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IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE
SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER
EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"

Jean-Philippe Rosec - SCL
REGLEMENTATION EN MATIERE DE PRODUITS A
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• Règlement (CE) 854/2004 fixant les règles spécifiques d'organisation des
contrôles officiels concernant les produits d'origine animale destinés à la
consommation humaine + R (CE) 853/2004 fixant des règles spécifiques
d'hygiène applicables aux denrées alimentaires d'origine animale (→ définit VSM:
exclues des viandes par Dir 2000/13/CE et R (CE) 1169/2011. Définit viandes hâchées, produits et
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• Code des usages de la charcuterie, de la salaison et des
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• Viandes = parties comestibles des animaux […] y compris le sang.
• Définit également les abats: viandes fraîches autres que celles de la
carcasse, y compris viscères et sang
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• Viandes = Les muscles squelettiques (inclus diaphragmme et
masséters, exclus cœur, langue, muscles de la tête autres que
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adhérents; avec teneurs max en MG et collagène définies.
Code des usages de la charcuterie:
• Définit précisément les abats; également le « Maigre » et les viandes
déshydratées, le « Gras » (reprise textes et normes existantes)
• Définit de nombreuses préparations. Ex: Pâtés, mousses, terrines de
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IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
• Les moyens et les méthodes
→ Cibles protéiques
IsoElectroFocalisation (produits laitiers,
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Actuellement: essentiellement les tests ELISA
IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
• Les moyens et les méthodes
→ Cibles nucléiques
ADN nucléaires, ADN mitochondriaux
(produits transformés): PCR et "dérivés" « (RFLP,
puces à ADN, électrophorèse capillaire, …)
PCR en point final vs PCR en
temps réel (dite "quantitative" car permettant de
quantifier l’ADN)
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Cible exclusive: ADN mitochondriaux
Toutes ces techniques sont employées pour l’identification
Pour la (semi) quantification (?): PCR en temps réel
ADN nucléaires
• rRNA 18S (gènes codant pour les ARN 18S)
• ADN satellites (profils mais aussi possibilité
d’amplifications spécifiques)
• gènes (K caséine, hormone de croissance, …)
→Spécificité, mais: sensibilité aux traitements (thermiques
notamment), monocopies, problème de disponibilité des
séquences, …
ADN mitochondriaux
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• rRNA 12S, cytochrome oxydase (COX)
→ Structure circulaire (résistance), multicopies, outils
phylogéniques (disponibilité des séquences) mais: variabilité,
taille des séquences. Possibilités de PCR spécifiques ou
"universelles" (transvertébrés, …)
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(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
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fluorescence au cours de la réaction. Fluorescence spécifique
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100 ng/µl
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Produit PCR peut également être révélé en
électrophorèse capillaire, ou après hybridation sur
puce à ADN (avec sondes spécifiques),

La PCR en point final

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Détection ADN: pas de lien
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Seuils de détection
relativement élevés (#
1%)

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(<1%, <0,1%, …)

Seuils de détection
relativement élevé (# 1%)

Seuils de détection bas
(<1%, <0,1%, …)

Matériel moins onéreux
que la PCR (en temps
réel)

Coût/échantillon
relativement peu élevé

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important (ex: Cheval =

Matériel plus onéreux que
l’ELISA (PCR en temps réel)

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relativement aisées

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Boîte noire: difficultés à
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D’ESPECES ANIMALES
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I
D
E
N
T
I
F
I
C
A
T
I
O
N

IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES (hors poisson)
STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE
SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER
Matières premières (minerais, viandes hâchées, VSM, …)
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IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES (hors poisson)
STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE
SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER

A
P
P
R
O
C
H
E

Q
U
A
N
T
I
T
A
T
I
V
E

Approche par matrice
• Porc dans merguez (ELISA)
• Oie/canard dans foie et bloc de foie gras (PCR temps réel)
→ Gammes permettant des résultats semi-quantitatifs (Non détecté,
<1%, 1% à 5%, 5% à 10%, 10% à 15%, >15%)
• Autres matrices (PCR temps réel) hors produits appertisés
→ Approche type seuil ou cut-off (ex: 1% viande de cheval). Les
résultats de Cq (ou Ct ou Cp) sont comparés à un seuil 1% (viande
type viande maigre). RESERVES! (voir cas de la crise viande de cheval)
→ Ordres de grandeur possibles à évaluer par comparaison avec
gammes MAIS matrice par matrice… concrètement difficile voire
impossible à réaliser sur échantillons complexes.
IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"
Février 2013: Recommandation 2013/99/UE
→ Contrôles des denrées alimentaires commercialisées et/ou étiquetées
comme produits contenant du bœuf: détecter les positifs >1% (en masse)
• Recherche du cheval selon méthode du laboratoire de référence de l’Union
européenne pour la détection de protéines animales dans les aliments pour animaux:
+ addendum pour détermination du seuil de 1% (en masse)
http://eurl.craw.eu/en/164/legal-sources-and-sops
• PCR temps réel (amorces peu spécifiques – spécificité par sonde d’hydrolyse)
• Pas de quantification mais seuil (cut-off) de 1%:
Echantillon: analyse en double
Témoin 1% = Mélange 1% cheval (viande) / 4 prises d’essai en triplicat /
Cut-off = [moyenne des 12 mesures – 2 x écart-type] à comparer avec les 2 résultats
de l’échantillon…
• Réserves sur la nature des matrices –et spécialement la teneur en MG- dont dépend
la validité du seuil ainsi établi
IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"
Observations au SCL Montpellier
• Sur produits appertisés, notamment raviolis, chili con carne, sauces
bolognaises et corned beef
→ Présence régulière d’ADN de cheval (prélèvements ciblés) souvent <1%,
mais….
→ Présence d’ADN bovin également <1% (cut-off établi de façon similaire) y
compris pour produits type Corned beef (viande bovine = 98% !)
→ La question de la fiabilité des analyses quantitatives, voire qualitatives, est
posée:
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matrices complexes ?
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définition(s) de ce que l’on appelle "viande" (cf. définitions règlementaires)… ?
IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
VERROUS TECHNOLOGIQUES
• (Semi)-Quantification délicate à mettre en œuvre
dans les produits alimentaires (matrice dépendante)
• Difficultés rencontrées par l’analyse PCR sur certains
produits appertisés
→ Identifier les causes = mieux connaître les matières
premières mises en œuvre
→ Identifier d’autres voies analytiques

Jean-Philippe Rosec - SCL
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Jean-Philippe Rosec - SCL

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Bilan de l’affaire viande de cheval : quels verrous technologiques pour garantir l’authentification des produits animaux ? Authentification et quantification des espèces animales dans les produits transformés.

  • 1. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL" Jean-Philippe Rosec - SCL
  • 2. REGLEMENTATION EN MATIERE DE PRODUITS A BASE DE VIANDE ET D’IDENTIFICATION DES ESPECES ANIMALES (REVUE TRES PARTIELLE) • Directive 2000/13/CE: étiquetage des produits alimentaires – ne pas induire en erreur le consommateur […] sur sa véritable nature et identité… • Règlement (CE) 1760/2000 établissant un système d'identification et d'enregistrement des bovins et concernant l'étiquetage de la viande bovine et des produits à base de viande bovine (et modalités d’application dans R (CE) 1825/2000) → Carcasses et viandes à l’abattoir «viande bovine»: tous les produits relevant des codes NC 0201, 0202, 0206 10 95 et 0206 29 91 + définition viande hâchée, viande découpée, chutes de parage • Règlement (CE) 854/2004 fixant les règles spécifiques d'organisation des contrôles officiels concernant les produits d'origine animale destinés à la consommation humaine + R (CE) 853/2004 fixant des règles spécifiques d'hygiène applicables aux denrées alimentaires d'origine animale (→ définit VSM: exclues des viandes par Dir 2000/13/CE et R (CE) 1169/2011. Définit viandes hâchées, produits et préparations à base de viandes) • Code des usages de la charcuterie, de la salaison et des conserves de viande
  • 3. R (CE) 853/2004: • Viandes = parties comestibles des animaux […] y compris le sang. • Définit également les abats: viandes fraîches autres que celles de la carcasse, y compris viscères et sang Code de la consommation: • Viandes = Les muscles squelettiques (inclus diaphragmme et masséters, exclus cœur, langue, muscles de la tête autres que masséters, du carpe, tarse et queue) avec tissus naturellement inclus adhérents; avec teneurs max en MG et collagène définies. Code des usages de la charcuterie: • Définit précisément les abats; également le « Maigre » et les viandes déshydratées, le « Gras » (reprise textes et normes existantes) • Définit de nombreuses préparations. Ex: Pâtés, mousses, terrines de (espèce): maigre, abats ou gras → au moins 20% de la masse nette du produit à la mise en œuvre, hors décor, substances d’enrobage, croûte, etc…
  • 4. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES • Les moyens et les méthodes → Cibles protéiques IsoElectroFocalisation (produits laitiers, poissons, uniquement produits non dénaturés) pas de quantification Détection d’antigènes: Ouchterlony, immuno -histologie, ELISA, … Spectrométrie de masse (QTof): gélatines porcines et bovines, développements? Actuellement: essentiellement les tests ELISA
  • 5. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES • Les moyens et les méthodes → Cibles nucléiques ADN nucléaires, ADN mitochondriaux (produits transformés): PCR et "dérivés" « (RFLP, puces à ADN, électrophorèse capillaire, …) PCR en point final vs PCR en temps réel (dite "quantitative" car permettant de quantifier l’ADN) Actuellement: Cible exclusive: ADN mitochondriaux Toutes ces techniques sont employées pour l’identification Pour la (semi) quantification (?): PCR en temps réel
  • 6. ADN nucléaires • rRNA 18S (gènes codant pour les ARN 18S) • ADN satellites (profils mais aussi possibilité d’amplifications spécifiques) • gènes (K caséine, hormone de croissance, …) →Spécificité, mais: sensibilité aux traitements (thermiques notamment), monocopies, problème de disponibilité des séquences, … ADN mitochondriaux • cytb • rRNA 12S, cytochrome oxydase (COX) → Structure circulaire (résistance), multicopies, outils phylogéniques (disponibilité des séquences) mais: variabilité, taille des séquences. Possibilités de PCR spécifiques ou "universelles" (transvertébrés, …)
  • 7. Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Principe
  • 8. ADN cible (ouvert par la chaleur) Taq polymérase amorces dNTP La PCR - Rappels Polymerase Chain Reaction ou Amplification en Chaîne par Polymérase (Vocabulaire de la génétique - JO 23/11/2006)
  • 9. Apparition du produit de PCR visualisée et mesurée par fluorescence au cours de la réaction. Fluorescence spécifique (sondes) ou non (agents intecalants) 100 ng/µl 10 ng/µl 1 ng/µl 0,1 ng/µl Produit PCR peut également être révélé en électrophorèse capillaire, ou après hybridation sur puce à ADN (avec sondes spécifiques), La PCR en point final La PCR en temps réel ou PCR quantitative
  • 10. ELISA vs PCR AVANTAGES INCONVENIENTS ELISA PCR Détection des protéines (pas ou peu dénaturées) Détection ADN, y compris dans produits appertisés Ne fonctionne pas sur produits appertisés Détection ADN: pas de lien avec le tissu d’origine Seuils de détection relativement élevés (# 1%) Seuils de détection bas (<1%, <0,1%, …) Seuils de détection relativement élevé (# 1%) Seuils de détection bas (<1%, <0,1%, …) Matériel moins onéreux que la PCR (en temps réel) Coût/échantillon relativement peu élevé Coût réactif /échantillon important (ex: Cheval = Matériel plus onéreux que l’ELISA (PCR en temps réel) Manipulations relativement aisées Réalisation et validation possible de protocoles « maison » Boîte noire: difficultés à évaluer les performances d’un kit (sensibilité, inclusivité/exclusivité) d’un lot à l’autre Manipulations délicates (risques contaminations croisées notamment) (semi)-quantification possible …… ? (semi)-quantification délicate voire impossible… ? Confirmation possible par séquençage (produits PCR > 100pb) ELISA PCR
  • 11. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES Méthodes Identification Quantification Immunoenzymatiques (ELISA) oui (oui) PCR en point final oui non non + RFLP Oui (variabilité + hétéroplasmie) + PUCES à ADN + électrophorèse capillaire PCR en temps réel oui oui non ? oui oui (de l’ADN) Spectrométrie de masse des protéines (QTOF) oui (développement) ?
  • 12. I D E N T I F I C A T I O N IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES (hors poisson) STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER Matières premières (minerais, viandes hâchées, VSM, …) Produits transformés non appertisés ELISA (Bovins, porcins, ovins, volailles, cheval) PCR sur espèces non détectées par ELISA Produits appertisés PCR point final ou temps réel: porc, bœuf, âne, cheval, cerf, chevreuil, lapin, lièvre, chèvre, mouton. Toutes espèces sur viandes ou tissus non mélangés (cibles spécifiques ou "universelles" + séquençage
  • 13. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES (hors poisson) STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER A P P R O C H E Q U A N T I T A T I V E Approche par matrice • Porc dans merguez (ELISA) • Oie/canard dans foie et bloc de foie gras (PCR temps réel) → Gammes permettant des résultats semi-quantitatifs (Non détecté, <1%, 1% à 5%, 5% à 10%, 10% à 15%, >15%) • Autres matrices (PCR temps réel) hors produits appertisés → Approche type seuil ou cut-off (ex: 1% viande de cheval). Les résultats de Cq (ou Ct ou Cp) sont comparés à un seuil 1% (viande type viande maigre). RESERVES! (voir cas de la crise viande de cheval) → Ordres de grandeur possibles à évaluer par comparaison avec gammes MAIS matrice par matrice… concrètement difficile voire impossible à réaliser sur échantillons complexes.
  • 14. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL" Février 2013: Recommandation 2013/99/UE → Contrôles des denrées alimentaires commercialisées et/ou étiquetées comme produits contenant du bœuf: détecter les positifs >1% (en masse) • Recherche du cheval selon méthode du laboratoire de référence de l’Union européenne pour la détection de protéines animales dans les aliments pour animaux: + addendum pour détermination du seuil de 1% (en masse) http://eurl.craw.eu/en/164/legal-sources-and-sops • PCR temps réel (amorces peu spécifiques – spécificité par sonde d’hydrolyse) • Pas de quantification mais seuil (cut-off) de 1%: Echantillon: analyse en double Témoin 1% = Mélange 1% cheval (viande) / 4 prises d’essai en triplicat / Cut-off = [moyenne des 12 mesures – 2 x écart-type] à comparer avec les 2 résultats de l’échantillon… • Réserves sur la nature des matrices –et spécialement la teneur en MG- dont dépend la validité du seuil ainsi établi
  • 15. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL" Observations au SCL Montpellier • Sur produits appertisés, notamment raviolis, chili con carne, sauces bolognaises et corned beef → Présence régulière d’ADN de cheval (prélèvements ciblés) souvent <1%, mais…. → Présence d’ADN bovin également <1% (cut-off établi de façon similaire) y compris pour produits type Corned beef (viande bovine = 98% !) → La question de la fiabilité des analyses quantitatives, voire qualitatives, est posée: Effets des traitements appliqués aux matières premières, des matrices complexes ? Nature des matières premières: teneur en MG, teneur en ADN, définition(s) de ce que l’on appelle "viande" (cf. définitions règlementaires)… ?
  • 16. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION D’ESPECES ANIMALES VERROUS TECHNOLOGIQUES • (Semi)-Quantification délicate à mettre en œuvre dans les produits alimentaires (matrice dépendante) • Difficultés rencontrées par l’analyse PCR sur certains produits appertisés → Identifier les causes = mieux connaître les matières premières mises en œuvre → Identifier d’autres voies analytiques Jean-Philippe Rosec - SCL
  • 17. MERCI DE VOTRE ATTENTION Jean-Philippe Rosec - SCL