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Qu’est-ce que c’est une protéine ?
                                    Des molécules          toutes formées d'un
                                     biologiques            squelette carboné



              De faible masse                           Macromolécules
               moléculaire



                                            Protéines       Acides       polysaccharides
Acides gras   sucres nucléotides   Acides
                                                          nucléiques
                                   aminés
                                                                            Amidon
                                                           ADN, ARN        Glycogène
Primaire

                       Acides aminés

Feuillet bêta   Hélice alpha



                           Secondaire




                           Tertiaire




                           Quaternaire
Fonctions des protéines
Structurale     Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres.
                Celles-ci se trouvent dans tous les animaux. Elles sont
                secrétées par les cellules le tissu conjonctif comme les
                fibroblastes, ainsi que par d’autres types des cellules. Le
                collagène est le composant le plus abondante de la peau
                les tendons et les os. Le collagène représente le 25% de
                la masse totale de protéines chez les mammifères.
Fonctions des protéines
Immunitaire     Les anticorps
                     Paratope




                                            Groupe   Groupe   Groupe     Groupe
                                               A        B       AB         O


                                Globules
                                 rouges



                                Anticorps
                                            Anti-B   Anti-A   Aucun     Anti-A Anti-B


                                Antigènes
                                              A        B       A et B      Aucun
Fonctions des protéines
Catalytique     Les enzymes. Ces protéines ont la
                propriété de catalyser ou accélérer
                les réactions chimiques qui ont lieu
                dans les cellules et dans les milieux
                extracellulaires. Si les enzymes
                n’étaient pas présents, les réactions
                chimiques se feraient à une vitesse
                si faible que la vie ne serait pas
                possible.
Biosynthèse de protéines
Le code génétique universel
Production de protéines thérapeutiques
La déficit de production de certaines protéines
ou la production de certaines protéines non
fonctionnelles dans l’organisme amène
fréquemment à des maladies qui peuvent être       Cependant, de nombreuses protéines
graves.                                           humaines      ayant     une      valeur
                                                  pharmaceutique importante sont
Ces maladies peuvent parfois être traitées par    obtenues difficilement à partir de leur
l'administration clinique de la protéine          source naturelle.
provenant       de      sources      externes.
                                                  La     technologie   de   protéines
                                                  recombinantes, apparue à la fin des
                                                  années 70, offre une plateforme
                                                  technique très puissante pour la
                                                  production contrôlée de protéines
                                                  d'intérêt   par    des  procédures
                                                  relativement       bon     marché.
Recombinaison génétique
  Les protéines recombinantes sont des
  protéines produites par des cellules dont l'ADN
  a été modifié par recombinaison génétique.




La recombinaison génétique est un
échange d‘information génétique
entre deux génomes différents.
                          Un gène codant une
                          protéine d'intérêt est
                          introduit dans le génome
                          de l'espèce productrice.




Les protéines recombinantes peuvent être purifiées
et utilisées à des fins thérapeutiques, industrielles
ou bien encore dans les activités de recherche.
Production de protéines
    recombinantes
Construction d’une molécule recombinante




    Plasmide d’expression




                                                       Gène de PqsD




                                       Plasmide recombinant
               Gène de PqsD provenant de
               Pseudomonas aeruginosa
Notre plasmide d’expression

                  PqsD
   6His




          pET28



   Ori                   Kan
Transformation de notre souche d’expression




         E. Coli BL21
Étapes pour la production de notre
                 protéine recombinante


                                                                                                                Milieu

   Pré-culture                Culture                      Centrifuger
                                                                                          Culot : Cellules

Inoculer notre           Inoculer 100 ml de milieu LB   Collecter les cellules par       Garder le culot cellulaire à
bactérie (souche         avec notre pré-culture de      centrifugation  à     7000       -20°C jusqu'au jour de la
d’expression) dans 5     façon à obtenir une D0600      rpm/15min/4°C                    lyse.
ml de milieu LB ou TSB   initiale de 0,05.
+ kan 30 µg/ml                                          Laver le culot cellulaire avec
                         Incuber à 37°C/240rpm          70ml de tampon de lavage.
Incuber à 37°C/over
night/sous agitation     Lors qu’une DO600 de 0,6 est   Recollecter les cellules par
                         atteinte, induire avec 1 mM    centrifugation    à     7000
                         d’IPTG final                   rpm/15min/4°C

                         Incuber 2h de plus
Étapes pour la purification de notre
               protéine recombinante



Culot : Cellules                    Lyse cellulaire                 Séparation de
                                                                 fractions cellulaires

 Lyse: Resuspendre le culot cellulaire   Séparation des fractions cellulaires:                            Fraction
 congelé à 20°C dans 6ml de tampon       Centrifuger à 20000xg/30min/4°C                                  Cytoplasmique
                                                                                     Fraction             (surnageant)
 de lyse Bugbuster®.                     pour     décanter     la    fraction        Membranaire
                                         membranaire.                                (culot)
 Vortexer pour détacher le culot des
 parois du tube en plastique.            Diluer le surnageant obtenu avec 6
                                         ml de tampon d’imidazole 10mM.
 Incuber sous agitation douce à                                                          Étant donné que notre protéine
 température pièce pendant 20            Filtrer avec un filtre de 0,2µm pour            recombinante se trouve soluble
 minutes.                                éliminer les débris cellulaires en              dans le cytoplasme, on purifiera
                                         suspension.                                     donc notre protéine à partir de
                                                                                         cette fraction.
Chromatographie d’absorption ou d’affinité

    Les chromatographies d'adsorption est un méthode de séparation où la
    molécule d'intérêt d'un mélange complexe est isolée des autres constituants
    parce qu'elle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait la
    chromatographie.


Mélange           Peu                Beaucoup
complexe    d’affinité               d’affinité




              Élimination
              de protéines
              non-                   Élution de la
              spécifiques            protéine
              du mélange             d’intérêt
                                     pure
                                                              FPLC Fast protein liquid
                                                                 chromatography
Étapes de la chromatographie d’affinité
       1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml de
           l’eau distillée à débit de 5ml/miné. Cette étape permet d’éliminer
           l’éthanol qui est présente dans la colonne.

       2. Équilibration de la colonne: Équilibrer la colonne en passant 25ml d’une
           solution d’imidazole 10mM à débit de 5ml/min.

       3. Injecter l’échantillon contenant notre protéine à débit de 1ml/min.
5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solution
    d’imidazole 10mM pour éliminer les protéines non
    spécifiques liées à la colonne. Débit 2ml/min pendant
    7,5 minutes.

6. Élution: Éluer notre protéine recombinante en faisant un
    gradient linéaire d’imidazole de 10mM à 250mM. Débit
    2ml/min pendant 50 minutes.



                          Imidazole
Imidazole
                                                                             250mM




                          Étape d’élution.
                      Concentration croissante
                       d’imidazole (Gradient)




Étape d’injection et lavage.
 Concentration constante
   d’imidazole (10mM)




 Collecte le volume                     Fractions d’élution collectées de 2ml
        mort
Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGE
  L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère)
                                 sous l'effet d'un champ électrique.
On fait bouillir un mélange de protéines en        Ces charges se repoussent et déplient les
présence :                                         chaînes polypeptidiques.

•d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol       En conséquence :
qui réduit les ponts disulfure.                    •les protéines sont dénaturées : elles ont perdu
                                                   leur structure tridimensionnelle native
•d'un détergent anionique fort : le SDS qui
enveloppe les chaînes polypeptidiques des          •les protéines n'ont plus de ponts disulfure :
protéines de charges négatives.                    elles sont sous une forme monomérique
Électrophorèse SDS-PAGE
                         Fractions à analyser:
                         Volume mort, fraction 10, 15, 20, 25, 30,
                         35, 40, 45, 50, contrôle positif.

                         Préparation des échantillons:
                         Volume de fraction:               80µl
                         Volume de loading buffer (5x)     20µl
                         Volume final:                    100µl

                         Chauffer   l’échantillon       préparé    à
                         95°C/5min.

                         Déposer entre 60 à 80µl dans les puits.
         Direction de
      l’électrophorèse   Migrer à 70 volts/over night

                         Lorsque le gel aura migré complètement,
                         colorer à l’argent

                         Vérifier le présence d’une bande
                         correspondant à notre protéine d’intérêt.

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Expression d'une protéine recombinante

  • 1. Qu’est-ce que c’est une protéine ? Des molécules toutes formées d'un biologiques squelette carboné De faible masse Macromolécules moléculaire Protéines Acides polysaccharides Acides gras sucres nucléotides Acides nucléiques aminés Amidon ADN, ARN Glycogène
  • 2.
  • 3.
  • 4. Primaire Acides aminés Feuillet bêta Hélice alpha Secondaire Tertiaire Quaternaire
  • 5. Fonctions des protéines Structurale Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres. Celles-ci se trouvent dans tous les animaux. Elles sont secrétées par les cellules le tissu conjonctif comme les fibroblastes, ainsi que par d’autres types des cellules. Le collagène est le composant le plus abondante de la peau les tendons et les os. Le collagène représente le 25% de la masse totale de protéines chez les mammifères.
  • 6. Fonctions des protéines Immunitaire Les anticorps Paratope Groupe Groupe Groupe Groupe A B AB O Globules rouges Anticorps Anti-B Anti-A Aucun Anti-A Anti-B Antigènes A B A et B Aucun
  • 7. Fonctions des protéines Catalytique Les enzymes. Ces protéines ont la propriété de catalyser ou accélérer les réactions chimiques qui ont lieu dans les cellules et dans les milieux extracellulaires. Si les enzymes n’étaient pas présents, les réactions chimiques se feraient à une vitesse si faible que la vie ne serait pas possible.
  • 10. Production de protéines thérapeutiques La déficit de production de certaines protéines ou la production de certaines protéines non fonctionnelles dans l’organisme amène fréquemment à des maladies qui peuvent être Cependant, de nombreuses protéines graves. humaines ayant une valeur pharmaceutique importante sont Ces maladies peuvent parfois être traitées par obtenues difficilement à partir de leur l'administration clinique de la protéine source naturelle. provenant de sources externes. La technologie de protéines recombinantes, apparue à la fin des années 70, offre une plateforme technique très puissante pour la production contrôlée de protéines d'intérêt par des procédures relativement bon marché.
  • 11. Recombinaison génétique Les protéines recombinantes sont des protéines produites par des cellules dont l'ADN a été modifié par recombinaison génétique. La recombinaison génétique est un échange d‘information génétique entre deux génomes différents. Un gène codant une protéine d'intérêt est introduit dans le génome de l'espèce productrice. Les protéines recombinantes peuvent être purifiées et utilisées à des fins thérapeutiques, industrielles ou bien encore dans les activités de recherche.
  • 12. Production de protéines recombinantes
  • 13. Construction d’une molécule recombinante Plasmide d’expression Gène de PqsD Plasmide recombinant Gène de PqsD provenant de Pseudomonas aeruginosa
  • 14. Notre plasmide d’expression PqsD 6His pET28 Ori Kan
  • 15. Transformation de notre souche d’expression E. Coli BL21
  • 16. Étapes pour la production de notre protéine recombinante Milieu Pré-culture Culture Centrifuger Culot : Cellules Inoculer notre Inoculer 100 ml de milieu LB Collecter les cellules par Garder le culot cellulaire à bactérie (souche avec notre pré-culture de centrifugation à 7000 -20°C jusqu'au jour de la d’expression) dans 5 façon à obtenir une D0600 rpm/15min/4°C lyse. ml de milieu LB ou TSB initiale de 0,05. + kan 30 µg/ml Laver le culot cellulaire avec Incuber à 37°C/240rpm 70ml de tampon de lavage. Incuber à 37°C/over night/sous agitation Lors qu’une DO600 de 0,6 est Recollecter les cellules par atteinte, induire avec 1 mM centrifugation à 7000 d’IPTG final rpm/15min/4°C Incuber 2h de plus
  • 17. Étapes pour la purification de notre protéine recombinante Culot : Cellules Lyse cellulaire Séparation de fractions cellulaires Lyse: Resuspendre le culot cellulaire Séparation des fractions cellulaires: Fraction congelé à 20°C dans 6ml de tampon Centrifuger à 20000xg/30min/4°C Cytoplasmique Fraction (surnageant) de lyse Bugbuster®. pour décanter la fraction Membranaire membranaire. (culot) Vortexer pour détacher le culot des parois du tube en plastique. Diluer le surnageant obtenu avec 6 ml de tampon d’imidazole 10mM. Incuber sous agitation douce à Étant donné que notre protéine température pièce pendant 20 Filtrer avec un filtre de 0,2µm pour recombinante se trouve soluble minutes. éliminer les débris cellulaires en dans le cytoplasme, on purifiera suspension. donc notre protéine à partir de cette fraction.
  • 18. Chromatographie d’absorption ou d’affinité Les chromatographies d'adsorption est un méthode de séparation où la molécule d'intérêt d'un mélange complexe est isolée des autres constituants parce qu'elle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait la chromatographie. Mélange Peu Beaucoup complexe d’affinité d’affinité Élimination de protéines non- Élution de la spécifiques protéine du mélange d’intérêt pure FPLC Fast protein liquid chromatography
  • 19. Étapes de la chromatographie d’affinité 1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml de l’eau distillée à débit de 5ml/miné. Cette étape permet d’éliminer l’éthanol qui est présente dans la colonne. 2. Équilibration de la colonne: Équilibrer la colonne en passant 25ml d’une solution d’imidazole 10mM à débit de 5ml/min. 3. Injecter l’échantillon contenant notre protéine à débit de 1ml/min.
  • 20. 5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solution d’imidazole 10mM pour éliminer les protéines non spécifiques liées à la colonne. Débit 2ml/min pendant 7,5 minutes. 6. Élution: Éluer notre protéine recombinante en faisant un gradient linéaire d’imidazole de 10mM à 250mM. Débit 2ml/min pendant 50 minutes. Imidazole
  • 21. Imidazole 250mM Étape d’élution. Concentration croissante d’imidazole (Gradient) Étape d’injection et lavage. Concentration constante d’imidazole (10mM) Collecte le volume Fractions d’élution collectées de 2ml mort
  • 22. Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGE L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique. On fait bouillir un mélange de protéines en Ces charges se repoussent et déplient les présence : chaînes polypeptidiques. •d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol En conséquence : qui réduit les ponts disulfure. •les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native •d'un détergent anionique fort : le SDS qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des •les protéines n'ont plus de ponts disulfure : protéines de charges négatives. elles sont sous une forme monomérique
  • 23.
  • 24. Électrophorèse SDS-PAGE Fractions à analyser: Volume mort, fraction 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, contrôle positif. Préparation des échantillons: Volume de fraction: 80µl Volume de loading buffer (5x) 20µl Volume final: 100µl Chauffer l’échantillon préparé à 95°C/5min. Déposer entre 60 à 80µl dans les puits. Direction de l’électrophorèse Migrer à 70 volts/over night Lorsque le gel aura migré complètement, colorer à l’argent Vérifier le présence d’une bande correspondant à notre protéine d’intérêt.