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Introduction :La culture cellulaire est devenue un des outils majeursutilisés aujourdhui dans les sciences de la vie. La c...
I- La culture des cellules animales :
I- La culture des cellules animales :1-Définition de la culture cellulaire :En biologie, la culture cellulaire désigne une...
2- La milieu de culture des cellules animales :-Les milieux mis au point pour cultiver les cellulesanimales sont beaucoup ...
Le milieu reconstitué comprend:-Les sels et le glucose (1g /l)-Les acides aminés et les vitamines-Le PH du milieu doit êtr...
3- L’obtention d’une culture cellulaire :-Il existe deux méthodes de base pour faire la culture primaire:•les Cultures dex...
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Types de cellules :Les cellules cultivées sont généralement décrites daprès leurmorphologie (forme et apparence) ou leurs ...
2. type lymphoblaste: ces cellules ne se fixent pasnormalement à un substrat mais restent en suspension avecune forme sphé...
L’utilisation des cellules en culture :-L’étude des mécanismes de la physiologie cellulaire : contrôle decycle cellulaire,...
Les avantages et les inconvénients :Les avantages :la plus part des tissus animaux et végétaux sont constitué de différent...
Les inconvénient :Un des principaux inconvénients des cellules en culture est le faitqu’elles ne sont pas dans leur enviro...
II- Les moyennes d’étude d’une culture des cellules animales :
2-Des méthodes appropriées en microscopie optiquepermettent l’observation de cellules vivant dans des boitesde culture :De...
-Ces techniques sont aussi appliquées à l’étude in vitro dufonctionnement d’organites cellulaires isolés, comme parexemple...
Une technique d’apparition récente est l’étude de lavariation de la concentration intracellulaire ducalcium :La synthèse c...
La microscopie vidéo et traitement d’image :De même qu’il possible d’observer un champ microscopique à l’œil oude la photo...
La microscopie à fluorescence :                                        Microscope à fluorescence                          ...
La microscopie à fluorescence :•Le phénomène de fluorescence:certaines molécules (appelées fluorochromes) absorbent des ra...
Immunofluorescence:le fluorochrome (comme la rhodamine ou la fluorescéinne) etuni par covalence (conjugué) à un anticorps,...
On peut aussi utiliser les protéines marquées par fluorescence pourétudier des processus dynamiques tels qu’ils se déroule...
Cytométrie en flux :Initialement développée pour le dénombrement de cellule ensuspension et lévaluation de leur taille ,la...
Le principe de cytométrie en flux :
Lappareil : deux modèles différents.                                   Un cytomètre analyseur de paillasseun cytomètre tri...
Les lasers :Les lasers produisant unelumière monochromatique,celle-ci nest pas forcémentadaptée à la mesurerecherchée.Diff...
Les détecteurs :Un systèmecomplexe de filtreset de détecteurspermet de faireplusieurs mesuressimultanées (2mesures dediffr...
Le tri des cellules :
Conclusion :On conclure que la culture des cellules animales jouent ungrand rôle dans l’étude des mécanismes de la physiol...
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  1. 1. REPUBLIQUE ALGERIENN DEMOCRATIQUE ET POPULAIREMINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE MOHAMED KHEIDER BISKRA FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIEDÉPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE 1ére année master BBM Les moyens d’étude de la culture des cellules animale 2011/2012
  2. 2. Sommaire :IntroductionI- La culture des cellules animales :1-Définition de la culture cellulaire2-La milieu de culture des cellules animales3-L’obtention des culture cellulaires4-A quoi rassemblent les cellules cultivées5-Les avantages et les inconvénients6-L’utilisation des cellules en cultureII- Les moyennes d’étude de la culture des cellules animales1-Des méthodes appropriées en microscopie optique permettentl’observation de cellules vivant dans des boites de culture :2-Une technique d’apparition récente est l’étude de la variation de laconcentration intracellulaire du calcium :
  3. 3. Introduction :La culture cellulaire est devenue un des outils majeursutilisés aujourdhui dans les sciences de la vie. La culturedes cellules animale en dehors de l’organisme permetl’observation des cellules vivantes dans des conditionsfavorables. De plus, une culture cellulaire représente unsystème expérimental beaucoup plus simple qu’un animalentier et elle fournit un système qui peut être étudié dansdes conditions soigneusement contrôlées. Il existe plusieursmoyennes permet l’étude d’une culture des cellulesanimales. Dans notre exposé, on présente quelquesmoyennes.
  4. 4. I- La culture des cellules animales :
  5. 5. I- La culture des cellules animales :1-Définition de la culture cellulaire :En biologie, la culture cellulaire désigne unensemble de techniques utilisées pour fairecroître des cellules hors de leur organisme (ex-vivo) ou de leur milieu dorigine, dans un butdexpérimentation scientifique ou defécondation in vitro.
  6. 6. 2- La milieu de culture des cellules animales :-Les milieux mis au point pour cultiver les cellulesanimales sont beaucoup plus complexe que lesmilieux « minimum » suffisants à la prolifération desbactéries et des levures.-Les premières tentatives de culture des cellulesutilisaient des milieux de compositions incertaines,comme le plasma, le sérum et des extraitsembryonnaires ces milieux sont isotoniques ettamponnés.En 1955, quand Harry Eagle décrivit le premier milieureconstitué
  7. 7. Le milieu reconstitué comprend:-Les sels et le glucose (1g /l)-Les acides aminés et les vitamines-Le PH du milieu doit être maintenu entre 7,2 et 7,4. Onutilise donc le tampon physiologique qui est le tamponbicarbonate (H2CO3/HCO-3).-L’équilibre est maintenu grâce à un atmosphère contenant 5à 10 % de CO2-les facteurs de croissance polypeptidiques qui activent leurdivision.
  8. 8. 3- L’obtention d’une culture cellulaire :-Il existe deux méthodes de base pour faire la culture primaire:•les Cultures dexplants:de petits morceaux de tissus sont fixés sur un récipient deculture en verre ou en plastique traité et baignés dans dumilieu de culture. Après quelques jours, des cellulesindividuelles se déplacent de lexplant de tissus vers la surfacedu récipient de culture ou le substrat où elles commencent à sediviser et proliférer.
  9. 9. Dissociation enzymatique: la méthode la plus généralementutiliséece processus est accéléré en ajoutant des enzymes de digestion(protéolytiques), telles que la trypsine ou la collagénase, à desfragments de tissus pour dissoudre le ciment maintenant lescellules ensembles. Ceci crée une suspension de cellulesindividuelles qui sont placées dans des récipients de culturecontenant un milieu de culture pour les laisser pousser et sediviser.
  10. 10. Repiquage :Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire ontpoussé et couvert tout le substrat de culture disponible, ellesdoivent être repiquées pour leur donner de la place afind’avoir une croissance continue(culture sécondaire). Cela sefait généralement en les retirant aussi délicatement quepossible du substrat avec des enzymes. Ces enzymes sontsimilaires à celles utilisées pour obtenir la culture primaire etsont utilisées pour rompre les liaisons protéiques liant lescellules au substrat.
  11. 11. À quoi ressemblent les cellules cultivées?Systèmes de culture cellulaire :systèmes de culture monocouche:Ils sont essentiellement basés sur laptitude des cellules àpousser attachées sur un substrat de verre ou de plastique traitésystèmes de culture en suspension:Ils sont essentiellement basés sur laptitude des cellules àflotter librement dans le milieu de culture
  12. 12. Types de cellules :Les cellules cultivées sont généralement décrites daprès leurmorphologie (forme et apparence) ou leurs caractéristiquesfonctionnelles. Il existe trois morphologies de base:1. type épithélial: cescellules sont attachées àun substrat etapparaissent plates et deforme polygonale.
  13. 13. 2. type lymphoblaste: ces cellules ne se fixent pasnormalement à un substrat mais restent en suspension avecune forme sphérique.3. type fibroblaste: ces cellulessont attachées à un substrat etapparaissent allongées etbipolaires.
  14. 14. L’utilisation des cellules en culture :-L’étude des mécanismes de la physiologie cellulaire : contrôle decycle cellulaire, métabolisme, régulation de l’expression du gènes, étudesdes mouvements et des jonctions cellulaires. La culture cellulaire permetd’étudier la cellule eucaryote et ses relations avec son environnement.-En médecine humaine, la culture cellulaire est utilisée pour laréalisation de greffes et d’autogreffes (cellules souches sanguines), ledépistage des maladies génétiques (caryotype), la thérapie génique.-L’industrie pharmaceutique est une grande utilisatrice de ces culture :étude pharmacologique et toxicologique de nouvelles moléculesmédicamenteuses, production des substances a usage thérapeutique(hormones de croissance, insuline, interférons et cytokines, anticorpsmonoclonaux) et production de vaccins.
  15. 15. Les avantages et les inconvénients :Les avantages :la plus part des tissus animaux et végétaux sont constitué de différenttype de cellules, alors que des cellules de type spécifique avec despropriétés homogène peuvent être cultivé.les conditions expérimentales, peuvent être nettement mieux contrôléesen culture que dans un organisme intacts.dans de nombreux cas, une cellule unique peut rapidement se développeren une colonie constituée de nombreuses cellules identiques, unprocessus appelé clonage cellulaire. Cette technique simple, permetd’isolé facilement des clones distincts de cellules.
  16. 16. Les inconvénient :Un des principaux inconvénients des cellules en culture est le faitqu’elles ne sont pas dans leur environnement normal et que, parconséquent, leurs activités ne sont pas régulées par les autres cellulescomme dans le cas d’un organisme intact.L’environnement immédiat des cellules en culture radicalement de leurenvironnement « normal », par conséquent, leurs propriétés peuvent êtreaffectées de plusieurs façons.
  17. 17. II- Les moyennes d’étude d’une culture des cellules animales :
  18. 18. 2-Des méthodes appropriées en microscopie optiquepermettent l’observation de cellules vivant dans des boitesde culture :Des méthodes appropriées en microscopie optiquepermettent l’observation de cellules vivant dans des boitesde culture :-Par exemple, le contraste de phase. Couplées d’abord à lamicrocinématographie, maintenant à la vidéomicroscopie, cesméthodes rendent possible l’observation de cellules cultivéespendant de longues périodes (mouvements cellulaire,endocytose, différenciation cellulaire…).
  19. 19. -Ces techniques sont aussi appliquées à l’étude in vitro dufonctionnement d’organites cellulaires isolés, comme parexemple les mouvement des mitochondries le long desmicrotubules.-Les progrès de la microscopie à fluorescence, la synthèse deprotéines fluorescentes (GFP : la protéine à fluorescence verte)permettent la visualisation en temps réel du devenirintracellulaire de protéines marquées- Il est possible, à l’aide d’un faisceaux laser, d’éteindrelocalement la fluorescente , puis de suivre la récupération de lafluorescencetechnique permettant l’analyse de la mobilité des protéines, deleur transport actif dans ou à la surface des cellules vivantes.
  20. 20. Une technique d’apparition récente est l’étude de lavariation de la concentration intracellulaire ducalcium :La synthèse chimique a mis à la disposition des chercheurs desmolécules qui sont fluorescentes, lorsqu’elles sont en contacte avec ducalcium libre dans le hyaloplasme. La mesure de l’intensité de lafluorescence émise permet de mesurer en temps réel (quelquesmillisecondes) les variations de la concentration intracellulaire ducalcium induites par des agents pharmacologiques par exemple. Coupléeà un système de vidéomicroscopie avec intensification du signal etanalyse d’image, la méthode permet de visualiser à l’intérieur de cellulesen culture ces variations de la concentration du calcium, et ce en tempsréelD’autres fluorocromes sont maintenant disponibles pour mesurer dansles mêmes conditions les variations du PH ou celles de la concentrationen sodium.
  21. 21. La microscopie vidéo et traitement d’image :De même qu’il possible d’observer un champ microscopique à l’œil oude la photographier, on peut aussi le filmer avec un caméra vidéo.Les caméra vidéo offrent de nombreux avantages pour l’observation desobjets:On construit des types particuliers de caméra vidéo très sensibles à lalumière, permettant de donner des images d’objets sous un éclairage trèsfaible.C’est particulièrement utile pour l’observation de spécimens vivants, quisont facilement détériorés par la chaleur dégagée par une sourcelumineuse, et des spécimens colorés par fluorescence, qui se décolorentrapidement quand ils sont exposés à la lumière. De plus, les camérasvidéo augmenter fortement le contraste de l’image et faire apparaitre desobjets très petits.
  22. 22. La microscopie à fluorescence : Microscope à fluorescence verticale (Olympus BX61), équipé de filtres et dun appareil photo numériqueMicroscope à fluorescence inversé(Nikon TE2000) ; La plaque orangéepermet à lutilisateur de regarderléchantillon, tout en protégeant lesyeux de la lumière UV qui excite lacible pour la rendre fluorescent.
  23. 23. La microscopie à fluorescence :•Le phénomène de fluorescence:certaines molécules (appelées fluorochromes) absorbent des radiationultraviolettes invisibles et libèrent une partie de l’énergie sous forme delumière visible de plus grande longueur d’onde•Dans ce microscope, la source lumineuse produit un faisceau de lumièreultraviolette qui traverse un filtre bloquant toutes les longueurs d’onde àl’exception de celles peuvent exciter le fluorochrome.•Le faisceau de lumière monochromatique est focalisé par l’objectif surl’objet contenant le fluorochrome, celui-ci est excité et émet une lumièrede longueur d’onde visible susceptible d’etre perçue par l’observateur.•La source lumineuse ne produisant que de la lumière ultraviolette(noire), les objets colorés par un fluorochrome apparaissent avec descouleurs brillantes sur un fondanoir, et le contraste est très fort.
  24. 24. Immunofluorescence:le fluorochrome (comme la rhodamine ou la fluorescéinne) etuni par covalence (conjugué) à un anticorps, afin de produireun anticorps fluorescent utilisable pour localiser une protéinespécifique au sein de la cellule.Supposons, par exemple, que vous vous intéresser à lalocalisation d’une protéine motrice particulière, comme ladynéine cytoplasmique, avant et au cours de la mitose. Pour cefaire, vous pourriez prendre des objets entiers ou des coupesde cellules en division et au repos, puits les traiter par unanticorps contre la dynéine, marqué par fluorescence.L’examen de la préparation au microscope à fluorescencemontrait la localisation de la dynéine aux deux stades du cyclecellulaire.
  25. 25. On peut aussi utiliser les protéines marquées par fluorescence pourétudier des processus dynamiques tels qu’ils se déroulent dans la cellulevivante. On peut, par exemple, fixer un fluorochrome spécifique à uneprotéine cellulaire, comme l’actine ou la tubuline, et injecter la protéinemarquée par fluorescence dans une cellule vivante.protéine fluorescence (GFP): on construit un ADN recombinant quiréunit la région codante de la GFP à celle de la protéine étudiée. Et ADNrecombinant sert à la transfection des cellules, qui synthétisent ainsiune protéine chimérique contenant la GFP fluorescente fusionnée à laprotéine.Dans toutes ces stratégies, les protéines marquées participentaux activités normales de la cellule et il est possible de suivre leurlocalisation au microscope pour mettre en évidence les activitésdynamiques auxquelles participe la protéine.On peut aussi utiliser des fluorochromes pour localiser les moléculesd’ADN ou d’ARN contenant des séquences nucléotidiques spécifiques.
  26. 26. Cytométrie en flux :Initialement développée pour le dénombrement de cellule ensuspension et lévaluation de leur taille ,la cytométrie en flux aété rapidement appliquée à lanalyse, la caractérisation et laséparation des cellule eucaryotes des constituants cellulaire(mitochondries, chromosomes).
  27. 27. Le principe de cytométrie en flux :
  28. 28. Lappareil : deux modèles différents. Un cytomètre analyseur de paillasseun cytomètre trieur de cellules,beaucoup plus imposant.
  29. 29. Les lasers :Les lasers produisant unelumière monochromatique,celle-ci nest pas forcémentadaptée à la mesurerecherchée.Différents lasers sont doncnécessaires pour étendre lespossibilités de lappareil : enparticulier pour mettre enévidence différents types defluorochromes qui ne sont pasexcités par les mêmeslongueurs donde.
  30. 30. Les détecteurs :Un systèmecomplexe de filtreset de détecteurspermet de faireplusieurs mesuressimultanées (2mesures dediffraction et desmesures defluorescence).
  31. 31. Le tri des cellules :
  32. 32. Conclusion :On conclure que la culture des cellules animales jouent ungrand rôle dans l’étude des mécanismes de la physiologiecellulaire, dans la médecine humaine, et dans L’industriepharmaceutique. Leur études se fait à l’aide de plusieursmoyennes, la plus utilisable c’est la microscope defluorescence et la cytométrie en flux.

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