Introduction
Avec l’augmentation de la pollution
environnementale le risque de contaminations
alimentaires préoccupe de pl...
À savoir:
I. Salmonella enterica serovar Typhimurium :
 Bactérie gram (-)
 responsable des symptômes qui vont de la diar...
Méthodes classique de détection de
contamination :
Méthode basée sur l’utilisation d’un
bactériophage rapporteur :
 Principe : insertion d’un gène rapporteur dans le génome...
Idée générale
SPC32H CDABE
SPC32H LUX CDABE
Bactériophage
de Salmonella
Typhimurium
Opéron
bactérien
Enzyme qui ce trouve dans les cellules des
organismes bioluminescents et qui catalyse
l’oxydation de la luciférine ( FMNH2...
Les gènes Lux
 Gènes responsables des réactions qui entrainent l’émission de lumière
 Ils sont utilisé dans la construct...
Milieux et conditions de cultures :
 37 ̊C – Aérobie
 Milieu LB ( bouillon – agar 1.5 % )
 Ampicilline (Ap) : 50 μg/ml
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plasmides :
 Souche : SR5100 ΔLT2gtrABC1 (32H); SR5003 lysogenized by SPC32H
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chromosomal gene
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2- Induction :
 Pousser la bactérie lysogène à libérer une grande
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3- Luminométrie:
 Appareil :
Luminomètre
 Fonction :
Mesurer une intensité lumineuse
( bioluminescence et ATP métrie )
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Génome
SPC32H
Gène Lux
CDABE
Taille
augmente de
15 %
Diminution du
pouvoir infectieux
du phage
Capacité de la tête du
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Choix et délétion des gènes non essentiels :
 Les gènes impliquées dans la conversion lysogénique :
• Antigène-O Acétylas...
Insertion du gène Lux :
I- Choix du site cible :
• Directement après le Promoteur de CPS
 Pourquoi ?
• Région transcrite ...
Insertion du gène Lux :
II- Préparation à l’insertion:
a. Le plasmide pBBRlux porte les gènes Lux ( AB ou CDABE)
b. Amplif...
Insertion du gène Lux :
III- Intégration au site cible
SPC32H KmR
pDS-Lux
Première recombinaison
homologue
Par compétition...
1- Contrôle de l’affinité du phage rapporteur
 But :
Savoir si la modification génétique de SPC32H a altérée son affinité...
 Résultats :
Cycle Lysogénique
présence de (Int )
L’ introduction du
gène lux AB n’a pas
altérée le pouvoir
infectieux de...
2- Validation de la production de bioluminescence par
le phage génétiquement modifié
 But :
Mettre en évidence la product...
 Résultats :
SPC32H-ABi-2 et
SPC32H-ABi-1 procurent
le même niveau de
bioluminescence
l’absence d’ intégrase
n’aboutit pa...
3- Contrôle de détection spécifique de
Salmonella vivante
 Test de l’affinité
 But :
Mesurer la quantité de salmonella d...
 Résultats :
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CFU/ml de
salmonella
Il y a corrélation entre la
valeur RLU et le nombre de
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3- Contrôle de détection spécifique de
Salmonella vivante
 Test de l’ habilitée de SPC32H-CDABE de détecter SEULMENT les ...
 Résultats :
Échantillons
contrôles
L’ intensité du signal
lumineux augmente avec
l’augmentation du taux
des cellules viv...
1- Contaminations artificielles des
échantillons alimentaires
 A- préparation de l’inoculum pour la contamination artific...
L’ intensité du signal
est moins important
que celui des autres
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 phage for detection of viable Salmonella typhimurium
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Development of an engineered bioluminescent reporter phage for the sensitive detection of viable Salmonella typhimurium

Because foodborne illnesses continuously threaten public health, rapid
and sensitive detection of pathogens in food has become an important issue. As an
alternative to time-consuming and laborious conventional detection methods, a
technique using recombinant reporter phages has been developed. Here, we developed
an advanced bioluminescent reporter phage SPC32H-CDABE by inserting a bacterial
luxCDABE operon into the Salmonella temperate phage SPC32H genome. Whole
SPC32H genome sequencing enabled the selection of nonessential genes, which can
be replaced with approximately 6-kb luxCDABE operon, which provides both
luciferase (LuxAB) and its substrate, fatty aldehyde, as generated by fatty acid
reductase (LuxCDE). Thus, the SPC32H-CDABE detection assay is simpler and more
efficient compared to the luxAB-based assay because the substrate addition step is
excluded. At least 20 CFU/mL of pure S. Typhimurium culture was detectable using
SPC32H-CDABE within 2 h, and the signals increased proportionally to the number
of cells contaminated in lettuce, sliced pork, and milk. These results thereby demonstrate that this phage successfully detects live
Salmonella without appreciable interference from food components. Furthermore, the presented data suggest that SPC32HCDABE
represents a promising easy-to-use diagnostic tool for the detection of Salmonella contamination in food.


Seongmi Kim,# Minsik Kim,# and Sangryeol Ryu*
Department of Food and Animal Biotechnology, Department of Agricultural Biotechnology, Research Institute for Agriculture and
Life Sciences, and Center for Food and Bioconvergence, Seoul National University, Seoul 151-921, South Korea

pubmed link :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24806327


french traduction and power point presentation by Liliane M. Lebanese university - Section 1 - Hadath
Biology department

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phage for detection of viable Salmonella typhimurium

  1. 1. Introduction Avec l’augmentation de la pollution environnementale le risque de contaminations alimentaires préoccupe de plus en plus la communauté vue les maladies sévères qu’elle pourrait engendrer. D’où l’importance de développer des méthodes pour une détection rapide de toute sorte de contamination.
  2. 2. À savoir: I. Salmonella enterica serovar Typhimurium :  Bactérie gram (-)  responsable des symptômes qui vont de la diarrhée légère à la gastro-entérite aiguë chez l’homme et cause la fièvre typhoïde chez les animaux.  93.8 millions des cas de gastro-entérite dans le monde sont causées par une infection de Salmonella avec 155,000 mort chaque année dont 80.3 millions sont victime d’aliments contaminé par la bactérie en question.
  3. 3. Méthodes classique de détection de contamination :
  4. 4. Méthode basée sur l’utilisation d’un bactériophage rapporteur :  Principe : insertion d’un gène rapporteur dans le génome du bactériophage spécifique à la bactérie qu’on veut détecté.  Avantages : 1. Spécifique à la bactérie cible 2. Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte 3. Production de masse facile 4. Moins couteux 5. Longue durée de vie 6. Détection rapide
  5. 5. Idée générale SPC32H CDABE SPC32H LUX CDABE Bactériophage de Salmonella Typhimurium Opéron bactérien
  6. 6. Enzyme qui ce trouve dans les cellules des organismes bioluminescents et qui catalyse l’oxydation de la luciférine ( FMNH2 + Aldéhyde aliphatique) en oxyluciférine avec émission de photons . Capacité de clonage limitée => on élimine les gènes non essentiels et on les remplaces avec l’opéron bactérien Opéron bactérien de 6 Kb Substrat de luciférase
  7. 7. Les gènes Lux  Gènes responsables des réactions qui entrainent l’émission de lumière  Ils sont utilisé dans la construction de bio rapporteurs  Émettent une lumière bleu-vert a 490 nm  Il existe 5 gènes lux : A, B, C, D et E Les différentes combinaisons entre ces gènes génère différents bio rapporteurs. LuxAB • Luciférase • Addition de substrats exogènes • Erreurs LuxCDE • Complexe d’acide gras réductases. • Substrat de luciférase LuxCDABE • Pas besoin de substrats exogènes • Facile • rapide
  8. 8. Milieux et conditions de cultures :  37 ̊C – Aérobie  Milieu LB ( bouillon – agar 1.5 % )  Ampicilline (Ap) : 50 μg/ml  Kanamycine (Km) : 50 μg/ml  Chloramphénicol (Cm) : 25 μg/ml  L(+)- arabinose 100 Mm  Mitomycine C ( MMC ) : 1.0 μg/ml  Saccharose (20 %)  N-décanal (1 % ) = n- décylaldéhyde (substrat exogène pour LuxAB)
  9. 9. Souche bactérienne, bactériophage et plasmides :  Souche : SR5100 ΔLT2gtrABC1 (32H); SR5003 lysogenized by SPC32H ( LT2 souche sauvage de salmonella hôte pour le phage SPC32H )  E. coli S17-1 λpir  SPC32H : phage qui infecte Salmonella Typhimurium  Plasmides :  Red Helper pKD46  pKD13  pCP20  pCE70  PBBR lux  plasmide suicidaire PDS132
  10. 10. 1 – One-step inactivation method of chromosomal gene  Méthode de Datsenko et wanner.  Principe : Remplacer par recombinaison homologue, une séquence chromosomique par un gène de résistance à l’aide d’amorces portant des extensions homologues au gènes cibles.
  11. 11. 2- Induction :  Pousser la bactérie lysogène à libérer une grande quantité de phages ( + que la quantité qu’elle libère normalement )  La portion de bactéries qui subissent un cycle lytique devient considérable.  Agent inducteur : Mitomycine C.
  12. 12. 3- Luminométrie:  Appareil : Luminomètre  Fonction : Mesurer une intensité lumineuse ( bioluminescence et ATP métrie )  Il comprend : 1. Un Détecteur de lumière qui compte les photons 2. Un Système électronique converti et affiche la mesure de photons en RLU ( relative luminescence units ) 3. Un tube photomultiplicateur 4. Une chambre de mesure 5. Un injecteur de réactifs.
  13. 13. Génome SPC32H Gène Lux CDABE Taille augmente de 15 % Diminution du pouvoir infectieux du phage Capacité de la tête du phage est limitée Solution ??????????
  14. 14. Choix et délétion des gènes non essentiels :  Les gènes impliquées dans la conversion lysogénique : • Antigène-O Acétylase ( oac ) • Glucose translocase ( gtrA)  Le gène (Int) séquence codante pour l’intégrase . ( on a gardé une partie du cote 5’ terminal importante pour l’excision )  Le site situé directement après l’opéron CPS. Conversion lysogénique : le gène du phage s’intègre dans les chromosomes de la bactérie et la mettent en état latent ( lytique  lysogénique ) et la rendant plus virulente ex. : modification de l’antigène O de salmonella qui est reconnu par le Sys. immunitaire Rôle dans l’ intégration du génome du phage dans le chromosomes de l’ hôte et son excision  Elimination par la méthode one-step en utilisant : • le plasmide pKD13 portant le gène de résistance a la kanamycine • le plasmide pCP20 portant le gène de FLP recombinase ( mais pas pour le site situé après l’opéron CPS )
  15. 15. Insertion du gène Lux : I- Choix du site cible : • Directement après le Promoteur de CPS  Pourquoi ? • Région transcrite de manière efficace  Preuve ? • On a inséré dans cette région le gène lacz sans promoteur apporté par le plasmide pCE70 et sous traitement par MMC on a induit un cycle lytique. Après test de la β-Galactosidase on a prouvé que ce promoteur (Pcps) est largement transcrit par suite cette région serait la plus convenable.
  16. 16. Insertion du gène Lux : II- Préparation à l’insertion: a. Le plasmide pBBRlux porte les gènes Lux ( AB ou CDABE) b. Amplification du gène par PCR ( fragment de pBRlux avec le gène dans son centre) c. Clonage du fragment amplifié dans le plasmide suicidaire pDS132 d. Lysogénisation d’ E. coli S17-1 λpir par le phage SPC32 H ( contenant le gène de résistance a la kanamycine au niveau du site cible ( one-step method) ) e. Transformation D’Ecoli par pDS–luxAB ou pDS-LuxCDABE f. Conjugaison entre E. Coli transformée et lysogénisée .
  17. 17. Insertion du gène Lux : III- Intégration au site cible SPC32H KmR pDS-Lux Première recombinaison homologue Par compétition du saccharose (présent à 20%) Deuxième recombinaison homologue SPC32H:Lux Insertion validée par séquençage KmR et CmS KmR et CmR KmS et CmS Gène sacB : Gène de la Bacillus Subtilis confère une sensibilité au saccharose au bac gram(-) C’est le gène suicidaire de pDS132
  18. 18. 1- Contrôle de l’affinité du phage rapporteur  But : Savoir si la modification génétique de SPC32H a altérée son affinité et son habilité de lyser la bactérie Salmonella Typhimurium.  Méthode : Test de concurrence bactériennes mesurée par D.O.  Échantillons testés : - Solution de phages : SPC32H-ABi + culture Salmonella - Solution de phages : SPC32H-AB + culture Salmonella - Solution de phages : SPC32H-CDABE + culture Salmonella - Solution de phages : SPC32H + culture Salmonella - Solution de contrôle négatif : Tampon SM + culture Salmonella Tampon utilisé pour dilution et stockage de bactériophages Souche sauvage du phage non modifié
  19. 19.  Résultats : Cycle Lysogénique présence de (Int ) L’ introduction du gène lux AB n’a pas altérée le pouvoir infectieux de la souche sauvage SPC32H tolère l’insertion de fragment de 2kb Début de la lyse de par SPC32H-AB Début de la lyse par SPC32H-CDABE Cette Intervalle peut être due à : 1- Complication dans l’assemblement du phage due à la surexpression du gène luxCDABE à partir du promoteur CPS. 2- Problèmes d’encapsidation du phage causés par l’augmentation de la taille du génome du phage de 3kb > souche sauvage. Après 3 h d’action le taux de Salmonella inhibée est devenu à peut-près égale pour les deux phages.
  20. 20. 2- Validation de la production de bioluminescence par le phage génétiquement modifié  But : Mettre en évidence la production de bioluminescence par les cellules infectées par le phage modifié contenant les gènes lux .  Méthode : Mesure luminométrique
  21. 21.  Résultats : SPC32H-ABi-2 et SPC32H-ABi-1 procurent le même niveau de bioluminescence l’absence d’ intégrase n’aboutit pas directement une activité lytique Pourquoi SPC32H-ABi-2 n’entre pas en cycle lytique (T=100) comme SPC32H-AB ??
  22. 22. 3- Contrôle de détection spécifique de Salmonella vivante  Test de l’affinité  But : Mesurer la quantité de salmonella d’ après l’ intensité de l’ émission lumineuse  Procédure : - Dilution en série de cultures de salmonella 10X - Infection par SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/mL ) - Mesure de la bioluminescence émise pour 2 h d’infection ( pour capter le maximum de signal lumineux même pour les plus petites concentration de salmonella )  Test de spécificité Dans les aliments et dans l’environnement Salmonella se trouve avec beaucoup d’autre bactéries pour cela la méthode de détection utilisée ne doit pas être influencé par la présence d’autres bactéries  On a mélangé la souche MG1655 d’ E. Coli avec le phage SPC32H-CDABE et on a mesuré la bioluminescence.  On a mélangé la souche MG1655 avec Salmonella et le phage et on a mesuré la bioluminescence
  23. 23.  Résultats : on a put détecter 20 CFU/ml de salmonella Il y a corrélation entre la valeur RLU et le nombre de bactéries énuméré par comptage directe Test de l’affinitéTest de spécificité Aucune émission de bioluminescence Niveau de bioluminescence égal a celui qui est émis en présence de salmonella seul
  24. 24. 3- Contrôle de détection spécifique de Salmonella vivante  Test de l’ habilitée de SPC32H-CDABE de détecter SEULMENT les Salmonella vivante: Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte est une des objectifs de l’utilisation de la Méthode basée sur l’utilisation d’un bactériophage rapporteur.  Procédure: • Culture de Salmonella de 10^5 UFC/ml • La moitié de cette quantité est traitée 30 min avec de l’ éthanol 70% (v/v) • Récupération des bactéries et resuspension dans un bouillon LB • Mélange des cellules morte avec les cellule vivante ensemble dans des ratios différents ( 100 %, 10%, 1%, 0.1% et 0% de cellules vivante ). • Infection de chaque Mélange avec SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/ml) • Mesures luminométrique.
  25. 25.  Résultats : Échantillons contrôles L’ intensité du signal lumineux augmente avec l’augmentation du taux des cellules vivante dans la solution.
  26. 26. 1- Contaminations artificielles des échantillons alimentaires  A- préparation de l’inoculum pour la contamination artificielle i. culture de Salmonella dans 3 ml de bouillon LB à 37 ̊C pour obtenir une valeur de D.O600 = 0.5 ~ 4 x 10^7 CFU/ml ii. Dilutions en séries 10 X ( de 10 a 1 x10 ^6 CFU/ml ) dans bouillon LB iii. Quantification de la concentration par étalement sur gélose LB ou XLD  B- Contamination des échantillons Laitue Iceberg •3 échantillons de 10 g •Quantification sur XLD •1 ml de salmonella dans chaque échantillon •Séchage 2 h à température Ambiante •Homogénéisation dans un Blender dans 90 ml de bouillon LB •Dilutions en séries. •Culture de 0.1 ml des échantillons sur XLD pour mesurer la quantité de Salmonella •5 ml de chaque échantillon dans tube stériles pour mesure luminométrique Tranche de porc •3 échantillons de 10 g •Trempés dans l’inoculum pour 30 min •Homogénéisation •Culture de 0.1 ml sur XLS •5 ml de chacun sont transférés dans tube de test stériles pour mesure luminométrique Lait pasteurisé •3 échantillons de 10 ml •+ 1 ml de culture dans chacun. •Stockage 2 h à 4 ̊C •Homogénéisation •Culture sur XLD •Mesure luminométrique Consommée frais et sans cuisson Un des inconvénients des autres phages portant les gènes lux c’est l’inhibition du signal lumineux dans les échantillons turbide (trouble - laiteux)  on veut tester la capacité de notre Phage rapporteur
  27. 27. L’ intensité du signal est moins important que celui des autres échantillons mais continue a démontré une allure dose- dépendante et linéaire en corrélation avec le nombre de bactérie Résultats

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