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La callogenèse

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La callogenèse

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La callogenèse
Introduction
 La biotechnologie: Technologies
impliquant l’obtention et/ou l’utilisation
d’organismes génétiquement modifiés.
Introduction
 La Biotechnologies végétales:
Développement et utilisation de
techniques de cultures in vitro dans
différents domaines relatifs au végétal et
à l’amélioration variétale.
Introduction
 Les domaines abordés de la
biotechnologie végétale: Ensemble des
pratiques faisant appel aux cultures in
vitro de plantes et aux techniques de
biologie moléculaire dans les domaines
de l’agronomie, l’industrie et la recherche
fondamentale.
A Suivre…
 Totipotence de la cellule végétale
 Etapes callogenèse
 Techniques de culture in vitro de
 Balance hormonal et minérale
Totipotence
 Chez les plantes, la totipotence peut se
définir comme la propriété qu’ont
certaines cellules de pouvoir régénérer un
individu lorsqu’elles sont placées dans des
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La callogenèse

  • 2. Introduction  La biotechnologie: Technologies impliquant l’obtention et/ou l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés.
  • 3. Introduction  La Biotechnologies végétales: Développement et utilisation de techniques de cultures in vitro dans différents domaines relatifs au végétal et à l’amélioration variétale.
  • 4. Introduction  Les domaines abordés de la biotechnologie végétale: Ensemble des pratiques faisant appel aux cultures in vitro de plantes et aux techniques de biologie moléculaire dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la recherche fondamentale.
  • 5. A Suivre…  Totipotence de la cellule végétale  Etapes callogenèse  Techniques de culture in vitro de  Balance hormonal et minérale
  • 6. Totipotence  Chez les plantes, la totipotence peut se définir comme la propriété qu’ont certaines cellules de pouvoir régénérer un individu lorsqu’elles sont placées dans des conditions appropriées, en passant éventuellement par une étape de dédifférenciation.
  • 7. Pourquoi les cellules végétales sont totipotentes ???  Petit nombre de types cellulaires.  Seulement 3 ou 4 types d’organes fondamentaux (racine, tige, feuilles) dont les fleurs, vrilles, épines, fruits et tubercules sont des dérivés.  Grande plasticité génomique: la croissance peut rester presque normale malgré de profonds remaniements chromosomiques.
  • 10. 01
  • 11. 01
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  • 25. 01
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  • 29.  Une hormone :est une molécule synthétisée par un organisme et qui, à très faible concentration, va avoir une action sur le développement de certains tissus de cet organisme.  les phytohormone: sont des Produits de types divers, d’origine synthétique ou végétale (naturelle),qui peuvent circuler plus ou moins loin selon le cas , susceptibles d’exercer une action physiologique sur le végétal dont ils vont agir sur des cellules cibles possédants les récepteurs qui leurs correspondants
  • 30.  ils peuvent agir : o sur la dimension des cellules : accélération de la germination des graines, augmentation de croissance, réduction de croissance. o sur la multiplication des cellules : inhibition de la germination, bouturage, mise à fleur. o modification du métabolisme : augmentation de la précocité, de la productivité, effets divers.
  • 31. Parmi les principaux phytohormone : L’auxine Les cytokinines Les gibbérellines
  • 32. •La synthèse de l'auxine s'effectue dans les apex méristématiques des tiges, et dans les jeunes feuilles des bourgeons terminaux. •Le transport de l'auxine s'effectue de façon polarisée, de l'apex vers la base dans la tige par la sève 1)l’auxine 1.1)Mode de production des auxines Site de production: bourgeon apical Diffusion des hormones •dominance apicale • stimulation de la rhizogenèse -
  • 33. 1.2 ) role de l’auxine  Elle inhibe les bourgeons qu’elle rencontre. ( dominance apicale )  Elle stimule la croissance primaire ( en longueur des cellules de la tige).  Elle stimule la croissance secondaire ( en épaisseur ) en provoquant la division des cellules du cambium et en influençant sur la différenciation du xylème secondaire.  Lorsque la plantule est jeune, la concentration en auxine arrivant aux niveau de l’apex racinaire est forte et elle stimule la rhyzogénèse .  Puis en grandissant, la distance entre les bourgeons terminaux et les racines augmente; La concentration en auxine diminue. Elle stimule alors l’élongation des cellules au niveau de la racine.  elles inhibent l'abscission (chute) des feuilles et des fruits.  L'auxine induit également le phototropisme d'un végétal
  • 34.  L’auxine synthétisée par les graines en développement favorise la maturation du fruit.
  • 35.  Variation de l’élongation des cellules de racine en fonction de la concentration en auxine
  • 36. Applications en culture in vitro  A partir d’un vitro plant  On coupe un fragment de tige d’environ 1,5 cm portant 2 feuilles.  Les feuilles sont enlevées en prenant soin de laisser intact les bourgeons axillaires. On réalise 3 milieux de cultures différents : Milieu de culture Résultats Milieu MS ½ Sans auxine Pas d’enracinement Milieu MS ½ Avec auxine 0,5 μmol.L-1 Formation de racine Photo A Milieu MS ½ Avec auxine 2 μmol.L-1 Formation d’un cal Photo B Photo A Photo B
  • 37. 2) Cytokine Synthèse dans les racines puis migrent dans la plante via la sève brute (xylème) 2.1)Mode de production des cytokinines Site de production: Racines Transport vers les sites d ’action : - levée de dominance apicale - débourrement des bourgeons axillaires
  • 38. 1.2 ) role de l’auxine  Elle inhibe les bourgeons qu’elle rencontre. ( dominance apicale )  Elle stimule la croissance primaire ( en longueur des cellules de la tige).  Elle stimule la croissance secondaire ( en épaisseur ) en provoquant la division des cellules du cambium et en influençant sur la différenciation du xylème secondaire.  Lorsque la plantule est jeune, la concentration en auxine arrivant aux niveau de l’apex racinaire est forte et elle stimule la rhyzogénèse .  Puis en grandissant, la distance entre les bourgeons terminaux et les racines augmente; La concentration en auxine diminue. Elle stimule alors l’élongation des cellules au niveau de la racine.  elles inhibent l'abscission (chute) des feuilles et des fruits.  L'auxine induit également le phototropisme d'un végétal
  • 39.  L’auxine synthétisée par les graines en développement favorise la maturation du fruit.
  • 40.  Variation de l’élongation des cellules de racine en fonction de la concentration en auxine
  • 41. les effets de l’auxine dans la plante en fonction de sa concentration Elle stimule la rizhogénèse à forte concentration Elle stimule la différenciation de bourgeon à très faible concentration A forte concentration, elle inhibe le développement des bourgeons = inhibition apicale. Elle inhibe la chute des feuilles et des fruits Elle active la formation de la chaire des fruits Elle active l’élongation des racines mais à très faible concentration.
  • 42. Applications en culture in vitro  A partir d’un vitro plant  On coupe un fragment de tige d’environ 1,5 cm portant 2 feuilles.  Les feuilles sont enlevées en prenant soin de laisser intact les bourgeons axillaires.On réalise 3 milieux de cultures différents : Milieu de culture Résultats Milieu MS ½ Sans auxine Pas d’enracinement Milieu MS ½ Avec auxine 0,5 μmol.L-1 Formation de racine Photo A Milieu MS ½ Avec auxine 2 μmol.L-1 Formation d’un cal Photo B Photo A Photo B
  • 43. 2) Cytokine Synthèse dans les racines puis migrent dans la plante via la sève brute (xylème) 2.1)Mode de production des cytokinines Site de production: Racines Transport vers les sites d ’action : - levée de dominance apicale - débourrement des bourgeons axillaires
  • 44. 2.2) rôle de cytokinines  Stimule l’élongation cellulaire et l’organogenèse  Les cytokinines en présence d'auxine stimulent la division cellulaire, leur rôle précis portant sur la duplication des chromosomes et le recloisonnement cellulaire.  Elles favorisent l'extension radiale des tiges et des racines.  Elles activent la production de chlorophylle Expérience réalisée sur un morceau de parenchyme prélevé dans une tige Culture sans aucun ajout d’hormone Les cellules deviennent très grosses mais ne se divisent pas + cytokinines Pas d’effet + cytokinines + auxines Les cellules se divisent
  • 45. Régulation de la dominance apicale : L’auxine est fabriquée au niveau des bourgeons terminaux Les cytokinines sont fabriquées au niveau de la racine • Dans la tige, L’auxine inhibe le développement des bourgeons axillaires. • Mais les cytokines bloquent l’effet de l’auxine qui arrive vers le bas. • Les rameaux du bas se développent en premier… Et descend par le phloème Et remonte par le xylème • Dans la racine, Les cytokinines inhibent la formation de racines secondaires, • Mais l’auxine bloquent l’effet des cytokines. • Les racines secondaires les plus
  • 46. 3)Gibberllienes  Les sites de synthèse des gibbérellines sont les jeunes feuilles, les fruits, les graines, les apex des tiges et des racines  Elles ont une influence sur la levée ou interruption de la dormance.  elles interviennent sur l'initiation de la floraison et le débourrement des bourgeons.  Elles stimulent l’élongation des tiges et des limbes des feuilles. Stimulation ainsi stimule la croissance internodale  Elle stimule la germination des graines.  Elle stimule la maturation des fruits.  Inhibition de la croissance racinaire à la lumière et Favorise au contraire la croissance racinaire à l’obscurité
  • 47. BALANCE HORMONALE  Les auxines et les cytokinines sont les plus importantes, elles assurent le grandissement et l’activité mitotique; dont le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture
  • 48. Auxine cytokinines Faible Intermédiaire Forte Caulogenèse (formation des feuilles et tige ) Callogeèse (formation des cals :amas de cellule non différencie) Rhizogenése (formation des racines) Le rapport des concentrations des 2 hormones a son importance
  • 50. -Pour se développer et fructifier, une plante a besoin d'eau, de lumière et d'éléments nutritifs. - Elle fabrique sa matière organique à partir de sels minéraux, d'eau et de gaz carbonique (CO2) en exploitant l'énergie solaire : c'est le phénomène de la photosynthèse. - Elle puise dans le sol les éléments minéraux et l'eau, nécessaires à sa croissance. Les principaux éléments nutritifs dont elle a besoin pour sa croissance sont l'azote, le phosphore et la potassium, désignés respectivement par leurs symboles chimiques : N, P, K. Il y a des éléments minéraux qui constituent environ 1% de la matière sèche de la plante comme le manganèse (Mn), fer (Fe), cuivre (Cu) … ; sont les microéléments ou oligoéléments
  • 51. L’azote (N):  L’azote (N) est l'engrais de la croissance : il participe au développement du feuillage et des parties aériennes des plantes. Si les plantes manquent d’azote, elles sont lentes à se développer, leur feuillage est vert clair ou jaunâtre.
  • 52. Le phosphore (P):  Le phosphore (P) stimule le développement des racines, la floraison et la fructification. Si les plantes manquent de phosphore, leur feuillage est foncé, rouge ou marqué de taches rouges, la floraison est peu abondante et la maturation des fruits est longue.
  • 53. Le Potassium (k):  Le potassium (K) est utile à la circulation de la sève et à l’assimilation des éléments nutritifs par les plantes. Il améliore leur résistance au gel, aux ravageurs et maladies, ainsi que la couleur et la qualité gustative des fruits.
  • 55. Genre Fragaria Nombre d’espèces Une cinquantaine Ploïdie diploïde, tétraploïde, hexaploïde et Octoploïde Nombre chromosomique de base 7 chromosomes Espèce Fragaria X ananassa Duch Ploïdie octoploïde (2n =8x = 56) issu d’un hybride spontané entre deux espèces octoploïdes originaires d’Amérique : Fragaria chiloensis Duch. et F. virginiana L
  • 56. Culture in vitro  La technique in vitro est un mode de multiplication végétative artificielle des plantes.  Il s’agit d’un ensemble de méthodes faisant intervenir d'une part l'asepsie (stérilisation du matériel, désinfection des explants)
  • 57.  d'autre part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux de culture définis pour chaque type de plante, température, lumière, humidité,...)
  • 59. Milieu Knop: Milieu MS:  La solution de Knop (ou liquide de Knop) a été inventée par le chimiste allemand wilhelm Knop (1817-1891).  Utilisé plus particulièrement dans la culture des plantes à chlorophylle.  Il existe différentes types. Ces différentes solutions ne possèdent pas de source de carbone. Elles permettent d'expérimenter les exigences des plantes en faveur de tel ou tel élément non carbonaté  Le milieu de Murashige et Skoog (ou Milieu MS ou MSO).  inventé par les physiologistes végétalistes Toshio murashige et Folke K Skoog.  utilisé dans les laboratoires de biologie végétale pour la culture de cellules ou de tissus de plantes.
  • 61. Liquide de Knop complet:  1 g de nitrate de calcium  0,25 g de nitrate de potassium  0,25 g de sulfate de magnésium  0,25 g de phosphate monopotassique ou dihydrogénophosphate  0,05 g de sulfate ferrique  1000ml d'eau distillée
  • 62. Liquide de Knop sans phosphate:  1 g de nitrate de calcium  0,5 g de nitrate de potassium  0,25 g de sulfate de magnésium  0,10 g de sulfate ferrique ou sulfate de fer (III)  1 litre d'eau distillée
  • 63. Liquide de Knop sans potassium:  1,25 g de nitrate de calcium  0,25 g de sulfate de magnésium  0,25 g de sulfate ferrique  1 litre d'eau distillée
  • 64. Liquide de Knop sans azote:  1 g de chlorure de calcium  0,25 g de phosphate mono potassique  0,1 g de sulfate ferrique  0,5 g de chlorure de potassium  0,25 g de sulfate de magnésium  1 litre d'eau distillée
  • 66. Macroéléments (mg/l)  nitrate d'ammonium (NH4NO3) 1.650 mg/l.  acide borique(H3BO3) 6,2 mg/l.  chlorure de calcium(CaCl2*H2O) 440 mg/l.  chlorure de cobalt(CoCl2*6H2O) 0,025 mg/l.  sulfate de magnésium (MgSO4*7H2O) 370 mg/l.  sulfate de cuivre(CuSO4*5H2O) 0,025 mg/l.  phosphate de potassium (KH2PO4) 170 mg/l.  Sulfate de fer(FeSO4*7H2O) 27,8 mg/l.  Nitrate de Potassium(KNO3) 1.900 mg/l.  Sulfate de manganèse (MnSO4*4H2O) 22,3 mg/l.  iodure de potassium (KI) 0,83 mg/l.  molybdate d'ammonium (Na2MoO4*2H2O) 0,25 mg/l.  Sulfate de zinc(ZnSO4*7H2O) 8,6 mg/l.  EDTA (Na2EDTA*2H2O) 37,2mg/l.
  • 67.  1- choix du matériel végétal  2- Milieux de culture  3-Protocole expérimentale  4-Résultats
  • 68. Matériel végétal utilisé Fragments foliaires Cotylédons
  • 69.  Fragments foliaires :  Dimension : 5 × 5 mm  Origine: Feuilles de jeunes plantules âgées de 8 semaines issues de la germination in vitro d’akènes stockés à l'obscurité à 4°C pendant au moins 4 mois Des pousses issues de la culture d’apex sur un milieu de multiplication.
  • 70.  Cotylédons : Cotylédons embryonnaires Cotylédons non embryonnaires prélevés à partir d’akènes ayant subi une stérilisation par NaOCl (10 %) pendant 10 minutes, 3 rinçages à l'eau distillée stérile suivis d'une imbibition de 24 heures pour ramollir les téguments. prélevés sur de jeunes plantules âgées de 4 semaines issues de la germination in vitro d’akènes afin de comparer leur réponse callogène avec celle des cotylédons embryonnaires.
  • 71.  Le plus utilisé pour la callogenèse : milieu Murashige et Skoog  Composition :  D’autres éléments :  2,4 D : Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique  BA: BenzylAdenine sels minéraux (essentiellem ent des macroélémen ts) des sucres des vitamines B auxines cytokinine s
  • 72.  L’induction des cals a été réalisée sur le milieu MS additionné de :  30 g/l de saccharose  Diverses combinaisons de BA (0,5 ; 1 ; 2 ; 2,5 ;5 mg/l)  2,4-D (0,5 ; 1 ; 2 ; 2,5 ; 5 mg/l)  phytohormones appropriées pour l’initiation des cals chez plusieurs variétés de Fraisier [3,6,10,15].  Le milieu solidifié par 8 g/l d'agar est autoclavé pendant 20 minutes à 120°C.
  • 73.  Matériel :  6 boites de pétri contenant 30ml du milieu pour chaque traitement  Manipulation: Fragments foliaires Cotylédons - Les fragments foliaires ont été déposés face supérieure en contact avec le milieu (Les explants sont placés à raison de 4 par boîte de Petri ) La même chose pour es fragments Cotylédonaires. On répète l’experience 3 fois Même chose
  • 74.  Incubation  Les cultures ont été soumises deux semaines à l'obscurité et à 20±2°C pour une meilleure induction des cals  Ensuite, et dans les expériences ultérieures, les cultures ont été transférées dans une salle de culture à 24±1°C et 75 % d'humidité relative, l'éclairement, d'une intensité de 4000 lux (0,54 W.m-2), est fourni 16 heures par jour par des tubes fluorescents  Le pourcentage d’explants formant des cals et l’aspect des cals ont été notés après 4, 6 et 8 semaines de culture.
  • 75. Effet des phytohormones La combinaison 2 mg/l de 2,4-D et 1 mg/l de BA donne la meilleure callogenèse pour les deux types d’explants chez les deux cultivars et a été retenue. Effet de la source des explants -Le taux de callogenèse est de 100 % pour les cotylédons embryonnaires de 2 cultivars. 95 et 98 % des fragments foliaires prélevés sur des feuilles de plantules de 8 semaines issues de germination sont callogènes contre seulement 72,4 et 57,3 % pour les fragments foliaires de pousses de la phase de multiplication, respectivement pour ‘Chandler’ et ‘Tudla’.
  • 76. Effets de milieu de culture sur les cals de fraisier:  Pennell a étudier chez cette variété l’effet des solutions MS,Knop,B5,Heller… et remarqué que :  Le milieu Knop favorise l’apparition de bourgeons individualisés  Le milieu MS donne, au contraire un bon développement des bourgeons axilliaires mais avec des signes de vitrifivation.
  • 81. Meristème Apex caulinaire Nœud Culture de méristème Enracinement Plantules Tige feuillée Morphogenèse indirecte Callogenèse ca l Suspensions cellulaires Caulogenèse indirecte Embryogenèse somatique indirecte Morphogenès e directe Caulogenèse directe Embryogenèse somatique directe Semences artificielles Schéma récapitulatif de la régénération de la plante Explants divers (racines, tige, feuilles…)