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La régulation positive de T-bet et la stimulation par
l’interleukine 12 est essentiel pour l’induction d’une
immunopathologie médiée par Th1 dans la maladie de
Crohn
 Draoui Jihéne
 Saidi Nasreddine
T-bet upregulation and subsequent interleukin 12 stimulation are essential for induction of Th1
mediated immunopathology in Crohn’s disease
Plan
Introduction
Discussion
Résultats
Matériels et méthodes
La maladie de Crohn (MC) est une maladie
inflammatoire chronique qui touche le tractus
gastro-intestinal.
De nombreux éléments de preuve suggèrent qu’il y
a une réponse immunitaire prédominante des
lymphocytes T helper 1 (Th1) dans la maladie de
Crohn (MC).
Une nouvelle facteur de transcription T-box a était
découverte exprimé dans les cellules T (T-bet) qui
posséde un rôle principle dans la régulation du
développement de Th1.
Introduction
Objectif
Déterminer le rôle de T-bet et des
cytokines pro-inflammatoires dans
l'induction de réponses Th1 en MC
humaine et les différences dans les
réponses immunitaires entre MC et la
colite ulcéreuse (CU).
Matériel et méthodes
Patients et échantillons
Les 20 patients ont été
tous soumis à des
diagnostiques:
 Cliniques
 Radiographiques
 Endoscopiques
 Histologiques
Extraction d’ARN et PCR quantitative en temps réel
Extraction d’ARN total par le Kit RNeasy mini, c’est une Procédure
rapide délivrant une ARN total de haute qualité en quelques minutes.
Le kit RNeasy Mini fournit une purification rapide de l'ARN de haute
qualité à partir de cellules et de différents tissus vivants
• L'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant le
premier système de synthèse de brin Super script pour la transcription
inverse-PCR
• les bandes non spécifiques n'ont pas été détectés par analyse de
courbe de fusion pour chaque jeu d'amorces
les ARNm transcrits de T-bet ont été normalisées avec les
ARNm transcrits de β-actine et exprimés en unités arbitraires (UA)
Préparation: cellules mononucléées de la lamina propria (LPMCs) et
cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)
1. LPMCs ont été isolées à partir d'échantillons intestinaux
2. La muqueuse disséqué a été incubé dans une solution de
calcium et de magnésium
3. La muqueuse a été ensuite mis en incubation ans un
milieu contenant d'EDTA
4. Les lymphocytes intra-épithéliaux et les cellules
épithéliales ont été retirés du tissu
5. les tissus contenant LPMCs ont été recueillies et incubées
dans un milieu contenant de collagénase
6. La fraction a été sédimenté et les cellules centrifugé
7. Les PBMC ont été isolés par centrifugation à gradient de
densité à partir d'échantillons de sang périphérique
hépariné
8. LPMCs ou PBMC ont ensuite été séparées en cellules
CD4 positives en utilisant MACS
La culture cellulaire
Permettent la
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nécessaire a la division
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Dosage immunoenzymatique (ELISA)
Les concentrations d'IFN-γ et l'IL-12
dans les surnageants de culture de
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mononucléaires du sang périphérique)
ont été mesurés par ELISA spécifique
les concentrations minimales:
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Cytométrie en flux
• La cytométrie en flux est une
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suspension dans un liquide selon
plusieurs paramètres et à très grande
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• Elle consiste à analyser la fluorescence
émises par chaque particule et trier les
cellules
Utilisant des Ac anti IL-12Rb2
, l’intensité de fluorescence est analysé
par FACScan sur les surfaces des
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Les protéines totales ont été séparé sur un gel NuPAGE
Transférée par électrophorèse sur membrane
La membrane a été incubée avec antisérum de lapin
anti-T-bet détecter la protéine T-bet
La membrane est ensuite éliminer par western blot
de restauration avec un tampon d'extraction
Incubées avec des anticorps de souris anti-β-actine Ab
L'analyse densitométrique a été réalisée et l'expression
T-bet a été ajusté à β-actine expression.
L'analyse statistique
Les différences statistiques ont été analysées en utilisant le test de
Mann-Whitney.
Une valeur de p <0,05 était considérée comme significative.
Résultat
T-bet a été régulée positivement dans CD4 + des LPMCs Chez
MC
Afin de clarifier la participation de T-bet en immunopathologie médié
par Th1 dans la maladie de Crohn
Evaluation de l'expression de T-bet grâce à des ARNm obtenu à partir
des CD4 + LPMCs des patients:
• 5 témoins normaux (NL)
• 10 patients atteints de la maladie de Crohn (MC)
• 10 patients atteints de la colite ulcéreuse (CU)
utilisant la PCR quantitative en temps réel
ARNm de T-bet obtenus à partir des
cellules CD4 + des LPMCs des
patients atteints de MC est élevé par
rapport à celui obtenu à partir de
patients atteints de CU et NL
1,59
0,41 0,48
Les niveaux des ARNm transcrits de T-bet ont été mesurées par
RFLP et ajustés pour les ARNm transcrits de β-actine.
Protéine T-bet est également significative
dans CD4 + des LPMCs des patients MC
par rapport à ceux de patients atteints de
CU et NL.
l’expression de T-bet n'était pas
significativement différente entre les CU
et NL à la fois au niveau de ARNm et de
protéines.
88,5 12.74.1
L’expression de la protéine T-bet a été évaluée par western blot des patients
MC ,CU et NL.
La production d'IFN-γ par LPMCs (cellules
mononucléaires lamina propria) de patients
atteints de MC est plus élevé que celle à partir
de patients atteints de CU ou à partir de NL.
Cette production accrue d'IFN-γ et
correspond à l'augmentation de l'expression de
T-bet par LPMCs de patients atteints de MC.
Ces résultats indiquent que T-bet peut contribuer essentiellement à
des réponses immunitaires de type Th1 en MC.
T-bet n'a pas contribué à une augmentation synergique de la
production d'IFN-γ par la stimulation de l'IL-12 et IL-18
Pour déterminer quelles stimuli induisent T-bet en MC
Etudier les cytokines induisant Th1 telles que l'IL-
12, qui est sécrétée par les macrophages activés et les cellules
dendritiques via l'activation de la réponse immunitaire innée.
Mesurer la production d'IL-12 par LPMCs.
Bien que l'IL-12 ou d'IL-18 par eux-
mêmes ont augmenté la production d'IFN-γ
par LPMCs à partir de patients atteints de
MC.
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sur la production d'IFN-γ par les cellules
Examiner si l'IL-12 et / ou l'IL-18 pourrait réguler l'expression
T-bet dans LPMCs de patients atteints de MC.
Une addition unique ou
combinée de IL-12/IL-18 régule
positivement et d’une manière
significative l'expression T-bet.
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Ces résultats montrent que l'augmentation synergique de la
production d'IFN-γ par l'IL-12 et IL-18 chez des patients
atteints MC n'a pas besoin de plus d’une activation de T-bet
Ce qui suggère une voie indépendante de T-bet.
L'induction de T-bet via la voie de signalisation médié par les récepteurs
des lymphocytes T (TCR) est nécessaire pour la production d'IFN-γ avant
la stimulation D’IL12
Hypothèse
La stimulation de TCR est importante pour l’induction de T-bet dans
l’immunopathologie médiée par Th1 en maladie de crohn .
Utilisation des CD4 + des PBMC dans les expériences
suivantes
CD4+
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PBMC
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ion de
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CD3
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en
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e ou en
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product
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L’expres
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T-bet
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• En présence d'IL-12 et sans
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CD4 + des PBMC de patients
qui portent la maladie de crohn
produit peu IFN-γ
Sous les mêmes conditions Il y a pas augmentation de niveau
d’ARNm ou de la protéine de T-bet chez les CU ou MC
Une stimulation d’anti-CD3 en absence d'IL-12 induit une grande
quantité d'IFN-γ ainsi qu’une expression marqué de T-bet
68,5 ng / ml
Le niveau d’ induction de T-bet par
stimulation d’anti-CD3 n'était pas
significativement différente entre les
CD4 + des PBMC des patients
atteints de
⁻ MC
⁻ CU
⁻ NL
• En accord avec l'expression de
l'ARNm, la protéine T-bet a été
augmentée par la stimulation
d’anti-CD3 sur CD4 + des
PBMC des patients atteints de
MC.
Augmentation de l’expression
• en parallèle avec l’ induction de T-
bet par une stimulation anti-CD3
L'expression de surface de IL-
12Rβ2 a été analysée par FACS.
IL-12Rβ2 a également été
induite chez les CD4 + des PBMC et
une stimulation supplémentaire par
l'IL-12 a induit une plus grande
quantité d'IFN-γ (62,2 ng /ml)
La costimulation de l'IL-12 n'a
pas induit une régulation positive de T-
bet, qui est en accord avec les données
concernant LPMCs
Ces résultats indiquent que T-bet est induite à travers la
stimulation du TCR avant la signalisation d'IL-12 pour une production
améliorée d‘IFN-γ
T-bet peut non seulement lancer la production d'IFN-γ, mais aussi
de contrôler la réactivité à l'IL-12 par la régulation positive de l'IL-
12Rβ2
Discussion
T-bet a été proposé d'être le régulateur principal du développement de Th1 en
fonction de son induction de l'IFN-γ et de la répression des cytokines de Th2.
T-bet a été fortement exprimé dans CD4 + des patients LPMCs MC par rapport à
ceux de patients atteints de CU et NL.
Une régulation positive de T-bet en CD4 + des LPMCs à partir du MC.
L'expression accrue de T-bet dans les MC était compatible avec une production
accrue d'IFN-γ à partir de LPMCs MC.
T-bet jouer un rôle essentiel dans l'induction de réponses immunitaires de
type Th1 en MC .
Qui régule l’augmentation de T-bet en MC?
L'induction de T-bet dans les cellules
CD4 + des PBMC humaines a été médiée
par les anti-CD3, mais pas d'IL-12.
la stimulation antigénique était essentiel
pour l'induction de T-bet.
L'induction de T-bet par anti-
CD3 sur les CD4 + des PBMC
n'était pas différente entre MC
et la CU.
La stimulations antigéniques
répétées étaient essentielles
pour maintenir une forte
expression T-bet.
l’ augmentation de l'expression
de T-bet n'a été observée que
dans CD4 + des LPMCs de
patients atteints de MC.
Quel est alors le rôle de T-bet dans l'induction de
l'immunopathologie médiée par Th1 en MC ?
IL-12 ne pouvait pas induire la
production d'IFN-γ de CD4 + des
PBMC qui n'ont pas exprimé T-bet.
T-bet est nécessaire pour
initier la production d'IFN-γ
CD4 + des PBMC activés ont
également augmentés l'IL-12Rβ2
et ils ont répondu à l'IL-12 pour
une production supplémentaire de
l'IFN-γ.
T-bet est nécessaire pour pour
réguler la réactivité de l'IL-12 par
une régulation positive d’IL-
12Rβ2 dans MC
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  • 1. La régulation positive de T-bet et la stimulation par l’interleukine 12 est essentiel pour l’induction d’une immunopathologie médiée par Th1 dans la maladie de Crohn  Draoui Jihéne  Saidi Nasreddine T-bet upregulation and subsequent interleukin 12 stimulation are essential for induction of Th1 mediated immunopathology in Crohn’s disease
  • 3. La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique qui touche le tractus gastro-intestinal. De nombreux éléments de preuve suggèrent qu’il y a une réponse immunitaire prédominante des lymphocytes T helper 1 (Th1) dans la maladie de Crohn (MC). Une nouvelle facteur de transcription T-box a était découverte exprimé dans les cellules T (T-bet) qui posséde un rôle principle dans la régulation du développement de Th1. Introduction
  • 4. Objectif Déterminer le rôle de T-bet et des cytokines pro-inflammatoires dans l'induction de réponses Th1 en MC humaine et les différences dans les réponses immunitaires entre MC et la colite ulcéreuse (CU).
  • 6. Patients et échantillons Les 20 patients ont été tous soumis à des diagnostiques:  Cliniques  Radiographiques  Endoscopiques  Histologiques
  • 7.
  • 8. Extraction d’ARN et PCR quantitative en temps réel Extraction d’ARN total par le Kit RNeasy mini, c’est une Procédure rapide délivrant une ARN total de haute qualité en quelques minutes. Le kit RNeasy Mini fournit une purification rapide de l'ARN de haute qualité à partir de cellules et de différents tissus vivants
  • 9. • L'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant le premier système de synthèse de brin Super script pour la transcription inverse-PCR • les bandes non spécifiques n'ont pas été détectés par analyse de courbe de fusion pour chaque jeu d'amorces les ARNm transcrits de T-bet ont été normalisées avec les ARNm transcrits de β-actine et exprimés en unités arbitraires (UA)
  • 10. Préparation: cellules mononucléées de la lamina propria (LPMCs) et cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) 1. LPMCs ont été isolées à partir d'échantillons intestinaux 2. La muqueuse disséqué a été incubé dans une solution de calcium et de magnésium 3. La muqueuse a été ensuite mis en incubation ans un milieu contenant d'EDTA 4. Les lymphocytes intra-épithéliaux et les cellules épithéliales ont été retirés du tissu 5. les tissus contenant LPMCs ont été recueillies et incubées dans un milieu contenant de collagénase 6. La fraction a été sédimenté et les cellules centrifugé 7. Les PBMC ont été isolés par centrifugation à gradient de densité à partir d'échantillons de sang périphérique hépariné 8. LPMCs ou PBMC ont ensuite été séparées en cellules CD4 positives en utilisant MACS
  • 11. La culture cellulaire Permettent la différenciation des CD4 en TH1 Milieu complet nécessaire a la division cellulaire Les AC permettent de différencié les CD4 des autre cellules
  • 12. Dosage immunoenzymatique (ELISA) Les concentrations d'IFN-γ et l'IL-12 dans les surnageants de culture de LPMCs et PBMC (les cellules mononucléaires du sang périphérique) ont été mesurés par ELISA spécifique les concentrations minimales:  IL-12 et 7,8 pg / ml  IFN-γ 25,6 pg / ml
  • 13. Cytométrie en flux • La cytométrie en flux est une technique de triage de particules en suspension dans un liquide selon plusieurs paramètres et à très grande vitesse. • Elle consiste à analyser la fluorescence émises par chaque particule et trier les cellules Utilisant des Ac anti IL-12Rb2 , l’intensité de fluorescence est analysé par FACScan sur les surfaces des cellules Filtres optiques
  • 14. extraction des protéines et western blot Extraction de protéine totale Les protéines totales ont été séparé sur un gel NuPAGE Transférée par électrophorèse sur membrane La membrane a été incubée avec antisérum de lapin anti-T-bet détecter la protéine T-bet La membrane est ensuite éliminer par western blot de restauration avec un tampon d'extraction Incubées avec des anticorps de souris anti-β-actine Ab L'analyse densitométrique a été réalisée et l'expression T-bet a été ajusté à β-actine expression.
  • 15. L'analyse statistique Les différences statistiques ont été analysées en utilisant le test de Mann-Whitney. Une valeur de p <0,05 était considérée comme significative.
  • 17. T-bet a été régulée positivement dans CD4 + des LPMCs Chez MC Afin de clarifier la participation de T-bet en immunopathologie médié par Th1 dans la maladie de Crohn Evaluation de l'expression de T-bet grâce à des ARNm obtenu à partir des CD4 + LPMCs des patients: • 5 témoins normaux (NL) • 10 patients atteints de la maladie de Crohn (MC) • 10 patients atteints de la colite ulcéreuse (CU) utilisant la PCR quantitative en temps réel
  • 18. ARNm de T-bet obtenus à partir des cellules CD4 + des LPMCs des patients atteints de MC est élevé par rapport à celui obtenu à partir de patients atteints de CU et NL 1,59 0,41 0,48 Les niveaux des ARNm transcrits de T-bet ont été mesurées par RFLP et ajustés pour les ARNm transcrits de β-actine.
  • 19. Protéine T-bet est également significative dans CD4 + des LPMCs des patients MC par rapport à ceux de patients atteints de CU et NL. l’expression de T-bet n'était pas significativement différente entre les CU et NL à la fois au niveau de ARNm et de protéines. 88,5 12.74.1 L’expression de la protéine T-bet a été évaluée par western blot des patients MC ,CU et NL.
  • 20. La production d'IFN-γ par LPMCs (cellules mononucléaires lamina propria) de patients atteints de MC est plus élevé que celle à partir de patients atteints de CU ou à partir de NL. Cette production accrue d'IFN-γ et correspond à l'augmentation de l'expression de T-bet par LPMCs de patients atteints de MC.
  • 21. Ces résultats indiquent que T-bet peut contribuer essentiellement à des réponses immunitaires de type Th1 en MC.
  • 22. T-bet n'a pas contribué à une augmentation synergique de la production d'IFN-γ par la stimulation de l'IL-12 et IL-18 Pour déterminer quelles stimuli induisent T-bet en MC Etudier les cytokines induisant Th1 telles que l'IL- 12, qui est sécrétée par les macrophages activés et les cellules dendritiques via l'activation de la réponse immunitaire innée. Mesurer la production d'IL-12 par LPMCs.
  • 23.
  • 24. Bien que l'IL-12 ou d'IL-18 par eux- mêmes ont augmenté la production d'IFN-γ par LPMCs à partir de patients atteints de MC. En combinaison un effet dramatique sur la production d'IFN-γ par les cellules Examiner si l'IL-12 et / ou l'IL-18 pourrait réguler l'expression T-bet dans LPMCs de patients atteints de MC.
  • 25. Une addition unique ou combinée de IL-12/IL-18 régule positivement et d’une manière significative l'expression T-bet. L’expression de la proteine T-bet
  • 26. Ces résultats montrent que l'augmentation synergique de la production d'IFN-γ par l'IL-12 et IL-18 chez des patients atteints MC n'a pas besoin de plus d’une activation de T-bet Ce qui suggère une voie indépendante de T-bet.
  • 27. L'induction de T-bet via la voie de signalisation médié par les récepteurs des lymphocytes T (TCR) est nécessaire pour la production d'IFN-γ avant la stimulation D’IL12 Hypothèse La stimulation de TCR est importante pour l’induction de T-bet dans l’immunopathologie médiée par Th1 en maladie de crohn . Utilisation des CD4 + des PBMC dans les expériences suivantes
  • 28. CD4+ des PBMC Stimulat ion de •anti- CD3 • CD28 avec la plaque d'IL-12 en présenc e ou en absence La product ion d'IFN-γ L’expres sion de T-bet Ont été analysés après l’activation In Vitro
  • 29. • En présence d'IL-12 et sans stimulation du plaque anti-CD3 CD4 + des PBMC de patients qui portent la maladie de crohn produit peu IFN-γ
  • 30. Sous les mêmes conditions Il y a pas augmentation de niveau d’ARNm ou de la protéine de T-bet chez les CU ou MC
  • 31. Une stimulation d’anti-CD3 en absence d'IL-12 induit une grande quantité d'IFN-γ ainsi qu’une expression marqué de T-bet 68,5 ng / ml
  • 32. Le niveau d’ induction de T-bet par stimulation d’anti-CD3 n'était pas significativement différente entre les CD4 + des PBMC des patients atteints de ⁻ MC ⁻ CU ⁻ NL
  • 33. • En accord avec l'expression de l'ARNm, la protéine T-bet a été augmentée par la stimulation d’anti-CD3 sur CD4 + des PBMC des patients atteints de MC. Augmentation de l’expression
  • 34. • en parallèle avec l’ induction de T- bet par une stimulation anti-CD3 L'expression de surface de IL- 12Rβ2 a été analysée par FACS. IL-12Rβ2 a également été induite chez les CD4 + des PBMC et une stimulation supplémentaire par l'IL-12 a induit une plus grande quantité d'IFN-γ (62,2 ng /ml)
  • 35. La costimulation de l'IL-12 n'a pas induit une régulation positive de T- bet, qui est en accord avec les données concernant LPMCs
  • 36. Ces résultats indiquent que T-bet est induite à travers la stimulation du TCR avant la signalisation d'IL-12 pour une production améliorée d‘IFN-γ T-bet peut non seulement lancer la production d'IFN-γ, mais aussi de contrôler la réactivité à l'IL-12 par la régulation positive de l'IL- 12Rβ2
  • 38. T-bet a été proposé d'être le régulateur principal du développement de Th1 en fonction de son induction de l'IFN-γ et de la répression des cytokines de Th2. T-bet a été fortement exprimé dans CD4 + des patients LPMCs MC par rapport à ceux de patients atteints de CU et NL. Une régulation positive de T-bet en CD4 + des LPMCs à partir du MC. L'expression accrue de T-bet dans les MC était compatible avec une production accrue d'IFN-γ à partir de LPMCs MC. T-bet jouer un rôle essentiel dans l'induction de réponses immunitaires de type Th1 en MC .
  • 39. Qui régule l’augmentation de T-bet en MC?
  • 40. L'induction de T-bet dans les cellules CD4 + des PBMC humaines a été médiée par les anti-CD3, mais pas d'IL-12. la stimulation antigénique était essentiel pour l'induction de T-bet. L'induction de T-bet par anti- CD3 sur les CD4 + des PBMC n'était pas différente entre MC et la CU. La stimulations antigéniques répétées étaient essentielles pour maintenir une forte expression T-bet. l’ augmentation de l'expression de T-bet n'a été observée que dans CD4 + des LPMCs de patients atteints de MC.
  • 41. Quel est alors le rôle de T-bet dans l'induction de l'immunopathologie médiée par Th1 en MC ?
  • 42. IL-12 ne pouvait pas induire la production d'IFN-γ de CD4 + des PBMC qui n'ont pas exprimé T-bet. T-bet est nécessaire pour initier la production d'IFN-γ CD4 + des PBMC activés ont également augmentés l'IL-12Rβ2 et ils ont répondu à l'IL-12 pour une production supplémentaire de l'IFN-γ. T-bet est nécessaire pour pour réguler la réactivité de l'IL-12 par une régulation positive d’IL- 12Rβ2 dans MC