Authentification et quantification des espèces animales dans les produits transformés. Jean-Philippe ROSEC (DIRECCTE - Service Commun des Laboratoires).

1. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE
SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER
EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"
Jean-Philippe Rosec - SCL

2. REGLEMENTATION EN MATIERE DE PRODUITS A
BASE DE VIANDE ET D’IDENTIFICATION DES
ESPECES ANIMALES
(REVUE TRES PARTIELLE)
• Directive 2000/13/CE: étiquetage des produits alimentaires – ne pas induire
en erreur le consommateur […] sur sa véritable nature et identité…
• Règlement (CE) 1760/2000 établissant un système d'identification et
d'enregistrement des bovins et concernant l'étiquetage de la viande bovine et
des produits à base de viande bovine (et modalités d’application dans R (CE)
1825/2000) → Carcasses et viandes à l’abattoir
«viande bovine»: tous les produits relevant des codes NC 0201, 0202, 0206 10 95 et 0206 29 91 +
définition viande hâchée, viande découpée, chutes de parage
• Règlement (CE) 854/2004 fixant les règles spécifiques d'organisation des
contrôles officiels concernant les produits d'origine animale destinés à la
consommation humaine + R (CE) 853/2004 fixant des règles spécifiques
d'hygiène applicables aux denrées alimentaires d'origine animale (→ définit VSM:
exclues des viandes par Dir 2000/13/CE et R (CE) 1169/2011. Définit viandes hâchées, produits et
préparations à base de viandes)
• Code des usages de la charcuterie, de la salaison et des
conserves de viande

3. R (CE) 853/2004:
• Viandes = parties comestibles des animaux […] y compris le sang.
• Définit également les abats: viandes fraîches autres que celles de la
carcasse, y compris viscères et sang
Code de la consommation:
• Viandes = Les muscles squelettiques (inclus diaphragmme et
masséters, exclus cœur, langue, muscles de la tête autres que
masséters, du carpe, tarse et queue) avec tissus naturellement inclus
adhérents; avec teneurs max en MG et collagène définies.
Code des usages de la charcuterie:
• Définit précisément les abats; également le « Maigre » et les viandes
déshydratées, le « Gras » (reprise textes et normes existantes)
• Définit de nombreuses préparations. Ex: Pâtés, mousses, terrines de
(espèce): maigre, abats ou gras → au moins 20% de la masse nette du
produit à la mise en œuvre, hors décor, substances d’enrobage, croûte,
etc…

4. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
• Les moyens et les méthodes
→ Cibles protéiques
IsoElectroFocalisation (produits laitiers,
poissons, uniquement produits non dénaturés) pas de
quantification
Détection d’antigènes: Ouchterlony,
immuno -histologie, ELISA, …
Spectrométrie de masse (QTof):
gélatines porcines et bovines, développements?
Actuellement: essentiellement les tests ELISA

5. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
• Les moyens et les méthodes
→ Cibles nucléiques
ADN nucléaires, ADN mitochondriaux
(produits transformés): PCR et "dérivés" « (RFLP,
puces à ADN, électrophorèse capillaire, …)
PCR en point final vs PCR en
temps réel (dite "quantitative" car permettant de
quantifier l’ADN)
Actuellement:
Cible exclusive: ADN mitochondriaux
Toutes ces techniques sont employées pour l’identification
Pour la (semi) quantification (?): PCR en temps réel

6. ADN nucléaires
• rRNA 18S (gènes codant pour les ARN 18S)
• ADN satellites (profils mais aussi possibilité
d’amplifications spécifiques)
• gènes (K caséine, hormone de croissance, …)
→Spécificité, mais: sensibilité aux traitements (thermiques
notamment), monocopies, problème de disponibilité des
séquences, …
ADN mitochondriaux
• cytb
• rRNA 12S, cytochrome oxydase (COX)
→ Structure circulaire (résistance), multicopies, outils
phylogéniques (disponibilité des séquences) mais: variabilité,
taille des séquences. Possibilités de PCR spécifiques ou
"universelles" (transvertébrés, …)

7. Test ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Principe

8. ADN cible
(ouvert par la chaleur)
Taq polymérase
amorces
dNTP
La PCR - Rappels
Polymerase Chain Reaction ou Amplification en Chaîne par Polymérase
(Vocabulaire de la génétique - JO 23/11/2006)

9. Apparition du produit de PCR visualisée et mesurée par
fluorescence au cours de la réaction. Fluorescence spécifique
(sondes) ou non (agents intecalants)
100 ng/µl
10 ng/µl
1 ng/µl
0,1 ng/µl
Produit PCR peut également être révélé en
électrophorèse capillaire, ou après hybridation sur
puce à ADN (avec sondes spécifiques),
La PCR en point final
La PCR en temps réel
ou PCR quantitative

10. ELISA vs PCR
AVANTAGES
INCONVENIENTS
ELISA
PCR
Détection des protéines
(pas ou peu
dénaturées)
Détection ADN, y
compris dans produits
appertisés
Ne fonctionne pas sur
produits appertisés
Détection ADN: pas de lien
avec le tissu d’origine
Seuils de détection
relativement élevés (#
1%)
Seuils de détection bas
(<1%, <0,1%, …)
Seuils de détection
relativement élevé (# 1%)
Seuils de détection bas
(<1%, <0,1%, …)
Matériel moins onéreux
que la PCR (en temps
réel)
Coût/échantillon
relativement peu élevé
Coût réactif /échantillon
important (ex: Cheval =
Matériel plus onéreux que
l’ELISA (PCR en temps réel)
Manipulations
relativement aisées
Réalisation et
validation possible de
protocoles « maison »
Boîte noire: difficultés à
évaluer les performances
d’un kit (sensibilité,
inclusivité/exclusivité) d’un
lot à l’autre
Manipulations délicates
(risques contaminations
croisées notamment)
(semi)-quantification
possible …… ?
(semi)-quantification
délicate voire impossible… ?
Confirmation possible
par séquençage
(produits PCR > 100pb)
ELISA
PCR

11. IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
Méthodes
Identification
Quantification
Immunoenzymatiques
(ELISA)
oui
(oui)
PCR en point final
oui
non
non
+ RFLP
Oui
(variabilité + hétéroplasmie)
+ PUCES à ADN
+ électrophorèse
capillaire
PCR en temps réel
oui
oui
non
?
oui
oui
(de l’ADN)
Spectrométrie de masse des
protéines (QTOF)
oui
(développement)
?

12. I
D
E
N
T
I
F
I
C
A
T
I
O
N
IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES (hors poisson)
STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE
SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER
Matières premières (minerais, viandes hâchées, VSM, …)
Produits transformés non appertisés
ELISA (Bovins, porcins, ovins, volailles, cheval)
PCR sur espèces non détectées par ELISA
Produits appertisés
PCR point final ou temps réel: porc, bœuf, âne, cheval, cerf,
chevreuil, lapin, lièvre, chèvre, mouton. Toutes espèces sur
viandes ou tissus non mélangés (cibles spécifiques ou
"universelles" + séquençage

13. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES (hors poisson)
STRATEGIES ET RETOUR D’EXPERIENCE
SCL LABORATOIRE DE MONTPELLIER
A
P
P
R
O
C
H
E
Q
U
A
N
T
I
T
A
T
I
V
E
Approche par matrice
• Porc dans merguez (ELISA)
• Oie/canard dans foie et bloc de foie gras (PCR temps réel)
→ Gammes permettant des résultats semi-quantitatifs (Non détecté,
<1%, 1% à 5%, 5% à 10%, 10% à 15%, >15%)
• Autres matrices (PCR temps réel) hors produits appertisés
→ Approche type seuil ou cut-off (ex: 1% viande de cheval). Les
résultats de Cq (ou Ct ou Cp) sont comparés à un seuil 1% (viande
type viande maigre). RESERVES! (voir cas de la crise viande de cheval)
→ Ordres de grandeur possibles à évaluer par comparaison avec
gammes MAIS matrice par matrice… concrètement difficile voire
impossible à réaliser sur échantillons complexes.

14. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"
Février 2013: Recommandation 2013/99/UE
→ Contrôles des denrées alimentaires commercialisées et/ou étiquetées
comme produits contenant du bœuf: détecter les positifs >1% (en masse)
• Recherche du cheval selon méthode du laboratoire de référence de l’Union
européenne pour la détection de protéines animales dans les aliments pour animaux:
+ addendum pour détermination du seuil de 1% (en masse)
http://eurl.craw.eu/en/164/legal-sources-and-sops
• PCR temps réel (amorces peu spécifiques – spécificité par sonde d’hydrolyse)
• Pas de quantification mais seuil (cut-off) de 1%:
Echantillon: analyse en double
Témoin 1% = Mélange 1% cheval (viande) / 4 prises d’essai en triplicat /
Cut-off = [moyenne des 12 mesures – 2 x écart-type] à comparer avec les 2 résultats
de l’échantillon…
• Réserves sur la nature des matrices –et spécialement la teneur en MG- dont dépend
la validité du seuil ainsi établi

15. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
EXEMPLE DE LA CRISE DE LA "VIANDE DE CHEVAL"
Observations au SCL Montpellier
• Sur produits appertisés, notamment raviolis, chili con carne, sauces
bolognaises et corned beef
→ Présence régulière d’ADN de cheval (prélèvements ciblés) souvent <1%,
mais….
→ Présence d’ADN bovin également <1% (cut-off établi de façon similaire) y
compris pour produits type Corned beef (viande bovine = 98% !)
→ La question de la fiabilité des analyses quantitatives, voire qualitatives, est
posée:
Effets des traitements appliqués aux matières premières, des
matrices complexes ?
Nature des matières premières: teneur en MG, teneur en ADN,
définition(s) de ce que l’on appelle "viande" (cf. définitions règlementaires)… ?

16. IDENTIFICATION / QUANTIFICATION
D’ESPECES ANIMALES
VERROUS TECHNOLOGIQUES
• (Semi)-Quantification délicate à mettre en œuvre
dans les produits alimentaires (matrice dépendante)
• Difficultés rencontrées par l’analyse PCR sur certains
produits appertisés
→ Identifier les causes = mieux connaître les matières
premières mises en œuvre
→ Identifier d’autres voies analytiques
Jean-Philippe Rosec - SCL

17. MERCI DE VOTRE ATTENTION
Jean-Philippe Rosec - SCL