Réponse immunitaire intra-ganglionnaire in situ

1. Objectifs de cet exposé…
• à partir de l’enseignement initial de l’année dernière
• Une synthèse et une approche de la
physiologie immunitaire in situ du système
lymphoïde avec
– un approfondissement du concept de circulation
des cellules
– des données quantitatives, des données cinétiques
• pour comprendre les différentes fonctions
de surveillance immunitaire,
d’amplification,
de spécificité immunologique,
de mémoire immunitaire,
Il y a de la vie dans un ganglion!

2. Physiologie
Circulations sanguine et lymphatique
• Débit sanguin: volume 5.6L, 7600L par jour
pompés par le cœur, 1mn pour le tour du
corps
• Volumes cellules exclues: 3L circulant, 12L
interstitiel
– 20 litres environ par jour seraient filtrés au
niveau capillaire, 17L retournent dans le
sang, 3L renouvelant les liquides
interstitiels

3. Organes lymphoïdes secondaires:
•Le Système immunitaire est unique!
Les cellules ne sont pas confinées dans un organe,
elles sont en circulation continue dans
l ’organisme
•les lymphocytes non seulement quittent le sang
et pénètrent dans les tissus lymphoïdes (ou non)
•mais aussi recirculent vers le sang via la
circulation lymphatique

4. Evolution des concepts
• on a cru longtemps que les lymphocytes étaient des
cellules nouvellement formées en permanence
• J. Gowans (1957- 1964 chez le rat)
• Or, après canulation du canal thoracique… il y a perte
progressive de lymphos
• Une réinjection de cellules (marquées) corrige la
lymphopénie
• Et des cellules marquées sont retrouvées dans le canal
thoracique
• B. Morris (1960-1970 in vivo chez le mouton)
• un seul lymphatique efférent accessible chirurgicalement
drainé dans canal thoracique
– [chez l’homme, les ganglions sont en chaînes]
– [une autre limite, ganglion sous-cutanés seuls étudiés]

5. OBJECTIFS du système lymphoïde
• La circulation permet la rencontre antigènes et
cellules immunocompétentes:
(1) Surveillance immunitaire
La réponse immunitaire se passe dans les
tissus!
– Coopérations cellulaires: amplification (2)
– Production d’effecteurs spécifiques(3)
– Anticorps spécifiques de haute affinité,
– Cellules spécifiques
– Mémoire immunitaire (4)
– Réponses primaire et secondaire
– Switch et mutations somatiques

6. Les organes lymphoïdes
secondaires
• ANATOMIE/HISTOLOGIE
– Les GANGLIONS #500! filtrent la lymphe à la
recherche d ’antigènes exogènes (lymph node)
– La RATE filtre le sang (Ag endogènes)
– Le MALT (système lymphoïde annexé aux
muqueuses)
• transcytose des antigènes via cellules
spécialisées des interfaces épithéliales
muqueuses, les cellules M des plaques de
PEYER

7. Spleen vs Lymph Node

8. VASCULARISATION
• Anatomie de la vascularisation sanguine et lymphatique
( chez les vertébrés)
– 6 à 12 lymphatiques afférents par ganglion récupèrent les
cellules (de toutes natures) passant à travers des tissus non
lymphoïdes (peau par ex)
– Une vascularisation sanguine afférente
– Un lymphatique efférent (seuls les lymphocytes sortent)
• Circulation
– Au moins 2 pools de lymphocytes recirculent préférentiellement
à travers
• les ganglions mésentériques
• les ganglions sous cutanés
– + le pool de cellules circulant à travers les autres tissus
intermédiaires

9. Les cellules
des organes lymphoïdes secondaires
• Les Lymphocytes B et T
– le terme « lymphocyte » vient de lymphatiques
– centrocyte, centroblaste, plasmocyte
– 65% de cellules T (CD4 45% CD8 15%), 25% de cellules B
• Les CPA, « cellules présentatrices d’antigène »
– Cellules dendritiques
– Cellules folliculaires dendritiques (FDC)
– Macrophages
• Cellules endothéliales
– + la matrice extra-cellulaire

10. Combien de lymphocytes entrent …
et sortent des ganglions?
• un ganglion de 1 gramme = 2 109
cellules
• entrée sanguine: 108
cellules par heure (1/10000 du débit
cardiaque)
– 1/4 pénètre dans le tissu via les HEV (25x106
cellules/heure)
• entrée lymphatique: (10 lymphatiques = 10x106
cellules/heure)
– 90% lymphocytes, 10% macrophage-like ou dendritiques
– venant de tissus non-lymphoïdes où recirculent des
lymphocytes
• sortie lymphatique: 30x106
cellules/heure
– 100% lymphocytes (5% fabriqués in situ, 10% de la lymphe
afférente, 85% du sang afférent)
• sortie sanguine ???
dans les tissus lymphoïdes
• 5 1011
cellules par jour, <2% dans le sang
(30minutes)

11. HEV
• High Endothelial Venules ou veinules post-capillaires
– Une morphologie distincte chez l ’homme,
– L’expression de récepteurs cellulaires (adressines
vasculaires PNAd (ganglion), MAdCAM1 (muqueuses))
• difficiles à cultiver in vitro
• in vitro assays,
• importantes pour la spécificité d ’organe de la migration
lymphoïde (greffes de ganglions gardant leur spécificité!)
– CD22 lectin homing receptor for mucosal HEVs

12. Que doivent faire les cellules
dans les organes lymphoïdes secondaires?
• Entrer dans les ganglions
– Via les lymphatiques
– Depuis le sang, via les HEV
– Où? dans les zones paracorticales
• Traverser les tissus extravasculaires
– y rencontrer d’autres cellules,
– proliférer,
– être sélectionnées,
– se différencier,
– mourir …
• Sortir dans la lymphe efférente

13. TNF, TGFβ, IL-1
IL-1, IL-6, TNF
GM-CSF, G-
CSF,
M-CSFIL-1
IL-1
IL-8
Fibroblastes
Lymphocyte
T activé
Prolifération clonale :
cellules T effectrices et mémoire
Prolifération clonale :
plasmocytes et cellules B mémoire
Lymphocyte
T
cytotoxique
(CTL)
Cellule NK
Eosinophiles
Hématopoïèse
Cellules endothéliales
Neutrophiles
Lymphocyte B
Lymphocyte T
CPA
Lymphocyte
B activé
IL-3, IL-6
IL-7, GM-CSF
IL-3, IL5
IL-2, IFNγ
IL-4, IL-5, IL-10
IL-6
Hypothalamus
TNF, TGFβ, IL-1

14. Ganglion: les antigènes
• Captation 90% Ag
• Zone T interfolliculaire: peu d ’antigène sauf dans
les cellules dendritiques
– Les cellules T voient les Ag processés
• Follicules lymphoïdes:
plein d ’antigène après injection sur FDC
– Les cellules B voient les Ag intacts

15. Quelles interactions permettent le positionnement
des cellules dans le ganglion?
• Des interactions cellulaires
• Les cellules dendritiques expriment DC-CK1 pour attirer les
cellules T naïves CD45RA+, et les B CD38-
• Des cellules stromales
• Un gradient de molécules solubles
• IFN-αλπηα, gammaTNF-αλπηα
• Des chimiomokines spécifiques
• SLC interfolliculaire pour les lymphocytes T
• SDF-1 pour B et T
• CCL21 pour T
• Des interactions avec la matrice extracellulaire
(collagène, Fn, Ln…)

16. Les centres germinatifs:
• un environnement unique où
• des Lymphocytes B
• sont activés,
• prolifèrent,
– bénéficient d ’une expansion clonale
– (hyper)mutent leurs immunoglobulines
– subissent un processus de sélection drastique, basé sur leur
affinité pour l ’antigène
• se différencient… en plasmocytes
• et meurent++

17. Le centre germinatif
• Zone sombre (proche zone T): cellules en prolifération
– Mutation somatique des centroblastes en prolifération
• Zone claire: cellules en sélection
– Sélection des centrocytes de haute affinité par liaison aux
complexes Ag-AC sur les cellules dendritiques folliculaires
– Si faible affinité:  apoptose
• Pour les survivants
– Commutation de classe ou Switch (M,D… G, A, E)
– Maturation
• en cellules mémoire et en plasmocytes

18. Composition cellulaire des centres
germinatifs
• Les cellules folliculaires dendritiques définissent
le lieu de formation des centres germinatifs
• Elles secrètent BLC, une CXC chémokine attirant des cellules
CXCR5+
• Quelques cellules T spécifiques de l’antigène
• Une majorité de cellules B spécifiques de l’antigène, avec
un phénotype évoluant de la zone sombre à la zone claire
• D’abord B matures: IgM+, IgD+, CD23+
• Puis perdent leurs IgD
• Deviennent bcl2low, PNA+, CD24+, CD23dim
• Enfin réexpriment RAG

19. antigène antigène
latence latence
IgM IgM
IgG
IgG

20. Evolution des centres germinatifs
• Réponse primaire
– Activation de petits lymphocytes B (recirculants)
• (G0-G1… Ag et T dépendant)
– J 2-4: Follicules primaires (blastes B Ag-spécifiques dans le
réseau de FDC), d ’abord polyclonal
– J 4 : pic de prolifération +++, cycles de 6-7h
– J 4-6: « compartimentalisation » en centroblastes et
centrocytes
– J 7-14: formation continue de centrocytes (plateau)
– Puis diminution rapide de l ’activité proliférative
• Réponse secondaire
– pic à J2
– prolifération plus réduite paradoxalement

21. Différenciation et Apoptose
• Centroblastes:
– début d’hypermutation des sites de liaison à l’Ag
• Centrocytes:
– sélection positive basée sur leur affinité pour l ’Ag
sur les cellules folliculaires dendritiques
• signaux de survie ICAM-1, VCAM-1, CD23 sur les FDC
• vs LFA-1, VLA-4, CD21 sur les B
– Devenir des centrocytes survivants:
• Précurseurs de plasmocytes (réponse secondaire)
• Cellules B mémoire (lieu de résidence?)
• Retour zone sombre

22. Applications expérimentales et
cliniques
• Expérimental
– Local lymph node assay (LLNA)
• Sensibilisation cutanée
– Popliteal lymph node assay (PLNA)
• Injection sous-cutanée
• Clinique: hyperplasies
folliculaires
– Défense anti-infectieuse
– Hypersensibilités
– Autoimmunité

23. Physiologie
et Pathologies
• Physiologie
– Défenses anti-infectieuses
– Défenses anti-tumorales
• Pathologies
• Allergies
• Autoimmunité
• +
• Envahissement ganglionnaire métastatique (TNM)
• Prolifération de cellules immunocompétentes (B, T,
NK, DCs…)

24. Mouvements cellulaires « live »
In vivo imaging
• SCIENCE May 2002
http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/296/5574/1869
– Lymphocyte motility is vital for trafficking within lymphoid organs
and for initiating contact with antigen-presenting cells. Visualization
of these processes has previously been limited to in vitro systems.
We describe the use of two-photon laser microscopy to image the
dynamic behavior of individual living lymphocytes deep within intact
lymph nodes. In their native environment, T cells achieved peak
velocities of more than 25 micrometers per minute,
displaying a motility coefficient that is five to six times
that of B cells. Antigenic challenge changed T cell
trajectories from random walks to "swarms" and stable
clusters.
– Two-photon microscopy analysis of leukocyte
trafficking and motility.
– Okada T. Semin Immunopathol. 2010
Sep;32(3):215-25.

25. Une video sur WEHI-TV, Un site
plein d’images, une video à Stanford
• WEHI = Walter & Eliza Hall Insitute of Medical Research Parkville,
La Trobe, Melbourne depuis 1915
– Fighting infection with clonal selection (4’43)
• Burnet FM Nobel Prize 1960
• Miller J (rôle du thymus en 1961)
– http://www.wehi.edu.au/education/wehitv/the_immune_system
• Art Anderson (IL-8) Anatomy and Physiology of
Lymph Nodes (http://artnscience.us/)
• Video of innate immune reaction in LN
– http://scopeblog.stanford.edu/2013/01/16/video-of-
innate-immune-reaction-in-the-lymph-node/