après.
    -aà partir des expecto (8 de 4 patients adultes stables cliniquement), nous avons extrait l’AND total OU métagenome (kit Hight pure Kit – Roche)
    -2 PCR ciblant l’ADN16 (V3) des bactéries et le locus ITS2 des champignons ont été réalisées (grâce à 2 couples d’amorces)
    -Séquençage multi-parallélisé, obtention de plusieurs milliers de pyroséquences
    Elles ont été identifiées par comparaisosn à 2 banques de données la banque SILVA en accès libre pour les seq de 16S et une banque spécifique des séquences ITS2 que nous avons créé et validé pour cette étude en collaboration avec Genoscreen à IPL
    Après plusieurs étapes de bioinformatique, les pyroséquences sont groupées en fonction de leur identité puis attribuées à une espèce quand c’est possible ou sinon à un genre conformément aux données de nos 2 banques et selon les critères choisis.
    Puis nous avons réalisé une analyse phylogénétique des différents taxons permettant de comparer les 2 échantillons d’un même patient = grâce au logiciel MEGAN,
  • Au total, nous avons obtenu 450 000 seq correspodant à 8 expectorations de 4 patients,
    Réparties en
    - >300 000 seq bacteriennes
    - et 130 000 seq fongiques
    Majoritairement de bonne longueur: 93% avaient 450-500 et 85% 300-450bp
    Pour chaque patient, ces pyroséq montrent une distribution en plateau, ce qui signifie que l’on est à peu pret à saturation et que l’on a une bonne représentativité/exhaustivité de la diversité de l’échantillon
  • Pour poursuivre l’analyse nous sommes concentrés sur la diversité bactérienne, puis fongique et sur l’existence d’une relation entre les communautés microbiennes = le microbiote et l’évolution clinique des patients
  • Pour chaque patient, nous avons obtenu une image/cartographie de la diversité bacterienne au moment du plvt: Cette communauté microbienne est plus ou moins diverse selon le patient (je vais en reparler), elle est dynamique dans le temps: avec des espèces/genre présentes en 2008 qui disparaissent sur le plvt de 2009
    Ces résultats sont conformes aux données de la litérature en matière de diversité avec une médiane d’espèce ou genre bacterien par expecto de 6.5,
    On retrouve l’importance de la flore anaérobique, et les genres majoritaires sont ….
    We obtained a total of 326,277 sequences from samples 1 and 2 of Patients 1, 2, 3 and 4 using primers for the prokaryote 16S rDNA gene, a result in agreement with recent published data (20) (Table 2; Fig. 1A). Using the fungus-specific ITS2 primers, we obtained a total of 133,317 sequences from samples 1 and 2 of Patients 1, 2, 3 and 4, respectively (Table 2; Fig. 1B). Once primer, tag and key fragments were removed, 93% and 85% of the sequences had lengths greater than 450-500 bp and 300-450 bp for the 16S rDNA and ITS2 loci, respectively.
    For all patients and samples except one (i.e. Patient 1-sample 1 for the ITS2 locus), the rarefaction curves for the number of OTUs per pyrosequence reads reached a plateau, indicating that almost all OTUs present in each sample were detected. The apparent observed diversity was higher for the prokaryote 16S rDNA locus (Fig. 1A) in comparison to the fungus-specific ITS2 locus (Fig. 1B).
  • Des résultats similaires sont observés pour la diversité fongique:
    Ici parmi les 24 espèces ou genres identifiés sur 4 avaient été isolés en culture (A. fum, A. flavus, C albicans et Geotricum sp)
    Aussi nous avons confronté nos identifications de pyroséquençage aux données bibliographiques
  • Des résultats similaires sont observés pour la diversité fongique:
    Ici parmi les 24 espèces ou genres identifiés sur 4 avaient été isolés en culture (A. fum, A. flavus, C albicans et geotricum)
    Aussi nous avons confronté nos identifications de pyroséquençage aux données bibliographiques
  • En ce qui concerne la relation entre cette communauté microbienne (ce microbiote bactérien et fongique ) et l’évolution clinique du patient :
    Pour chaque patient et chaque expectoration, la diversité fongique puis bactérienne est exprimée/représentée par l’index de Chao (indicateur non paramétrique de biodiversité)
    Plus l’index est élevé, plus il y a d’espèces présentes dans l’expecto et plus le diamètre /disque est large
    Pour chaque patient et chaque expectoration, nous avons regardé s ’il y avait une lien avec son état clinique ici représenté par l’indice de masse corporel et le score de S (c’est un score en 4 fois 25% qui évalue l’activité du patient, son état nutritionnel, son état respiratoire et l ’atteinte pulmonaire en radiologie
    Vous voyez clairement que meilleur est l’état du patient, plus grande est la communauté microbienne.
    Cette corrélation est statisitiquement significative …
    Et Cela avait été publié à 2 reprises pour les bactéries, pour les champ notre travail est le premier du genre
  • De la même façon les valeurs de spirométrie VEMS et CVF sont clairement corrélé au microbiote
  • Pour conclure, cette étude est modeste : 8 echantillons mais à mon sens très prometteuse elle a clairement mis en évidence une correlation entre la diversité du microbiote et le statut du patient en utilisant le séquençage haut-débit et les outils de bioinfo correspondant(elle vient d’être publiée)
    Sur le plan physiopathologique, dans la mucoviscidose, la composition du mucus représente des conditions favorables au développement des co-infection / co-colinisation
    Il a été montré que
    La réduction de tension en oxygène (observée dans la muco) favorise la croissance de …
    De plus tous ces microorganismes sont capables de former des biofilms avec de potentielles interactions intra mais aussi inter-spécifiques
    La formation du microbiote est donc un évement dynamique,
    pour mieux le comprendre, il nous faut maintenant
  • (1/3000 Nnés en France)
    (1/3000 Nnés en France)
    Rationel
    Aspergillus scedos : 2 plus frequent champ chez la muco
    P jiroveci: portage très fréquent muco + BPCO
    2.5% d’API chez les patients atteints de BPCO avec une mortalité très élévée 70-95%: siginifcation de la colonisation sensibilisation ?
    Portage Pj associé aux stades sévères (III, et IV) de BPCO: role dans la réponse inflammatoire ?
  • Caractérisation de l’écosystème broncho pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose

    1. 1. Caractérisation de l’écosystème broncho-pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose : Structure et Dynamique du microbiote pulmonaire dans l’évolution clinique de la mucoviscidose 1 BDEEP-EA4547, CIIL – Institut Pasteur Institute de Lille, CHRU - Faculté de Pharmacie, Lille ; 2 LMGE-ULCO Laboratoire d'Océanologie et de Géoscience, Wimereux, 3 CHRU de Lille, 4 CHU de Nice, 5 Département de microbiologie, APHP Créteil - France. L. Delhaes1-3 , M. Chabé1 , S. Monchy2 , J. Salleron3 , S. Leroy3-4 , A. Prévotat3 , B.Wallaert3 , E. Dei-Cas1-3 , E. Viscogliosi1 , F Botterel5
    2. 2. Introduction  Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique - Troubles respiratoires: 1er motif de consultation dans le monde - BPCO: 4ème cause de décès dans le monde en 2030 selon l’OMS - Asthme: constante augmentation [↑ prévalence de 7,3% à 8,4% - 2001-10 aux USA] - Mucoviscidose: Maladie génétique la + fréquente chez les caucasiens (CHU de Rouen) Rabe et al. « The year of the lung ». Lancet 2010 Akinbami et al. NCHS Data Brief , 94 -May 2012 -Diversité microbienne au niveau pulmonaire = Microbiote [Beck et al. 2012; Erb-Downward et al. 2011; Huang et al. 2011] -Dans la mucoviscidose, cette communauté poly- microbienne semble être un élément clé dans l’évolution de la fonction respiratoire [Goddard et al. 2012; Madan et al. 2012; Fodor et al. 2012; Maughan et al. 2012; Guss et al. 2011; van der Gast et al. 2011; Rogers et al. 2010; Armougom et al. 2009; Bittar et al. 2008; Sibley et al. 2008; Tunney et al. 2008; Harris et al. 2007]
    3. 3.  Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique - Troubles respiratoires: 1er motif de consultation dans le monde - BPCO: 4ème cause de décès dans le monde en 2030 selon l’OMS - Asthme: constante augmentation [↑ prévalence de 7,3% à 8,4% - 2001-10 aux USA] - Mucoviscidose: Maladie génétique la + fréquente chez les caucasiens Introduction (CHU de Rouen) Rabe et al. « The year of the lung ». Lancet 2010 Akinbami et al. NCHS Data Brief , 94 -May 2012 Quel(s) champignon(s) à l’étage pulmonaire ?
    4. 4. Mucoviscidose: Introduction Notion de co-colonisation co-infection pulmonaire Objectif : Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ? - Micromycètes+++ - BactériesLe microbiote pulmonaire d’un patient CF est-il stable dans le temps ? La diversité et la richesse du microbiote pulmonaire est-elle associée à l’état clinique du patient CF ? … ⇒ Déterminer la structure/composition de la communauté microbienne en utilisant les approches de séquençage haut-débit Quel(s) champignon(s) à l’étage pulmonaire ?
    5. 5. Extraction d’ADN dépendante de la matrice PCR ciblant des gènes conservés pour amplifier des espèces phylétiquement éloignées (V3 du 16s rDNA – ITS2) Séquençage massif (multi-parallélisé) - obtention de plusieurs centaines de milliers de séquences Analyse bio-informatique Identification par comparaison à 2 banques de données (BLASTN ≠ Silva SSU rRNA database release 102 et ≠ ITS2dbScreen (création de novo) Assignement et regroupement des séquences (attribution à espèce/genre) Permettant une interprétation biologique (comparaison de diversité grâce au logiciel MEGAN) Stratégie méthodologique MucoviscidoseExpectoration
    6. 6. - Pyroséquençage (454 FLX) -326 277 pyroséquences / 450-500 bp (93%) [V3 du 16s rDNA] -133 317 pyroséquences / 300-450 bp (85%) [ITS2] -Courbes de raréfaction ayant une distribution en plateau = bonne représen- tativité de la composition bactérienne et fongique Résultats et Discussion - 8 expectorations - 4 patients Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?
    7. 7. Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ? Résultats et Discussion  Diversité bactérienne  Diversité fongique  Relation entre communauté microbienne / évolution clinique
    8. 8. Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ? Résultats et Discussion  Diversité bactérienne Patient 2 Mars 2008 Mars 2009  Confirmation la diversité bactérienne récemment décrite: - Importance des anaérobies, des Pseudomonas, Streptococcus, Haemophilus, = genres majoritaires  Médiane [IQ] du nombre de bactéries = 6.5 [5; 13.5] (espèces/genres) [Goddard et al. 2012; Madan et al. 2012; Fodor et al. 2012; Maughan et al. 2012; Guss et al. 2011; van der Gast et al. 2011; Rogers et al. 2010; Armougom et al. 2009; Bittar et al. 2008; Sibley et al. 2008; Tunney et al. 2008; Harris et al. 2007; Rogers et al. 2004].
    9. 9. Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ? Résultats et Discussion  Diversité fongique Patient 2  Parmi les 24 espèces /genres de micromycètes identifiés par pyroséquençage, seuls 4 étaient aussi isolés en culture. Mars 2008 Mars 2009
    10. 10. Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ? Résultats et Discussion  Diversité fongique Patient 2 Mars 2008 Mars 2009  Médiane [IQ] du nombre de champignons par expectoration = 3.5 [3; 7.5] (espèces/genres) [Bouchara et al. 2009]
    11. 11. Patients 2 Pat. 3 (09/2007) Patient 1 (01/2008) Patient 4 (10/2008) Pat. 3 (09/2008) Patient 1 (01/2009) Patient 4 (08/2008) Richesse fongique (Chao1 index) Richesse Bactérienne (Chao1 index) S-K score= Score de Shwachman-Kulczycki Indice de Masse corporelle (kg/m2 )  Corrélation entre indexes de Chao1 (fongiques / bactériens) et S-K score et BMI (p<0.05).  Conforme aux données publiées pour les bactéries [van der Gast et al. 2011; Klepas-Ceraj et al. 2010]. Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ? Résultats et Discussion  Relation entre communauté microbienne / évolution clinique
    12. 12. % Capacité Ventilatoire Forcée (CVF) VEMS1 Pat. 3 (09/2007) Pat. 3 (09/2008) Patient 1 (01/2008) Patient 1 (01/2009) Patient 4 (10/2008) Patient 4 (08/2008) Patients 2 (03/2008) Patients 2 (03/2009)  Association entre indexes de Chao1 fongiques & bactériens et VEMS1, CVF (p<0.05) Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ? Résultats et Discussion  Relation entre communauté microbienne / évolution clinique
    13. 13.  Etude modeste (8 expectorations) mais prometteuse Conclusion et Perspectives Delhaes et al. PloS One 2012 ; 7 (4): e36313 ⇒ Dans la mucoviscidose, composition du mucus = conditions favorables pour des co-infections chroniques : - Réduction de la tension en O2 favorise la croissance de P. aeruginosa, des anaérobies dont SMG, mais aussi de C. albicans et A. fumigatus -Capacité à former des biofilms, avec des interaction entre microorganismes [Rybtke et al. 2011; Bandara et al. 2010; Mowat et al. 010; Sibley et al. 2008; Alvarez-Ortega et al. 2007; Dimitru et al. 2007; Semighini et al. 2006] ⇒ Microbiote (F/B) = évènement dynamique, indicateur de l’état clinique du patient ? ⇒ «Ecologie et dynamique des communautés microbiennes dans les expectorations des patients atteints de mucoviscidose sous ATB-thérapie: étude prospective multicentrique française par séquençage à haut débit » Projet C20120600697- F Botterel & L Delhaes
    14. 14. Institut Pasteur-Lille / Université de Lille 2 • Dr. Laurence Delhaes (laurence.delhaes@pasteur-lille.fr) • Dr. Eric Viscogliosi • Dr. Emilie Fréalle • Dr. Eduardo Dei-Cas • Dr. Magali Chabé Université Littoral Côte d’Opale • Dr. Sébastien Monchy • Dr. Christine Hubans • Dr. Stéphanie Ferreira Faculté de Médecine de Lille • Dr. Julia Salleron • Dr. Sylvie Leroy • Dr. Anne Prévotat •Dr. Fréderic Wallet •Dr. Benoit Wallaert • Dr. Télesphore Sime-Ngando Université Blaise-Pascal-Clermont-ferrand Société Genoscreen-Lille Remerciements

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