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Le matériel biologique et la
purification d'acides
nucléiques
Module : Micobiologie Moléculaire
Master 2 : Microbiologie appliquée
2021/2022
Réaliser par:
Boubekeur. H
Méthodes d’extraction et
de purification du matériel
génétiques.
Introduction
 La purification des acides nucléiques constitue l’étape
clé de toutes les études de génétique moléculaire.
 Selon le type d’acide nucléique (ADN ou ARN) et selon
le matériel de départ (cellules, organes,…) la première
étape a pour objectif l’extraction.
 Par la suite une série de méthodes adaptées au type
d’acides nucléiques (ADN génomiques ou plasmidiques, ou
ARN) est appliquée à l’extrait.
1. Extraction et purification des acides nucléiques
L’ADN (ou l’ARN) doit impérativement être purifié à partir de
matériels biologiques variés: cultures cellulaires, tissus divers dans des
conditions optimales de qualité et de quantité.
Dans la pratique, les acides nucléiques sont souvent extraits du sang
total. Le procédé classique est l’extraction par le couple phénol-
chloroforme.
Le phénol est un excellent agent dénaturant des protéines. Il est
ensuite éliminé par l’extraction avec du chloroforme (non miscible
avec l’eau). La séparation des phases aqueuse et organique peut se
faire par centrifugation. La phase aqueuse contient les acides
nucléiques
Les acides nucléiques peuvent être finalement récupérés sous forme
solide à la suite de précipitation par l’alcool éthylique ou par l’alcool
isopropylique
Extraction d’ADN à partir du sang
Faire éclater les globules rouges du sang par choc osmotique en le
mélangeant à une solution hypotonique.
Récupérer des globules blancs par centrifugation. Ajouter un mélange
de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de protéinase K ; le détergent détruira
les membranes et la protéinase digérera les protéines associées à l'ADN.
Extraire l'ADN des protéines par un mélange phénol-chloroforme.
Ajouter des sels pour augmenter la force ionique puis précipitation de
l'ADN par l'alcool éthylique absolu froid (-20°C).
L'ADN précipite sous forme de filaments, visibles à l’œil nu, qui sont
récupérés par enroulement sur une baguette de verre. Re-dissoudre
l'ADN dans une solution tamponnée. L'ADN peut être ainsi conservée à
4°C plus d'un an.
Remarque : la taille des fragments engendrés par les cassures
mécaniques au cours de cette extraction est supérieure à 20kB. Le
rendement de cette méthode est de quelques centaines de microgrammes
d'ADN pour 10 à 20 ml de sang..
Extraction de l’ADN
=technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus.
L'ADN extrait  digestion, hybridation (Southern blot),
séquençage, PCR, clonage…
Différents protocoles pour extraire l'ADN avec même schéma de
principe :
•Lyse des cellules
•Elimination des protéines
•Elimination des autres acides nucléiques (ARN...)
•Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool
Différentes variantes employées:
l'ADN génomique (issu du ou des chromosomes des cellules
analysées)
Ou
l'ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent
par des cellules bactériennes ).
Kits commerciaux  extractions rapides à l'aide de réactifs
prêts à l'emploi.
protéines dénaturées  précipité à
l'interface phénol-eau.
l'ADN en solution dans
aqueuse
la phase
Pour éliminer les ARNs Traitement par l’ARNase.
précipitation de l’ADN
=addition d'éthanol ou d'isopropanol
dans la phase aqueuse + sels
lyse des cellules ou des tissus
Solution très visqueuse
l'ADN: très longs filaments
s'opposant aux écoulements
hydrodynamiques.
L’ADN collecté/centrifugation
 dissous dans Tampon ou Eau pure.
Préparation d'ADN génomique
=broyage ou pas + extraction/détergents
Dé-protéinisation de la solution
=extraction / solvants organiques,
en général du phénol +/-chloroforme
•disperser les bicouches lipidiques des
membranes
•dénaturer les protéines srtt celles
associées à l'ADN dans la chromatine
EDTA inhibe les nucléases en
chélatant les ions Mg++ & Ca++
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
détergent anionique dénature les
lipoprotéines membranaires et les
enzymes lysosomiales et libère ainsi
l'ADN tout en préservant sa
structure.
9
Un traitement par la protéinase K
(une protéase) permet de libérer
l’ADN nucléaire en digérant les
histones qui lui sont associées dans
les chromosomes eucaryotes.
tampon sans pression osmotique,
faisant éclater les membranes
fermées
Le traitement au phénol, chloroforme (CHCL3 et Isoamyl-OH permet
de dénaturer les protéines car non miscible à l’eau et de densité
supérieure à cette dernière. Les acides nucléiques n'y sont pas non plus
solubles et restent dans le surnageant aqueux.
+EDTA
Phase organique:
le reste de phénol,
protéines, lipides…
Si la quantité d’acides nucléiques cibles est faible, un véhicule
inerte (tel que le glycogène) peut être ajouté au mélange afin
d’accroître l’efficacité de la précipitation.
Purification de l’ADN
Ethanol mobilise l’eau du milieu
& diminue la solubilité de l’ADN
Extraction de l’ARN
Extraire de l’ARN à partir de tissus ou cellules en culture des biopsies
(ex : de villosités choriales lors d'un diagnostic prénatal) ou cultures de
cellules).
Broyer le tissu dans un homogénéisateur de Potter avec une solution
adéquate (détergent SDS ou Sarcosyl + un agent dissociant + une
solution tampon + un agent réducteur). Centrifuger l'homogénat pour
éliminer les débris cellulaires.
L'extraction des ARN se fait : soit par précipitation différentielle de
l'ARN et de l'ADN / soit par ultracentrifugation sur coussin de
chlorure de césium (seul l'ARN peut, vue sa densité, traverser ce
coussin et être récupéré dans le culot
Laver l'ARN dans l'acétate de sodium et précipiter à l'alcool. L'ARN
peut être conservé plus d'un an soit sous forme précipitée dans
l'éthanol, soit sous forme congelée à -80°C .
Purification des ARNm à partir de ARN totaux
La majorité des ARNm eucaryotes possèdent une queue
polyadénylée (polyA) à son extrémité 3', utilisée pour purifier les
ARNm par affinité.
Passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinité dont les sites
de fixation sont des oligonucléotides polydT ou polyU. Les ARN
polyA sont retenus alors que les ARNt et ARNr non. Eluer les
ARNm et les récupérer par précipitation par l'alcool éthylique
absolu froid. On obtient ~50%d'ARN non polyA. Pour enrichir
en ARN polyA, repeter l’operation(repasser sur la colonne).
Extraction de l’ARN
L‘ARN extrait  hybridation (Northern blot), banques ADNc, RT-
PCR…
Différents critères pour extraire l‘ARN:
• Lyse cellulaire mécanique (congélation, billes de céramique ou
détergents) ou enzymatique (lysozyme)
• Protection des ARN de l’action des ARNases.
Inhiber
toute trace
d’ARNase
Pour une extraction ARN optimale
 Utilisation des gants pendant toute la manipulation
 Tubes et cônes (autoclavage)
 Nettoyer la paillasse et ces instruments
(pipettes…) avec une solution décontaminante
L’ARN est extrait grâce a une forte densité
de chlorure de cesium (CsCl) solution
 élimine l’ADN et polysaccharide.
+Phénol/Chlrf accélérer
la procédure d’extraction
beta2-mercaptoéthanol:
rupture des ponts
disulfures protéiques
GuSCN: agent
puissant de
dénaturation des
protéines: Lyse
Précipitation à l’Isopropanol
Lavage à l’ETOH 70%
Contient du:
Guanidine isothiocyanate
Phénol
+
Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules 
les ARN messagers = ARNm = classe la plus étudiée
se caractérisent par la présence du côté 3'-terminal
d'une longue queue poly(A) synthétisée à la phase
post-transcriptionnelle.
PURIFICATION
chromatographie d'affinité entre cette queue poly(A)
et une colonne dont la phase fixe est pourvue de
fragments d'oligo(dT) de quelques dizaines de
nucléotides qui peuvent s'hybrider avec les RNA poly(A).
ARNm
Queue poly A
5’ AAAAAAAAAAAA 3’
Liaison covalente
3’ TTTTTTTTTTTTT 5’
Oligo dT
Après avoir lavé la colonne en milieu alcalin
(potasse), on charge les RNA totaux à haute force
ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du
KCl 0,1 M.
Enfin, on élue la fraction retenue par la colonne en
abaissant la concentration de KCl à 0,01 M et en
élevant la température.
L’ARN poly A (ARNm) est élué dans de l’eau ou
conservé dans de l’ETOH (-20C)
NB: Oligo-dT: une courte séquence de deoxy-
thymine nucléotides
Kits d’extraction d’ARN poly A
Extraction de plasmide
• Petites molécules d’ADN habituellement circulaire
• Existant indépendamment des chromosomes de l’hôte
• Présents chez nombreuses bactéries (qques levures et
mycètes)
• A réplication autonome indépendamment des
chromosomes
• Portent un nombre de gènes très réduit (≤30)
• A information génétique non-essentielle pour l’hôte
• En nbr. variable:
Plasmide à copie unique
(1 seul/cellule hôte)
Plasmides à copies multiples
(40 ou + /cellule hôte)
• Parmi les techniques les plus courantes de la biologie moléculaire = noms
abrégés: miniprep, midiprep et maxiprep (volume de la culture
bactérienne).
• Préparation sélective de l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries,
tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien.
• kits commerciaux avec petites colonnes de résine chromatographique
échangeuse d'ion  améliorer la pureté de l'ADN.
Etape 1: Récolter les bactéries
transformées
Etapes 2.3.4: Lyser les structures
cellulaires et éliminer les grosses
molécules en utilisant de l’EDTA
fragilise la membrane bactérienne, la
RNase lyse les ARN, du SDS pour
dissoudre et dégradé la membrane
bactérienne, libérant ADN et protéines
dans la solution.
L’acétate de sodium précipite protéines
et ADN chromosomique. Ce précipité et
les débris cellulaires sont séparés par
centrifugation du surnageant qui
contient, entre autres, l’ADN
plasmidique.
Etape 5: Filtrer l’ADN plasmidique sur
une colonne de silice. La silice qui se fixe
dans la colonne présente un grande
affinité pour l’ADN et va pouvoir
l’adsorber au cours de la filtration.
1
2.3.4
5
Etape 6: Purifier par lavage l’ADN
adsorbé. L’éthanol contenu dans la
solution de lavage va dissoudre et
libérer la majorité des molécules
adsorbées dans la colonne à
l’exception de l’ADN plasmidique
insoluble dans l’éthanol.
Etape 7: Recueillir l’ADN
plasmidique par élution
(= séparation) dans de l’eau ou un
tampon d’élution
6
7
Dosage et conservation
Estimation des quantités d’adn.
Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un
matériel biologique.
1- Méthode basée sur la fluorescence
Le principe est un fluorochrome qui se fixe sur le DNA et dont le taux de
fixation est directement lié a la quantité de DNA émettra une quantité de
fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de DNA présente.
- Les différents fluorochromes:
-Se fixant spécifiquement sur des paires de bases:
Bases A-T: Hoechst 33258 et DAPI( 4 ‘-6-Diamidino-2-
Phenylindole)
Bases G-C: mithramycine
Différences principales entre les colorants Hoechst et DAPI :
 les colorants Hoechst sont moins toxiques que le DAP ;
 les colorants Hoechst possèdent un groupe éthyle leur permettant de
traverser plus librement les membranes cellulaires
Les colorants Hoechst font partie de la famille des colorants à l'aide
de marqueurs fluorescents utilisés pour marquer l'ADN.
Ces composés, de la famille des bisbenzimides, ont été initialement développés
par l’entreprise Hoechst qui numérotait ses créations.
Il existe trois composés similaires de coloration de l'ADN :
le Hoechst 33258, le Hoechst 33342 et le Hoechst 34580.
Les colorants Hoechst 33258 et Hoechst 33342 sont les plus fréquents et
possèdent des spectres d'excitation/émission similaires.
Le Hoechst 33342 a une perméabilité cellulaire dix fois plus grande que le
H33258.
Ils sont potentiellement mutagènes et cancérigènes,
On utilise souvent les colorants Hoechst pour colorer l'ADN génomique
dans les cas suivants :
• en microscopie à fluorescence et immunohistochimie
(L'immunohistochimie (IHC) est une méthode de localisation
de protéines dans les cellules d'une coupe de tissu, par la détection
d'antigènes au moyen d'anticorps )
• en cytométrie en flux pour compter le nombre de cellules dans les
différentes phase du cycle cellulaire
• pour la visualisation d'ADN en présence d'ARN dans les gels d'agarose
• pour la détection et la quantification automatique de l'ADN dans un
échantillon
• pour le tri de chromosome
- Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine
orange ( qui ont l'avantage d'être moins chers )
2- Méthode basée sur la spectrophotométrie
Le dosage s’effectue par spectrophotométrie dans l’ultra-violet à 260 nm.
Il est indispensable de mesurer également l’absorption à 280 nm. Cette
dernière longueur d’onde permet d’estimer la contamination éventuelle de
l’extrait par des protéines.
L’absorption se définit par l’unité de densité optique mesurée à 260 nm.
Une unité de densité optique correspond à l’absorption d’une solution
d’ADN double brin à la concentration de 50 µg/ml ou à l’absorption d’une
solution d’ADN simple brin à la concentration de 25 µg/ml.
Le maximum
d'absorption des
acides nucléiques se
situe à 260 nm.
L’ADN pur: R ≈ 1.8
L’ARN pur: R ≈ 2.0
 Les protéines ont un maximum d'absorption qui se situe vers 280 nm à
cause des acides aminés aromatiques.
 Le rapport R = A260nm/A280nm constitue alors un bon moyen pour
apprécier une éventuelle contamination de la préparation d'ADN ou ARN
par les protéines.
Qualité de l’ARN:
Electrophorèse sur
gel d’agarose
dénaturant
Séparation des acides nucléiques
La centrifugation est une technique de séparation rapide des particules
solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes).
Une suspension de macromolécules peut éventuellement laisser
sédimenter celles-ci sous l'effet du champ de pesanteur. Cependant,
l'agitation thermique met en œuvre des énergies bien supérieures à
l'énergie potentielle de gravitation, pour une macromolécule se déplaçant
sur quelques centimètres.
Pour rendre possible la séparation, il faut travailler avec de très grandes
accélérations. Ceci est possible avec des centrifugeuses ou
ultracentrifugeuses. Ces appareils, sont composés des éléments suivants:
- un moteur capable de tourner à plusieurs dizaine de milliers de tours
par minute
- un rotor, capable de supporter des rotations aussi rapides
- une enceinte dans laquelle est disposé le rotor, qui est réfrigérée
1-Ultracentrifugation
A des vitesses de l'ordre de 20 000 tours/minute, il est possible de :
- séparer les constituants cellulaires (membranes/cytosol) sous un champ
supérieur à 100 000 g entre des couches de saccharose de différentes
densités.
- séparer différents types A.D.N. (chromosomique et plasmidique) dans
un gradient de chlorure de césium.
La vitesse de déplacement des molécules est exprimée en Svedberg.
S=10-13 secondes.
2-L’ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL
Le réseau de mailles constituant le gel forme un tamis moléculaire à
l’intérieur duquel les molécules d’ADN migrent.
La taille des mailles varie selon la concentration d’agarose
 L’électrophorèse permet donc de séparer les fragments
d’ADN en fonction de leur taille.
L’électrophorèse des fragments d’ADN en gel d’agarose permet des
séparations jusqu’à 20-25 kb (20000-25000 pb). Le tampon utilisé pour la
migration électrophorétique a un pH basique (par exemple: 8,3 dans le cas
du tampon appelé TBE = Tris-Borate-EDTA).
Des fragments d’ADN de taille restreinte (inférieure à 1000 paires de
bases) peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
La détermination précise des tailles des fragments séparés par
électrophorèse est effectuée en faisant migrer des marqueurs de poids
moléculaire en parallèle avec les échantillons à analyser. La détection de
l’ADN sur ce type de gel est réalisée par exposition aux rayons UV après
réaction avec un réactif spécifique (bromure d’éthidium par exemple,
agent s’intercalant entre les brins d’ADN).
Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double
brin, selon la concentration d'agarose du gel
Concentration d’agarose
(% en M/V)
Gamme de tailles idéales
(en kb)
0.3 5 - 60
0.6 1 - 20
0.7 0.8 - 10
0.9 0.5 - 7
1.2 0.4 – 6
1.5 0.2 - 3
2.0 0.1 - 2
Le matériel génétique (ADN, ARN, plasmide…) est
chargé négativement, il migre vers le pôle positif
Les différents types d'électrophorèse permettent de
séparer les acides nucléiques en fonction de leur taille:
 L'électrophorèse horizontale sur gel d'agarose permet de
séparer les fragments d'ADN de 50 à 10 000 paires de bases en
fonction de la concentration du gel en agarose.
 L'électrophorèse verticale sur gel de polyacrilamide (PAGE, poly-
acrylamide gel electrophoresis) permet de séparer les fragments
d'ADN dont les longueurs vont de 1 à 1 000 nucléotides. Ex.
séquençage
 L’électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé (PFGE) permet
de séparer des fragments d'ADN double brin dont la taille peut
varier de 220 000 à 2 500 000 paires de bases. (PFGE pour Pulsed
Field Gel Electrophoresis). Le support d’électrophorèse est
constitué par de l’agarose et on applique au gel un champ électrique
de nature variable.
Ainsi, le champ électrique peut être appliqué dans une
direction donnée pendant 1 minute puis dans une direction
perpendiculaire au champ précédent pendant une minute et
ainsi de suite. Le processus de réorientation des
macromolécules dans le champ électrique dépend de leur taille
Suivi de la migration.
Les échantillons d'ADN, avant d'être déposés dans les puits, sont
mélangés avec une solution de charge qui contient:
 Un alourdisseur (glycérol ou saccharose ) pour entraïner l'ADN au fond
du Puits.
 Des marqueurs de mobilité (colorants visibles : bleu de bromophénol et
xylène cyanol).
 Des marqueurs de taille pour l’identification (dans le puits de
référence).
Les deux marqueurs (colorants) migrent à des vitesses différentes.
 Le bleu de bromophénol (violet ) migre avec les fragments de petites
tailles (donc plus vite )
 alors que le xylène cyanol (bleu turquoise ) migre avec les fragments de
grande taille.
On peut ainsi suivre indirectement la migration de l'ADN sur le gel.
Le BET est un produit hautement mutagène/
carcinogène, donc il doit être manipulé avec
beaucoup de soins.
Révélation:
Les bandes d'ADN sur un gel de polyacrylamide ou
d'agarose ne sont pas visibles si l'ADN n'est pas
marqué ou coloré.
 Une méthode sensible de coloration de l'ADN consiste à
plonger le gel après électrophorèse dans du bromure
d'éthidium (BET ou EtBr) un intercalent de l’ADN qui devient
cent fois plus fluorescent sous illumination ultra-violette
lorsqu'il est lié à l'ADN.
Gel agarose Bromure d’ethidium/lampe UV
Photographie de gel après migration
Marqueur de taille
(DNA ladder)
3 kb
2.5 kb
2 kb
1 kb
300 pb
200 pb
100 pb
50 pb
Digestion d’ADN par EcoRI
puis séparation des fragments
de restriction par
électrophorèse

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  • 1. Le matériel biologique et la purification d'acides nucléiques Module : Micobiologie Moléculaire Master 2 : Microbiologie appliquée 2021/2022 Réaliser par: Boubekeur. H
  • 2. Méthodes d’extraction et de purification du matériel génétiques.
  • 3. Introduction  La purification des acides nucléiques constitue l’étape clé de toutes les études de génétique moléculaire.  Selon le type d’acide nucléique (ADN ou ARN) et selon le matériel de départ (cellules, organes,…) la première étape a pour objectif l’extraction.  Par la suite une série de méthodes adaptées au type d’acides nucléiques (ADN génomiques ou plasmidiques, ou ARN) est appliquée à l’extrait.
  • 4. 1. Extraction et purification des acides nucléiques L’ADN (ou l’ARN) doit impérativement être purifié à partir de matériels biologiques variés: cultures cellulaires, tissus divers dans des conditions optimales de qualité et de quantité. Dans la pratique, les acides nucléiques sont souvent extraits du sang total. Le procédé classique est l’extraction par le couple phénol- chloroforme. Le phénol est un excellent agent dénaturant des protéines. Il est ensuite éliminé par l’extraction avec du chloroforme (non miscible avec l’eau). La séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucléiques Les acides nucléiques peuvent être finalement récupérés sous forme solide à la suite de précipitation par l’alcool éthylique ou par l’alcool isopropylique
  • 5. Extraction d’ADN à partir du sang Faire éclater les globules rouges du sang par choc osmotique en le mélangeant à une solution hypotonique. Récupérer des globules blancs par centrifugation. Ajouter un mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de protéinase K ; le détergent détruira les membranes et la protéinase digérera les protéines associées à l'ADN. Extraire l'ADN des protéines par un mélange phénol-chloroforme. Ajouter des sels pour augmenter la force ionique puis précipitation de l'ADN par l'alcool éthylique absolu froid (-20°C). L'ADN précipite sous forme de filaments, visibles à l’œil nu, qui sont récupérés par enroulement sur une baguette de verre. Re-dissoudre l'ADN dans une solution tamponnée. L'ADN peut être ainsi conservée à 4°C plus d'un an. Remarque : la taille des fragments engendrés par les cassures mécaniques au cours de cette extraction est supérieure à 20kB. Le rendement de cette méthode est de quelques centaines de microgrammes d'ADN pour 10 à 20 ml de sang..
  • 6. Extraction de l’ADN =technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN extrait  digestion, hybridation (Southern blot), séquençage, PCR, clonage… Différents protocoles pour extraire l'ADN avec même schéma de principe : •Lyse des cellules •Elimination des protéines •Elimination des autres acides nucléiques (ARN...) •Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool
  • 7. Différentes variantes employées: l'ADN génomique (issu du ou des chromosomes des cellules analysées) Ou l'ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent par des cellules bactériennes ). Kits commerciaux  extractions rapides à l'aide de réactifs prêts à l'emploi.
  • 8. protéines dénaturées  précipité à l'interface phénol-eau. l'ADN en solution dans aqueuse la phase Pour éliminer les ARNs Traitement par l’ARNase. précipitation de l’ADN =addition d'éthanol ou d'isopropanol dans la phase aqueuse + sels lyse des cellules ou des tissus Solution très visqueuse l'ADN: très longs filaments s'opposant aux écoulements hydrodynamiques. L’ADN collecté/centrifugation  dissous dans Tampon ou Eau pure. Préparation d'ADN génomique =broyage ou pas + extraction/détergents Dé-protéinisation de la solution =extraction / solvants organiques, en général du phénol +/-chloroforme •disperser les bicouches lipidiques des membranes •dénaturer les protéines srtt celles associées à l'ADN dans la chromatine
  • 9. EDTA inhibe les nucléases en chélatant les ions Mg++ & Ca++ SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) détergent anionique dénature les lipoprotéines membranaires et les enzymes lysosomiales et libère ainsi l'ADN tout en préservant sa structure. 9 Un traitement par la protéinase K (une protéase) permet de libérer l’ADN nucléaire en digérant les histones qui lui sont associées dans les chromosomes eucaryotes. tampon sans pression osmotique, faisant éclater les membranes fermées
  • 10. Le traitement au phénol, chloroforme (CHCL3 et Isoamyl-OH permet de dénaturer les protéines car non miscible à l’eau et de densité supérieure à cette dernière. Les acides nucléiques n'y sont pas non plus solubles et restent dans le surnageant aqueux. +EDTA Phase organique: le reste de phénol, protéines, lipides…
  • 11. Si la quantité d’acides nucléiques cibles est faible, un véhicule inerte (tel que le glycogène) peut être ajouté au mélange afin d’accroître l’efficacité de la précipitation. Purification de l’ADN Ethanol mobilise l’eau du milieu & diminue la solubilité de l’ADN
  • 12. Extraction de l’ARN Extraire de l’ARN à partir de tissus ou cellules en culture des biopsies (ex : de villosités choriales lors d'un diagnostic prénatal) ou cultures de cellules). Broyer le tissu dans un homogénéisateur de Potter avec une solution adéquate (détergent SDS ou Sarcosyl + un agent dissociant + une solution tampon + un agent réducteur). Centrifuger l'homogénat pour éliminer les débris cellulaires. L'extraction des ARN se fait : soit par précipitation différentielle de l'ARN et de l'ADN / soit par ultracentrifugation sur coussin de chlorure de césium (seul l'ARN peut, vue sa densité, traverser ce coussin et être récupéré dans le culot Laver l'ARN dans l'acétate de sodium et précipiter à l'alcool. L'ARN peut être conservé plus d'un an soit sous forme précipitée dans l'éthanol, soit sous forme congelée à -80°C .
  • 13. Purification des ARNm à partir de ARN totaux La majorité des ARNm eucaryotes possèdent une queue polyadénylée (polyA) à son extrémité 3', utilisée pour purifier les ARNm par affinité. Passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinité dont les sites de fixation sont des oligonucléotides polydT ou polyU. Les ARN polyA sont retenus alors que les ARNt et ARNr non. Eluer les ARNm et les récupérer par précipitation par l'alcool éthylique absolu froid. On obtient ~50%d'ARN non polyA. Pour enrichir en ARN polyA, repeter l’operation(repasser sur la colonne).
  • 14. Extraction de l’ARN L‘ARN extrait  hybridation (Northern blot), banques ADNc, RT- PCR… Différents critères pour extraire l‘ARN: • Lyse cellulaire mécanique (congélation, billes de céramique ou détergents) ou enzymatique (lysozyme) • Protection des ARN de l’action des ARNases.
  • 15. Inhiber toute trace d’ARNase Pour une extraction ARN optimale  Utilisation des gants pendant toute la manipulation  Tubes et cônes (autoclavage)  Nettoyer la paillasse et ces instruments (pipettes…) avec une solution décontaminante
  • 16. L’ARN est extrait grâce a une forte densité de chlorure de cesium (CsCl) solution  élimine l’ADN et polysaccharide. +Phénol/Chlrf accélérer la procédure d’extraction beta2-mercaptoéthanol: rupture des ponts disulfures protéiques GuSCN: agent puissant de dénaturation des protéines: Lyse
  • 17. Précipitation à l’Isopropanol Lavage à l’ETOH 70% Contient du: Guanidine isothiocyanate Phénol +
  • 18. Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules  les ARN messagers = ARNm = classe la plus étudiée se caractérisent par la présence du côté 3'-terminal d'une longue queue poly(A) synthétisée à la phase post-transcriptionnelle. PURIFICATION chromatographie d'affinité entre cette queue poly(A) et une colonne dont la phase fixe est pourvue de fragments d'oligo(dT) de quelques dizaines de nucléotides qui peuvent s'hybrider avec les RNA poly(A).
  • 19. ARNm Queue poly A 5’ AAAAAAAAAAAA 3’ Liaison covalente 3’ TTTTTTTTTTTTT 5’ Oligo dT
  • 20. Après avoir lavé la colonne en milieu alcalin (potasse), on charge les RNA totaux à haute force ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0,1 M. Enfin, on élue la fraction retenue par la colonne en abaissant la concentration de KCl à 0,01 M et en élevant la température. L’ARN poly A (ARNm) est élué dans de l’eau ou conservé dans de l’ETOH (-20C) NB: Oligo-dT: une courte séquence de deoxy- thymine nucléotides
  • 23. • Petites molécules d’ADN habituellement circulaire • Existant indépendamment des chromosomes de l’hôte • Présents chez nombreuses bactéries (qques levures et mycètes) • A réplication autonome indépendamment des chromosomes • Portent un nombre de gènes très réduit (≤30) • A information génétique non-essentielle pour l’hôte • En nbr. variable: Plasmide à copie unique (1 seul/cellule hôte) Plasmides à copies multiples (40 ou + /cellule hôte)
  • 24.
  • 25. • Parmi les techniques les plus courantes de la biologie moléculaire = noms abrégés: miniprep, midiprep et maxiprep (volume de la culture bactérienne). • Préparation sélective de l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. • kits commerciaux avec petites colonnes de résine chromatographique échangeuse d'ion  améliorer la pureté de l'ADN.
  • 26. Etape 1: Récolter les bactéries transformées Etapes 2.3.4: Lyser les structures cellulaires et éliminer les grosses molécules en utilisant de l’EDTA fragilise la membrane bactérienne, la RNase lyse les ARN, du SDS pour dissoudre et dégradé la membrane bactérienne, libérant ADN et protéines dans la solution. L’acétate de sodium précipite protéines et ADN chromosomique. Ce précipité et les débris cellulaires sont séparés par centrifugation du surnageant qui contient, entre autres, l’ADN plasmidique. Etape 5: Filtrer l’ADN plasmidique sur une colonne de silice. La silice qui se fixe dans la colonne présente un grande affinité pour l’ADN et va pouvoir l’adsorber au cours de la filtration. 1 2.3.4 5
  • 27. Etape 6: Purifier par lavage l’ADN adsorbé. L’éthanol contenu dans la solution de lavage va dissoudre et libérer la majorité des molécules adsorbées dans la colonne à l’exception de l’ADN plasmidique insoluble dans l’éthanol. Etape 7: Recueillir l’ADN plasmidique par élution (= séparation) dans de l’eau ou un tampon d’élution 6 7
  • 28. Dosage et conservation Estimation des quantités d’adn. Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un matériel biologique. 1- Méthode basée sur la fluorescence Le principe est un fluorochrome qui se fixe sur le DNA et dont le taux de fixation est directement lié a la quantité de DNA émettra une quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de DNA présente. - Les différents fluorochromes: -Se fixant spécifiquement sur des paires de bases: Bases A-T: Hoechst 33258 et DAPI( 4 ‘-6-Diamidino-2- Phenylindole) Bases G-C: mithramycine
  • 29. Différences principales entre les colorants Hoechst et DAPI :  les colorants Hoechst sont moins toxiques que le DAP ;  les colorants Hoechst possèdent un groupe éthyle leur permettant de traverser plus librement les membranes cellulaires Les colorants Hoechst font partie de la famille des colorants à l'aide de marqueurs fluorescents utilisés pour marquer l'ADN. Ces composés, de la famille des bisbenzimides, ont été initialement développés par l’entreprise Hoechst qui numérotait ses créations. Il existe trois composés similaires de coloration de l'ADN : le Hoechst 33258, le Hoechst 33342 et le Hoechst 34580. Les colorants Hoechst 33258 et Hoechst 33342 sont les plus fréquents et possèdent des spectres d'excitation/émission similaires. Le Hoechst 33342 a une perméabilité cellulaire dix fois plus grande que le H33258. Ils sont potentiellement mutagènes et cancérigènes,
  • 30. On utilise souvent les colorants Hoechst pour colorer l'ADN génomique dans les cas suivants : • en microscopie à fluorescence et immunohistochimie (L'immunohistochimie (IHC) est une méthode de localisation de protéines dans les cellules d'une coupe de tissu, par la détection d'antigènes au moyen d'anticorps ) • en cytométrie en flux pour compter le nombre de cellules dans les différentes phase du cycle cellulaire • pour la visualisation d'ADN en présence d'ARN dans les gels d'agarose • pour la détection et la quantification automatique de l'ADN dans un échantillon • pour le tri de chromosome - Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui ont l'avantage d'être moins chers )
  • 31. 2- Méthode basée sur la spectrophotométrie Le dosage s’effectue par spectrophotométrie dans l’ultra-violet à 260 nm. Il est indispensable de mesurer également l’absorption à 280 nm. Cette dernière longueur d’onde permet d’estimer la contamination éventuelle de l’extrait par des protéines. L’absorption se définit par l’unité de densité optique mesurée à 260 nm. Une unité de densité optique correspond à l’absorption d’une solution d’ADN double brin à la concentration de 50 µg/ml ou à l’absorption d’une solution d’ADN simple brin à la concentration de 25 µg/ml.
  • 32. Le maximum d'absorption des acides nucléiques se situe à 260 nm.
  • 33. L’ADN pur: R ≈ 1.8 L’ARN pur: R ≈ 2.0  Les protéines ont un maximum d'absorption qui se situe vers 280 nm à cause des acides aminés aromatiques.  Le rapport R = A260nm/A280nm constitue alors un bon moyen pour apprécier une éventuelle contamination de la préparation d'ADN ou ARN par les protéines.
  • 34. Qualité de l’ARN: Electrophorèse sur gel d’agarose dénaturant
  • 35. Séparation des acides nucléiques
  • 36. La centrifugation est une technique de séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes). Une suspension de macromolécules peut éventuellement laisser sédimenter celles-ci sous l'effet du champ de pesanteur. Cependant, l'agitation thermique met en œuvre des énergies bien supérieures à l'énergie potentielle de gravitation, pour une macromolécule se déplaçant sur quelques centimètres. Pour rendre possible la séparation, il faut travailler avec de très grandes accélérations. Ceci est possible avec des centrifugeuses ou ultracentrifugeuses. Ces appareils, sont composés des éléments suivants: - un moteur capable de tourner à plusieurs dizaine de milliers de tours par minute - un rotor, capable de supporter des rotations aussi rapides - une enceinte dans laquelle est disposé le rotor, qui est réfrigérée 1-Ultracentrifugation
  • 37. A des vitesses de l'ordre de 20 000 tours/minute, il est possible de : - séparer les constituants cellulaires (membranes/cytosol) sous un champ supérieur à 100 000 g entre des couches de saccharose de différentes densités. - séparer différents types A.D.N. (chromosomique et plasmidique) dans un gradient de chlorure de césium. La vitesse de déplacement des molécules est exprimée en Svedberg. S=10-13 secondes.
  • 38. 2-L’ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL Le réseau de mailles constituant le gel forme un tamis moléculaire à l’intérieur duquel les molécules d’ADN migrent.
  • 39. La taille des mailles varie selon la concentration d’agarose  L’électrophorèse permet donc de séparer les fragments d’ADN en fonction de leur taille.
  • 40. L’électrophorèse des fragments d’ADN en gel d’agarose permet des séparations jusqu’à 20-25 kb (20000-25000 pb). Le tampon utilisé pour la migration électrophorétique a un pH basique (par exemple: 8,3 dans le cas du tampon appelé TBE = Tris-Borate-EDTA). Des fragments d’ADN de taille restreinte (inférieure à 1000 paires de bases) peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La détermination précise des tailles des fragments séparés par électrophorèse est effectuée en faisant migrer des marqueurs de poids moléculaire en parallèle avec les échantillons à analyser. La détection de l’ADN sur ce type de gel est réalisée par exposition aux rayons UV après réaction avec un réactif spécifique (bromure d’éthidium par exemple, agent s’intercalant entre les brins d’ADN).
  • 41. Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel Concentration d’agarose (% en M/V) Gamme de tailles idéales (en kb) 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 – 6 1.5 0.2 - 3 2.0 0.1 - 2
  • 42. Le matériel génétique (ADN, ARN, plasmide…) est chargé négativement, il migre vers le pôle positif
  • 43. Les différents types d'électrophorèse permettent de séparer les acides nucléiques en fonction de leur taille:  L'électrophorèse horizontale sur gel d'agarose permet de séparer les fragments d'ADN de 50 à 10 000 paires de bases en fonction de la concentration du gel en agarose.  L'électrophorèse verticale sur gel de polyacrilamide (PAGE, poly- acrylamide gel electrophoresis) permet de séparer les fragments d'ADN dont les longueurs vont de 1 à 1 000 nucléotides. Ex. séquençage  L’électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé (PFGE) permet de séparer des fragments d'ADN double brin dont la taille peut varier de 220 000 à 2 500 000 paires de bases. (PFGE pour Pulsed Field Gel Electrophoresis). Le support d’électrophorèse est constitué par de l’agarose et on applique au gel un champ électrique de nature variable.
  • 44. Ainsi, le champ électrique peut être appliqué dans une direction donnée pendant 1 minute puis dans une direction perpendiculaire au champ précédent pendant une minute et ainsi de suite. Le processus de réorientation des macromolécules dans le champ électrique dépend de leur taille
  • 45. Suivi de la migration. Les échantillons d'ADN, avant d'être déposés dans les puits, sont mélangés avec une solution de charge qui contient:  Un alourdisseur (glycérol ou saccharose ) pour entraïner l'ADN au fond du Puits.  Des marqueurs de mobilité (colorants visibles : bleu de bromophénol et xylène cyanol).  Des marqueurs de taille pour l’identification (dans le puits de référence). Les deux marqueurs (colorants) migrent à des vitesses différentes.  Le bleu de bromophénol (violet ) migre avec les fragments de petites tailles (donc plus vite )  alors que le xylène cyanol (bleu turquoise ) migre avec les fragments de grande taille. On peut ainsi suivre indirectement la migration de l'ADN sur le gel.
  • 46. Le BET est un produit hautement mutagène/ carcinogène, donc il doit être manipulé avec beaucoup de soins. Révélation: Les bandes d'ADN sur un gel de polyacrylamide ou d'agarose ne sont pas visibles si l'ADN n'est pas marqué ou coloré.  Une méthode sensible de coloration de l'ADN consiste à plonger le gel après électrophorèse dans du bromure d'éthidium (BET ou EtBr) un intercalent de l’ADN qui devient cent fois plus fluorescent sous illumination ultra-violette lorsqu'il est lié à l'ADN.
  • 47.
  • 48. Gel agarose Bromure d’ethidium/lampe UV Photographie de gel après migration Marqueur de taille (DNA ladder) 3 kb 2.5 kb 2 kb 1 kb 300 pb 200 pb 100 pb 50 pb
  • 49. Digestion d’ADN par EcoRI puis séparation des fragments de restriction par électrophorèse