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1.
REJUVENATION RESEARCH Volume 10,
Number 2, 2007 © Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/rej.2006.0515 Le Stress Oxydatif sur les cellules neurales, hématopoïétiques et souches : assurer leur protection grâce à des composants naturels R. Douglas Shytle,1 Jared Ehrhart,2 Jun Tan,1,2 Jennifer Vila,1 Michael Cole,1 Cyndy D. Sanberg,4 Paul R. Sanberg,1 et Paula C. Bickford1,3 RESUME Au cours du processus naturel de vieillissement, on sait que les cellules souches adultes perdent de leur capacité à se restaurer et deviennent plus vulnérables au stress oxydatif. Par conséquent, la capacité du corps à se réparer lui-même diminue. Nous rapportons ici que la formule brevetée à base de produits naturels, le NT-020 (NutraStem), (qui, comme cela a été prouvé précédemment, améliore la prolifération de cellules souches humaines hématopoïétiques), réduit l’apoptose liée au stress oxydatif des neurones murins et des cellules de la microglie in vitro. De plus, lorsqu’il est administré oralement pendant 2 semaines, les cellules souches de moelle osseuse murine mises en culture présentent une réduction de l’apoptose lié au stress oxydatif en fonction de la dose. Cette étude pré-clinique démontre que le NT-020 (NutraStem) peut agir pour améliorer la guérison via une interaction avec la population de cellules souches et constitue leurs bases pour mener un essai clinique pour déterminer si le NT-020 (NutraStem) montre des effets similaires sur la guérison des humains lorsqu’il est utilisé en complément alimentaire. INTRODUCTION souches sont localisées dans plusieurs tissus différents et peuvent générer presque n’importe U ne cellule souche a la capacité unique de se régénérer elle-même et de générer différents types de cellules spécialisées. Ces cellules se quel type de cellules dans le corps. Les cellules souches internes, ou « endogènes » sont essentielles à la capacité du corps à réparer lui- retrouvent dans de nombreux organes chez l’adulte même les tissus endommagés, ou à remplacer les comme la moelle osseuse, le sang périphérique, le populations cellulaires comme celles par exemple sang de cordon ombilical, la rate, les gencives, les qui ont été détruites par des blessures, des tissus adipeux et le cerveau. La recherche sur les maladies, des troubles ou des traitements comme la cellules souches est actuellement un sujet prisé à la chimiothérapie. Des cellules souches en bonne fois par les médias et au sein de la communauté santé sont vitales à la régénérescence du corps et à scientifique.1 Alors que les thérapies à base de la réparation du fonctionnement de certains cellules souches ont promis d’offrir d’importants mécanismes. nouveaux traitements pour une large variété de Au cours du processus naturel de maladies, il y a deux obstacles majeurs à leur vieillissement, on sait que les cellules souches succès ultime. Premièrement, les thérapies à base adultes ont une capacité de restauration2 qui se de cellules souches restent controversées en raison réduit et sont plus vulnérables face au stress des regards sur les cellules souches embryonnaires oxydatif3 : il en résulte une capacité réduite du dérivées du fœtus. Deuxièmement, les thérapies à corps à se guérir lui-même. Par exemple, les base de cellules souches pourraient prendre cellules souches neurales, les cellules satellites du plusieurs années à atteindre le marché médical à muscle et les cellules progénitrices endothéliales cause des exigences longues et coûteuses en termes ont toutes montré une prolifération qui se réduit de règlementation. Heureusement, un nombre avec l’âge et pourrait jouer un rôle dans des croissant de preuves suggère qu’un grand nombre pathologies associées à l’âge.4-6 Dans une maladie de cellules souches est produite dans le corps cardiovasculaire, par exemple, il y a une humain, et ce, tout au long de la vie. Ces cellules corrélation entre une réduction du nombre de 1 Center of Excellence for Aging and Brain Repair, Departement of Neurosurgery 2 Silver Child Development Center, Department of Psychiatry, University of South Florida College of Medicine 3 James A Haley Veterans Administration Hospital 4 Natura Therapeutics, Inc., Tampa, Florida
2.
REJUVENATION RESEARCH Volume 10,
Number 2, 2007 © Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/rej.2006.0515 cellules progénitrices endothéliales du sang active de la vitamine D3 (25-hydroxy- périphérique et de nombreux facteurs de risque cholécalciférol, Sigma). cardiovasculaires.7,8 Les cellules souches neurales Culture des cellules et essai de lactate diminuent également avec l’âge6 et certains déshydrogénase (LDH). chercheurs ont postulé que le déclin de la Pour les analyses en prévention de la mort neurogenèse lié à l’âge est apparenté à un déclin cellulaire, de la microglie murine primaire et des cognitif.9-11 Cependant, une littérature croissante cellules neuronales ont été préparées à partir du (NdT : scientifique) indique à présent que certains cortex cérébral isolé de souris BALB/c nutriments, vitamines et flavonoïdes pourraient nouvellement nées (1-2 jours)27 ou d’embryon de avoir des rôles importants dans la prolifération et le souris, entre 15 et 17 jours in utero28 (n = 8). Ces maintien d’un renouvellement continuel des cellules ont été mises en culture dans des plaques cellules souches, requis pour l’auto- de 96 puits (5*104/puit) contenant 200 µL d’un renouvellement des cellules matures dans le sang, milieu minimum essentiel complet contenant 5 % le cerveau ainsi que dans d’autres tissus.12-25 Ainsi, de serum de fœtus bovin (SFB), 2mM de il semblerait qu’il soit possible d’utiliser certains glutamine, 100 U/ML de pénicilline, 0.1 µg/mL de produits naturels, soit seuls, soit en synergie, pour streptomycine et 0.05 mm de 2-ME). Ces cellules le traitement de pathologies pour lesquelles le ont été incubées pendant 24h avec divers extraits remplacement des cellules souches apparait de diverses doses (de 8 ng/mL à 500 ng/mL) ou justifié. avec des composants moléculaires (de 0.3125 µM Nous avons récemment étudié la capacité à 20 µM). de divers composants naturels à stimuler la Après une période d’incubation de 6 prolifération de cellules souches adultes dérivées heures, du H2O2 (15 µM) a été ajouté à tous les de la moelle osseuse (CD34+) et de cellules puits exceptés ceux servant de témoins et les progénitrices du sang périphérique (CD133+) in plaques microtitres sont remises dans l’incubateur vitro. En particulier, nous avons montré pour la pour le reste de la période d’incubation. Des première fois qu’une combinaison breveté d’extrait tampons de lyse du kit LDH (Promega, Madison, de myrtille, d’extrait de thé vert, de carnosine et de WI) ont été ajoutés aux puits appropriés, 45 vitamine D3, identifiée comme la formule de minutes avant une collecte de surnageant, dans le complémentation alimentaire NT-020 (NutraStem), but de mesurer le relâchement de LDH (mort montre une activité synergique pour la cellulaire totale). Après la période totale de 24h prolifération de cellules souches humaine d’incubation, le surnageant a été collecté et testé en hematopoïétique en culture.26 utilisant le kit LDH selon les recommandations du Parce que de récentes études indiquent que fabriquant. le stress oxydatif limite les capacités d’auto- renouvellement des cellules souches, nous avons Étude in vivo cherché à savoir si le NT-020 (NutraStem) pourrait Traitement oral de NT-020 (NutraStem) sur des réduire les effets du stress oxydatif sur les cellules souris. murines survivantes in vitro et in vivo. Toutes les techniques expérimentales et les procédures ont été approuvées par le Institutional PROCEDURE EXPERIMENTALE Animal Care and Use Commitee. Des souris BALB/c, âgées de 3 mois, ont Étude in vitro été achetées auprès de Jackson Labs (Bar Harbor, Réactifs. Tous les composants ont été ME) pour toutes les expériences in vivo. Tous les ajoutés à des cellules en culture comme décrit dans animaux ont vécu dans des conditions normales la section résultats. (20±°C, humidité relative de 50±%, et un cycle Les sources des ingrédients du NT-020 lumière/obscurité de 12 heures) et se sont vu (NutraStem) ont été comme suit : myrtille (poudre administrer un régime alimentaire normal ad lyophilisée, Van Drunen Farms, Momence, IL), libitum. Pour étudier les effets du NT-020 extrait de thé vert (Rexall Sundown, Boca Raton, (NutraStem) in vivo, les souris ont été traitées avec FL), carnosine (Sigma, St. Louis, MO), et la forme
3.
REJUVENATION RESEARCH Volume 10,
Number 2, 2007 © Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/rej.2006.0515 deux doses différentes de NT-020 (NutraStem). La La moelle osseuse a été obtenue en rinçant dose « faible » de la formule délicatement le fémur avec du IMDM. La moelle a brevetée, 13.5 mg/kg par jour, était basée sur la été ensuite dissocié, les cellules ont été comptées et dose journalière humaine dérivée de notre étude in mises en plaques microtitres de 24 puits vitro initiale.26 Comme les souris on un taux (5*106/puit). métabolique beaucoup plus élevé que les humains, nous avons décidé d’utiliser, pour la dose Analyses statistiques « élevée », une dose 10 fois plus forte pour cette Toutes les données ont été distribuées étude in vivo. Par conséquent, les souris ont reçu normalement ; par conséquent, dans le cas de soit 13.5 mg/kg par jour (dose faible, n = 5), soit simples comparaisons moyennes, le test de Levene 135.0 mg/kg par jour (dose élevée, n = 5), soit de pour l’égalité de la variance suivi du test t pour l’eau (n = 5) pendant 14 jours par gavage oral. Au des échantillons indépendants a été utilisé pour 15ème jour, la moelle osseuse a été isolée, mise en tester la significativité. Dans le cas de multiples culture (étude en aveugle) comme décrit plus bas et comparaisons moyennes, une analyse de variance testée avec différentes doses de H2O2 (15 µM 500 (ANOVA) a été utilisée, suivi d’une comparaison µM). post hoc en utilisant la méthode Bonferonni. Les niveaux α ont été fixés à 0.05 pour toutes les Isolation des cellules et collecte de tissus. analyses. Le paquet statistique pour la publication Les animaux ont été anesthésiés avec du Nembutal des sciences sociales 10.0.5 (SPSS INc., Chigago, (500 µl) et les cellules de moelle osseuse ont été IL) a été utilisé pour toutes les analyses de collectées dans un Iscove’s modified Dulbecco’s données. medium (IMDM) supplémenté avec 3 % de FBS. Fig. 1. Dans le but d’étudier le NutraStem™ et ses ingrédients dans un modèle in vitro de stress oxydatif, nous avons décidé d’utiliser un modèle à base peroxyde d’hydrogène (H2O2) sur des cellules murines, qui sont à l’origine des cellules de la microglie mises en culture (A) et des cellules murines, qui sont à l’origine des cellules neurales (B). Les cellules ont été mises en culture sur des plaques microtitres de 96 puits (5*104/puit) en utilisant un médium complet (médium minimum essentiel contenant 5 % de SFB, 2 mM de glutamine, 100 U/ML de pénicilline, 0.1 µg/mL de streptomycine, et 0.05 mm de 2-ME). Les cellules ont ensuite été traitées avec des extraits naturels (BB et GT) ou des composants naturels (Ca et Vitamine D3) et leur combinaison (NutraStem™). Après 6 heures, le H2O2 a été ajouté et les cultures ont été remises à incuber pour le reste de la période de 24 heures. Après le traitement, le surnageant a été collecté puis testé pour le relâchement de LDH comme décrit dans matériel et méthodes. Les données ont été représentées comme le pourcentage de mort cellulaire (relâchement de LDH) sur la mort cellulaire totale (max. de relâchement de LDH). Pour A et B, une analyse de variance unilatérale ANOVA suivi d’une comparaison post hoc (Bonferroni) a révélé une différence significative entre BB ou GT et le contrôle (*P < 0.01) comme indiqué. De plus, cette analyse a également révélé une plus grande différence entre le NT-020 (NutraStem) et le contrôle (*P < 0.005).
4.
REJUVENATION RESEARCH Volume 10,
Number 2, 2007 © Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/rej.2006.0515 RESULTATS Des produits naturels réduisent le stress oxydatif des cellules murines d’abord mises en culture in vitro On a pu observer que la myrtille (BB), le thé vert (GT), la carnosine (Ca), la vitamine D3 (D3) et leur combinaison (NT-020 (NutraStem)) réduisait le stress oxydatif des cellules murines mises en cultures (Fig. 1). La viabilité des cellules a été déterminée par un test LDH et affichée comme le pourcentage moyen de mort cellulaire chez chaque groupe traité, sur ± l’écart type par rapport à la mort cellulaire totale (ET ; lyse cellulaire, relâchement maximal de LDH). Les témoins sont des cellules mises en culture dans les mêmes conditions (H2O2 inclus) sans qu’aucun extrait ou composant n’ait été ajouté. Les résultats Fig. 2. Au cours d’un nouveau test sur les effets du montre une diminution significative du NutraStem™ in vivo, les souris ont reçu 13.5 mg/kg/jour (faible relâchement de LDH pour les extraits naturels de dose) ou 135.0 mg/kg/jour (forte dose) de NutraStem™ ou de BB et de GT mais pas pour la Ca et la D3 lorsqu’ils l’eau (n = 5/goupe) pendant 14 jours par gavage oral. Au 15ème jour, la moelle osseuse est isolée et mise en culture comme décrit sont utilisés en traitement individuels (* indique plus haut et traité avec diverses doses de H2O2. Comme nous l’importance. Lorsque ces extraits et composants pouvons l’observer dans la Figure 2, le traitement au sont utilisés en combinaison, nous avons observé NutraStem™ a significativement atténué la mort cellulaire due un effet synergique, il en résulte une plus grande aux attaques oxydatives. Les données ont été représentées comme diminution du relâchement de LDH. le pourcentage de mort cellulaire (relâchement de LDH) sur la mort cellulaire totale (max. de relâchement de LDH), pour chaque dos de H2O2 administrée. Une ANOVA suivi d’une Effets des doses orales faibles et élevées du comparaison post hoc (Bonferroni) a révélé une différence traitement au NT-020 (NutraStem) sur le stress significative entre les faibles et fortes doses par rapport au oxydatif chez les souris contrôle pour chaque concentration de H2O2 (P < 0.05). La moelle osseuse isolée des souris De plus, il a résulté une plus grande BALB/c gavées soit avec une dose faible, soit avec diminution du relâchement de LDH due à une dose élevée de NT-020 (NutraStem) a été l’administration de H2O2 aux cellules des animaux capable de réduire le stress oxydatif du H2O2 ayant été traités à fortes doses, montrant une administré en culture (Fig. 2). différence significative à la fois avec le groupe de Les résultats de cette étude in vivo ont contrôle et le groupe traité à faibles doses. montré qu’il y avait une diminution du relâchement de LDH dépendant de la dose DISCUSSION administrée, et que cette diminution correspond à Dans cette étude, nous avons démontré la diminution de la concentration de H2O2 pour la première fois, que la formule brevetée à administré. La viabilité cellulaire a été affichée base de produits naturels, NT-020 (NutraStem), comme étant le pourcentage de mort cellulaire connue pour améliorer la prolifération de cellules pour chaque concentration de H2O2 administrée par souches groupe de gavage, sur ± l’écart type par rapport à humaines, réduisait également le stress oxydatif, la mort cellulaire totale (lyse cellulaire, un processus physiologique bien connu associé au relâchement de LDH maximal). Le traitement à vieillissement et qui diminue la capacité des base de faibles doses de NT-020 (NutraStem) a cellules souches à se renouveler elles-mêmes. L’un affiché une diminution significative du des atouts majeurs de cette étude était de montrer relâchement de LDH pour la plupart des que non seulement le NT-020 (NutraStem) concentrations de H2O2 administrées par rapport au réduisait le stress oxydatif in vitro, mais groupe de contrôle.
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REJUVENATION RESEARCH Volume 10,
Number 2, 2007 © Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/rej.2006.0515 également, qu’en fonction de la dose administrée, temps dure la protection contre l’oxydation du NT- il améliorait la viabilité des cellules de moelle 020 (NutraStem). osseuse et améliorait la résistance de ces cellules Pendant que des millions de dollars sont face aux attaques oxydatives in vivo lorsqu’il était actuellement dépensés pour étudier le administré oralement à des souris pendant 2 fonctionnement des cellules souches, peu de semaines. Ces découvertes suggèrent que le NT- recherches ont été dédiées pour déterminer quels 020 (NutraStem) pourrait avoir la capacité à nutriments naturels provenant d’aliments ou de améliorer la viabilité des populations de cellules plantes pourraient être utilisés pour optimiser la souches et à réduire les effets du stress oxydatif production ou le maintien de la santé cellulaire de chez les humains en administration orale, sous la populations de cellules souches endogènes forme d’un complément alimentaire. existantes. Il est clair que la recherche en ce sens Testé individuellement, les composants du porte un énorme potentiel dans le développement NT-020 (NutraStem) étaient efficaces pour de possibilités thérapeutiques sûres et inexploitées. diminuer la mort cellulaire dans des cultures De plus, parce que les ingrédients proviennent de microgliales et neuronales in vitro. la nature, ils sont souvent plus sûrs que des De plus, Lorsque la combinaison de ces produits pharmaceutiques ou que des thérapies composants est étudiée, les effets additif et invasives à base de cellules qui sont coûteuses. Au synergique ont montré une diminution bien plus final, ils requièrent souvent moins d’études importante (> 50 %) de la mort cellulaire liée à toxicologiques précliniques et peuvent entrer dans l’oxydation. Cet effet à également été observé in des essais cliniques très rapidement. Nous avons vivo avec l’administration de faibles ou fortes pour espoir que le NT-020 (NutraStem) serve de doses de NT-020 (NutraStem). Les résultats ont preuves de concept pour cette approche montré une diminution significativement thérapeutique et préventive de la santé. importante de la mort cellulaire lorsqu’une forte En conclusion, nous avons démontré que dose était administrée pour différentes le NT-020 (NutraStem), qui améliore la concentration de H2O2, alors que l’administration prolifération de cellules souches hématopoïétiques d’une faible dose montrait également une humaines in vitro comme il l’a été prouvé diminution significative par rapport au groupe de précédemment, réduit l’apoptose lié au stress contrôle (> 25 %). Ces traitements ont montré leur oxydatif des neurones murins et de la microglie en effets protecteurs face aux attaques oxydatives et à culture. De plus, lorsqu’il est pris oralement la mort cellulaire induite par l’exposition au H2O2. pendant 2 semaines, les cellules souches de moelle Un aspect intéressant de ce résultat est que le NT- osseuse des souris mises en culture ont montrées 020 (NutraStem) augmente la résistance des une diminution de l’apoptose lié au stress oxydatif cellules de moelle osseuse face aux attaques dépendante de la dose administrée. Ces oxydatives, même après que le NT-020 découvertes forment les bases de la conduite d’un (NutraStem) ait disparu, puisqu’il n’a pas été essai clinique qui déterminerait si le NT-020 rajouté aux cultures après que les cellules aient été (NutraStem) montrerait des effets similaire au prélevées des souris. Ceci suggère que le NT-020 niveau de l’amélioration de la santé chez les (NutraStem) produit des changements au niveau humains. cellulaire qui augmente la viabilité de ces cellules et le rend plus résistantes face aux attaques PRECISIONS oxydatives. Des travaux plus approfondis seront nécessaires pour déterminer le mécanisme de cet P.B. et P.R.S sont les fondateurs et R.D.S et J.T. effet. De plus, de nouvelles études sur les capacités sont consultants pour Natura Therapeutics, Inc. du NT-020 (NutraStem) à balayer les réactifs à (Tampa, FL), une société USF-spin out. l’oxygène chez des animaux plus âgés pourraient fournir un aperçu de sa capacité à limiter les dommages oxydatifs, qui sont connus pour augmenter avec l’âge. Des affinements dans le dosage pourraient nous éclairer sur combien de
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Number 2, 2007 © Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/rej.2006.0515 REFERENCES plasticity and cognitive behavior by shortshort-term blueberry supplementation in aged rats. Nutr Neurosci 2004;7:309-316. 2004;7:309 16 1 Gemma C, Mesches MH, Sepesi B, Choo K, Holmes DB, English D. The hope and hype of nonembryonic stem cells. J Bickford PC. Diets enriched in foods with high antioxidant Hematother Stem Cell Res 2003;12:253-254. 2003;12:253 2 activity reverse age-induced decreases in cerebellar beta- induced Semba RD, :argolick JB, Leng S, Waltson J, Ricks MO, Fried adrenergic function and increases in proinflammatory LP. T cell subsets and mortality in older community-dwelling community cytokines. J Neurosci 2002;22:6114-6120. 2002;22:6114 women. Exp Gerontol 2005;40:81-87. 17 3 Hipkiss AR, Preston JE, Himsworth DT, Worthington VC, Ito K, Hirao A, Arai F, Takubo K, Matsuoka S, Miyamoto K, Keown M, Michaelis J, Lawrence J, Mateen A, Allende L, Ohmura M, Naka K, Hosokawa K, Ikeda Y, Suda T. 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