Métabolomique Congrès SJBM 2013 Marseille

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Présentation de la Métabolomique par Didier Heintz lors du Congrès 2013 du Syndicat des Jeunes Biologistes à Marseille

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Métabolomique Congrès SJBM 2013 Marseille

  1. 1. Métabolomique : Concept et perspectives Dimitri Heintz SJBM 1412 2013 1
  2. 2. Activité • Plateforme Métabolomique • Petites molécules bioactives • Chromatographie • Spectrométrie de masse SJBM 1412 2013 2
  3. 3. Plan • Définitions • Les outils de la métabolomique • L’identification des métabolites et Le problème des banques de données • Applications • L’imagerie métabolique par spectrométrie de masse 03/09/2013 3
  4. 4. Définitions • Métabolome: ensemble des constituants de faible masse moléculaires d’une cellule ou d’un organisme. Apparu à la fin des années 1990 • Métabolomique: analyse de l’ensemble des constituants de faible masse moléculaires d’une cellule ou d’un organisme. • Fluxomique: analyse de l’ensemble des flux métaboliques au sein d’une cellule ou d’un organisme 03/09/2013 4
  5. 5. Définition de la métabolomique • La métabolomique: l’analyse de l’ensemble des molécules de petite masse moléculaire (une limite arbitraire est fixée à 1000 ou 3 000 uma) d’un système biologique. 03/09/2013 5
  6. 6. Les différentes approches métabolomiques On peut distinguer deux grands niveaux d’analyses complémentaires : • Les analyses dites ciblées • Les analyses dites globales 03/09/2013 6
  7. 7. Le profilage métabolique Il s’agit ici d’analyser tous les composés appartenant à une voie métabolique ou à une famille chimique donnée. Ce type d’approche a pour but une meilleure compréhension de la fonction ou de la régulation d’une voie métabolique et/ou de ses liens avec les autres voies métaboliques. Elle cherche ainsi à comparer des profils ou des empreintes de métabolites qui sont modifiés en réponse à une pathologie ou à une exposition à un toxique, mais l’identification et la quantification absolue des métabolites modifiés ne sont pas recherchées cherche à donner une signification biologique aux variations observées. 03/09/2013 7
  8. 8. L’analyse ciblée Elle a pour objet de mesurer quantitativement et spécifiquement un ou un nombre réduit de Métabolite Les analyses effectuées dans ce cadre sont quantitatives, précises et sensibles et s’apparentent à des dosages en milieu biologique classique. 03/09/2013 8
  9. 9. Les étapes majeures Préparation des échantillons • Extraction protocol • Derivatizations l’analyse des échantillons • Suitable analytical methods, LOD • Reproducible analytical protocol, • Data collections and storage Analyse des données • Data deconvolution software • Software development • Bioinformatique • Identification of up/down regulated compounds • Major bottleneck • Databases, for new compounds “de novo” 03/09/2013 9
  10. 10. The cycle of the metabolomics workflow. 03/09/2013 10
  11. 11. Métabolites et métabolome 03/09/2013 11
  12. 12. Métabolomique en clinique 03/09/2013 12
  13. 13. Métabolomique clinique • > 95 % des essais cliniques, diagnostic, sont des petites molécules • 89% des médicaments sont des petites molécules • 50% des médicaments sont des dérivés de métabolites • 30% des maladies sont des maladies du métabolisme • Métabolites sont des entités fonctionnelles, des cofacteurs et jouent des rôles dans la signalisation de > 1000 protéines chez l’homme 03/09/2013 13
  14. 14. Les outils de la métabolomique 03/09/2013 14
  15. 15. Acquisition des empreintes métaboliques 03/09/2013 15
  16. 16. Déroulement d’une analyse métabolomique 03/09/2013 16
  17. 17. Le problème en métabolomique c’est l’absence de banques données de petites moléculues Gène ID, abondance des transcrits Protéine ID, concentration Métabolite ID, concentration 03/09/2013 17
  18. 18. Principales bases de données métabolomique 03/09/2013 18
  19. 19. The human Metabolome project • http://www.hmdb.ca/ • Genome Canada Project lancé en janvier 2005 7.5 Millions de $ • Objectifs: recenser et quantifier les différents métabolites des tissus et biofuides • (urine, plasma, LCR) • Déterminer Les empreintes métaboliques pour: chaque patient/maladie/sexe/age/ • Développement d’outils et de technologies et de protocoles for l’analyse quantitative en métabolomique • Création d’une banque de métabolites 03/09/2013 19
  20. 20. 03/09/2013 20
  21. 21. 7000 03/09/2013 21
  22. 22. Human metabolome 41519 métabolites en septembre 2013 3100 1600 28000 1800 7000 03/09/2013 22
  23. 23. Plusieurs variables & plusieurs métabolites 03/09/2013 23
  24. 24. Pourquoi une base de données En spectrométrie de masse l’ionisation est variable d’un instrument à un autre donc pas possible d’avoir une seule banque unique Exception: la GC-MS mais pas très sensible /à la LC-MS/MS 03/09/2013 24
  25. 25. 03/09/2013 25
  26. 26. 03/09/2013 26
  27. 27. Plan • Définition: imagerie in situ par spectrométrie de masse • Principe • Préparation de l’échantillon, la coupe histologique (étape clés) • Applications: – Surface de tissus animaux / humain – Surface de tissus végétaux – Autres surfaces (biologique ou non, boues, plastique…) SJBM 1412 2013 27
  28. 28. Les Métabolomes Chaque type cellulaire a son Métabolome Histologie de l'appareil respiratoire: portion de poumon Bronches (BR), artère pulmonaire (A), bronciole (br) SJBM 1412 2013 28
  29. 29. La Problématique de la Métabolomique sur les tissus Histologie de l'appareil respiratoire Métabolome B Métabolome A Métabolomes C Métabolome D, E… Metabolomique « classique » Extraction/ broyage/biopsie… Plusieurs Métabolomes sont mélangés Difficile de trouver un marquer spécifique dans ces conditions SJBM 1412 2013 29
  30. 30. L’imagerie in situ par spectrométrie de masse • Technologie émergente • possibilité d’identifier des molécules sur des échantillons solides • Permet d’analyser directement des molécules à la surface des tissus sans marquage • Les molécules:  Métabolites  Médicaments  Protéines  Peptides  Lipides  tRNA  RNAs • Permet de déterminer la distribution spatiale et temporelle de molécules dans des tissus • Résolution spatiale max (5µm ) SJBM 1412 2013 30
  31. 31. Imagerie in situ par spectrométrie de masse Nombre de publications /an 120 100 80 Plantes 60 40 humain 20 Souris/rat 0 2000 2000 2005 2010 2012 Article pionnier: Caprioli RM et al Anal. Chem (1997) Ancêtre: Hillenkamp F el al Appl. Phys. A: Mater. Sci. Process (1975) Stoeckli, M., Chaurand, P., Hallahan, D. E., and Caprioli, R. M. (2001) Imaging mass spectrometry: a new technology for the analysis of protein expression in mammalian tissues. Nat. Med. 7, 493–496 Chaurand, P., Schwartz, S. A., and Caprioli, R. M. (2002) Imaging mass spectrometry: a new tool to investigate the spatial organization of peptides and proteins in mammalian tissue sections. Curr. Opin. Chem. Biol.6, 676–681 Fournier, I., Day, R., and Salzet, M. (2003) Direct analysis of neuropeptides by in situ MALDI-TOF mass spectrometry in the rat brain. Neuro Endocrinol.Lett. 24, 9–14 SJBM 1412 2013 31
  32. 32. imagerie in situ par spectrométrie de masse • Identification-spatiotemporelle de molécules dans des tissus biologiques Image moléculaire • • • • • • Identification de plusieurs molécules dans une même analyse Identification de molécules dans un organisme entier ou dans un organe Couplage possible avec la microscopie classique Compatible avec les techniques histologiques (oui en Protéomique) Compatible avec les méthodes Protéomiques & Métabolomiques Obtention d’images moléculaires > 100 Mbytes / Gbytes/échantillon SJBM 1412 2013 32
  33. 33. Il existe différentes méthodologies d’imagerie in situ par spectrométrie de masse • – – – MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) SIMS (secondary ion mass spectrometry) DESI (Desorption electrospray Ionization) Mobilité ionique (à suivre) 1 2 3 SJBM 1412 2013 33
  34. 34. MALDI: technique d’ionisation très sensible SJBM 1412 2013 34
  35. 35. Sensibilité de l’imagerie par spectrométrie de masse IM-FTICR MALDI Imaging IM-MS/MS ? SJBM 1412 2013 35
  36. 36. Préparation de l’échantillon(étape clés) • la coupe histologique • Le dépôt de la matrice Les molécules s’ionisent 1 preparation 4 Congélation / inclusion… 2 3 Air brush pistol MALDI matrix preparation (SA, DHB or HCCA) Cryo-microtome Cryosections (8-12µm) SJBM 1412 2013 Matrix coated section (8-12µm) 36
  37. 37. L’ionisation en MALDI Imaging • Il y aura transformation des molécules en ions • on va mesurer la masse exacte des ions pour identifier finement les molécules • Le choix de la matrice est un point clés SJBM 1412 2013 37
  38. 38. Préparation de l’échantillon(étape clés) SJBM 1412 2013 38
  39. 39. Comment obtenir une image moléculaire par MALDI imaging? Image moléculaire SJBM 1412 2013 39
  40. 40. Comment obtenir une image moléculaire • Préparation d‘une coupe d‘un tissus recouvert de matrice déposée sur une plaque MALDI • On tire sur la coupe avec un lazer UV (source MALDI) • On obtient des spectres MALDI MS ou MS/MS • Conversion des spectres en pixels 200 µm pixels 2500 5000 7500 10000 12500 SJBM 1412 201315000 17500 20000 40
  41. 41. SJBM 1412 2013 41
  42. 42. On peut identifier différentes molécules dans différentes régions du cerveau optical image 4963 Da 4938 Da 5433 Da 5764 Da 6230 Da 6551 Da 6713 Da 7542 Da 7843 Da 14092 Da 18358 Da Image resolution 80µm SJBM 1412 2013 42
  43. 43. On peut analyser simultanément plusieurs molécules ou alors faire une recherche à l’aveugle (profiling) optical image 18385 Da 6230 Da 7843 Da 4938 Da 6651 Da 6713 Da 4963 Da 5764 Da 10607 Da SJBM 1412 2013 43
  44. 44. Imagerie MALDI: Etudes pharmacocinétiques Etude de la distribution spatiale et temporelle d’un médicament dans le rein d’un rat à 30 min et à 2h m/z = 313.1485 T = 30 min T= 2h SJBM 1412 2013 44
  45. 45. Plusieurs molécules sont co-localisées dans une zone particulière: distribution région – spécifique des molécules 1mm m/z = 5470 Da m/z = 6177 Da m/z = 18746 Da 45 SJBM 1412 2013 45
  46. 46. Importance de la resolution en métabolomique Il faut pouvoir identifier un métabolite avec la plus grande précision (0.0112 Da différence) SJBM 1412 2013 46
  47. 47. Projet collaboratif autour du développement du MALDI imaging SJBM 1412 2013 47
  48. 48. Préparation de l’échantillon • • • • Besoin de l’expertise en histologie Faire une coupe d’un tissu n’est pas toujours facile Microtome/cryomicrotome, fixations, inclusions…. Les constructeurs et les plateformes n’ont souvent pas cette expertise SJBM 1412 2013 48
  49. 49. Les matrices • • • • En métabolomique le problème est que la matrice est un métabolite En métabolomique il n’y a pas de matrice universelle Choix de la matrice est fonction de la molécule à analyser Développement majeure des prochaines années – Lavage des tissus (enlever les sels) – délipidation (baisser la suppression d’ions) SJBM 1412 2013 49
  50. 50. Etude pharmacocinétique par MALDI Imaging Distribution spatio-temporelle d’un médicament chez la souris Famotidine médicament utilisé dans le traitement des ulcères (estomac ou du duodénum). Il réduit la production d’acide et de pepsine ainsi que le volume de la sécrétion gastrique Administration de Famotidine à une souris 3 minutes La sourie est sacrifiée SJBM 1412 2013 50
  51. 51. Etude pharmacocinétique par MALDI Imaging Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine Questions: - ou se trouve la Famotidine , dans quel(s) tissus au bout de 3 minutes ? - à quelle concentration ? - quels sont les produits du catabolisme de la Famotidine (conjugués…) ? SJBM 1412 2013 51
  52. 52. Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine chez la souris Famotidine MW= 337.449 g/mol Les molécules s’ionisent [ M+H+] La coupe est recouverte de matrice DHB Résolution spatiale basse: 200µm Accumulation de la Famotidine dans les reins SJBM 1412 2013 52
  53. 53. Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine chez la souris Accumulation de produits du catabolisme de la Famotidine dans les reins [ M+H+] +/Na 338.05> 259.06 Famotidine SJBM 1412 2013 +/OH 53
  54. 54. Identification de bio-marqueurs du cancer du foie Modèle: souris/ xénogreffe de cellules / cancer colorectal humain Injection par la veine porte de cellules HCT116 (GFP-tagged human colon cancer cells) 2 semaines Propagation du cancer dans le foie Souris âgée de 13 semaines Animal est sacrifié 2 semaines après injection SJBM 1412 2013 54
  55. 55. Identification de bio-marqueurs du cancer du foie Identification des zones cancéreuses par microscopie à fluorescence ou par microscope optique SJBM 1412 2013 55
  56. 56. Identification de bio-marqueurs du cancer du foie par MALDI Imaging Dosage du gluthation dans le foie (GSH) 10µm SJBM 1412 2013 Échantillon: foie de souris Résolution spatiale: 10µm Matrice: 9-AA(aminoacridine) 56
  57. 57. Dosage du glutation dans le foie (GSH) par MALDI Imaging Augmentation de GSH dans les tissus cancéreux P: parenchyme M:Metastase SJBM 1412 2013 57
  58. 58. Conclusion La métabolomique par spectrométrie de masse et imagerie in situ • • • • • • Technologie émergente possibilité d’identifier des molécules directement sur des échantillons solides Sans marquage Résolution tissulaire (5µm) MALDI Imaging est la technique la plus avancée Sensibilité par encore très élevée  Combinaison de différentes expertises • spectrométrie de masse • Métabolomique • Imagerie & microscopie • Histologie • Bioinformatique SJBM 1412 2013 58
  59. 59. Conclusion sur l’imagerie in situ par spectrométrie de masse • l’acquisition des données & le traitement des données facteur limitant reste le temps d’analyse lui-même est tributaire de: - la fréquence de répétition des tirs - la rapidité de déplacement de la cible - temps d’acquisition de l’éléctronique Ex: à 1Hz l’acquisition durera une journée à 100Hz l’acquisition durera quelques heures + la durée d’analyse est importante: + l’échantillon sera dégradé + il y aura évaporation de la matrice sous vide • La seule technique qui permet d’identifier finement plusieurs molécules sans marquage sur des tissus SJBM 1412 2013 59
  60. 60. Merci dimitri.heintz@ibmp-cnrs.unistra.fr SJBM 1412 2013 60

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