APPLICATION DE LA TECHNOLOGIE NUCLEOFECTIONTM POUR L’IDENTIFICATION DES PROTEINES SALIVAIRES DE PHLEBOTOMUS PAPATASI, CANDIDATS VACCINS CONTRE LA LEISHMANIOSE CUTANEE CHEZ L’HOMME
Introduction & objectif : Plusieurs données expérimentales démontrent que l’exposition préalable
des souris à la salive des phlébotomes est capable de conférer une immunité contre la leishmaniose
transmise par une piqûre infectante ultérieure. Nos travaux réalisés chez l’Homme montrent que les
protéines salivaires de Phlebotomus papatasi, vecteur de leishmania major, activent principalement des
lymphocytes T CD8 producteurs d’IL-10 et à un moindre degré des lymphocytes T CD4+ producteurs
d’IFN-γ. La caractérisation des antigènes salivaires cibles de la réponse immune de type Th1 est d’un grand
intérêt puisqu’elle pourrait définir des candidats vaccins potentiels contre la leishmaniose humaine. Vue
la difficulté d’obtenir les formes recombinantes des protéines salivaires de P. papatasi et afin d’identifier
les protéines d’intérêt activant une réponse cellulaire de type Th1 chez l’Homme, nous nous sommes
proposés de tester une nouvelle approche mettant en jeu la transfection des cellules mononucléées
humaines par des plasmides recombinants comportant les séquences des protéines ciblées.
Matériel & Méthodes : Les cellules mononucléées du sang périphériques (PBMC) ont été isolées à partir
du sang de 10 donneurs volontaires naturellement exposés aux piqures de P. papatasi. Les PBMC ont été
transfectées par les six plasmides d’intérêt (SP15, SP28, SP34, SP36, SP42 et SP44) ainsi que le plasmide
contenant la GFP pour évaluer le taux de transfection à 24 h. L’activation ou non d’une réponse immune
cellulaire de type Th1 a été évaluée en recherchant l’IFN-ɤ dans les surnageants de culture de 72 h par
ELISA sandwich et en évaluant la prolifération cellulaire par incorporation de la thymidine tritiée après 5
jours de culture.
Résultats : L’ensemble des données obtenus chez les donneurs immuns montrent que seules les « yellow
protéines » PpSP42 et PpSP44 et l’apyrase PpSP36 activent une réponse immune cellulaire de type Th1 et
constituent ainsi des candidats vaccins potentiels. Parmi ces trois protéines, la PpSP44 semble donner les
taux les plus élevés d’IFN-γ et ce, chez le plus grand nombre de donneurs.
Conclusion : Notre approche, basée sur l’utilisation d’une technologie innovante, NucleofectionTM, a
permis d’identifier trois protéines salivaires de P. papatasi candidats vaccins contre la leishmaniose cutanée.
Le but ultime est le développement d’un vaccin utilisable chez l’homme contre les différentes formes de
leishmanioses et comportant des antigènes parasitaires (au nombre de 3-4) et un à deux composants de
la salive du vecteur.
Similaire à APPLICATION DE LA TECHNOLOGIE NUCLEOFECTIONTM POUR L’IDENTIFICATION DES PROTEINES SALIVAIRES DE PHLEBOTOMUS PAPATASI, CANDIDATS VACCINS CONTRE LA LEISHMANIOSE CUTANEE CHEZ L’HOMME
Similaire à APPLICATION DE LA TECHNOLOGIE NUCLEOFECTIONTM POUR L’IDENTIFICATION DES PROTEINES SALIVAIRES DE PHLEBOTOMUS PAPATASI, CANDIDATS VACCINS CONTRE LA LEISHMANIOSE CUTANEE CHEZ L’HOMME (20)
Histologie de la Cavité Buccale (Chapitre 1/3 de l'Histologie du l'appareil d...
APPLICATION DE LA TECHNOLOGIE NUCLEOFECTIONTM POUR L’IDENTIFICATION DES PROTEINES SALIVAIRES DE PHLEBOTOMUS PAPATASI, CANDIDATS VACCINS CONTRE LA LEISHMANIOSE CUTANEE CHEZ L’HOMME
1. Application de la Technologie NucleofectionTM pour
l’identification des protéines salivaires de
phlebotomus papatasi, candidats vaccins contre la
leishmaniose cutanée chez l’Homme
Tlili Aymen 1, Soumaya Marzouki 1, Emna Chabaane1
Maha Abdeladhim2, Wafa Kammoun-Rebai 3,
Nabil Belhadj-Hmida1, Shaden Kamhawi 2, Hechmi Louzir1-4 ,
Jesus G Valenzuela2, Melika Ben Ahmed1-4
1 Laboratoire de Transmission, Contrôle et Immunobiologie des Infections
2 Vector Molecular Biology Section, Laboratory of Malaria and Vector
Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH
3 Laboratoire de Parasitologie Médicale, Biotechnologies et Biomolécules
4 Faculté de Médecine de Tunis, Université Tunis El Manar
2. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Maladie chronique généralisée
Contamination par des parasites protozoaires
flagellés: Leishmania
Mammifères
3. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
•Le centre et le sud (Kairouan, Sidi Bouzid ,
Gafsa )
Localisation
•Lésions ulcéreuses crouteuses multiples
•Taille variable
•Les régions découvertes du corps
Clinique
•L. majorAgent pathogène
•Phlebotomus papatasiVecteur
LCS
LCZ
LCA
LCZ
4. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Problème sanitaire d’urgence
Un taux de létalité
Moyens diagnostiques
et de médicaments
Prévention par une vaccination
5. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
vaccin
agent pathogène
Elaboration du
vaccin anti-parasite
complexe
La biologie
complexe du
parasite
La variabilité
antigénique
La faible
immunogénicité
des antigènes
6. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Efficacité de l’immunisation contre la salive du
vecteur
BALB/c
Souris Naïve
Souris pré-
exposée
Résistance à
l’infection
7. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Chez la souris
Extrait salivaire
total
type T CD4+
IFN-ɤ et IL12
Th1
Réponse immune protectrice
8. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Tc2 cells
SGE
IL-10+++
CD8
Absence de protection ?
Th1 cells
SGE
IFN-
CD4
PROTECTION
Candidat vaccin?
Chez l’Homme
10. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Identifier les protéines salivaires de Phlebotomus papatasi cibles
de la réponse immune cellulaire spécifique chez des patients
vivants en zone d’endémie de LCZ en Tunisie, et plus
particulièrement d’identifier celle(s) qui activent la réponse
immune de type Th1 représentant des candidats vaccins
potentiels contre l’infection leishmanienne.
11. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Choix des protéines salivaires
FAMILLES DE
PROTEINES
SALIVAIRES
P. argentipes,
P. ariasi,
P. perniciosus,
L. Longipalpis
P. papatasi
Immunodominante
induit Th2
Biomarqueur
12. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Impulsions électriques
NUCLEOFECTION
Plasmide
recombinant
Séquence
de protéine
salivaire
13. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Prélever du sang total
d’individus atteint de
la leishmaniose
Séparation des PBMC
avec le Ficoll -
Hypaque
Transfecter les PBMC
avec des plasmides
recombinants par
Nucleofection
Production des
protéines dans les
PBMC humaines
Etude de la réponse
cellulaire
14. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
PBMC de 10 donneurs immunisés
contre la salive de P. papatasi et
transfectés par les plasmides
recombinants
Elisa
sandwich
anti IFN-
Incorporation de
thymidine tritiée
Cytokines
secrété
Index de
prolifération
cellulaire
Activation ou
non d’une
réponse
immune
cellulaire Th1
Cytokines
Multiplex
TH1/TH2/TH17
15. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Étude de la prolifération cellulaire des PBMC
transfectées
Unstimulated SP15 SP28 SP34 SP36 SP42 SP44
1
2
3
4
indexofproliferation
PpSP36 , PpSP42 et PpSP44 : Résultats significatifs
16. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Dosage de l’IFN- dans les surnageants de
PBMC transfectées
Unstimulated SP15 SP28 SP34 SP36 SP42 SP44
0
50
100
150
200
250
300
350
400
IFN-concentration(pg/ml)
PpSP36, PpSP42 et PpSP44 : induction significative d’IFN- Chez 7 donneurs
17. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Monitoring de cytokines Th1/Th2/Th17
IFN-
IL-10
18. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
L’ensemble des données obtenus chez les donneurs
immuns
Yellow related proteins
PpSP42 et PpSP44 Apyrase ou PpSP36
Réponse immune cellulaire de type Th1
Candidats vaccins potentiels
19. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
PpSP44
PpSP42
PpSP36
Production de la forme recombinante
Stimulant directe des PBMC fraiches de 10 donneurs immunisés contre la salive
sans transfection
Taux d’IFN-ɤ
secrété
Prolifération
cellulaire
Etude de
la réponse
immune
20. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Étude de la prolifération cellulaire des PBMC
stimulées par la rPpSP44
1
2
3
4
***
0.0002p
Controls Immune donors
indexofproliferation
21. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Dosage de l’IFN- sur les PBMC stimulées
par la rPpSP44
0
100
200
300
400
***
< 0.0001p
Controls Immune donors
IFN-concentration(pg/ml)
22. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
PpSP36
PpSP42
PpSP44
La PpSP15 n’est pas un candidat vaccin ≠ souris
LJM11
LJM17
Protection
P. papatasi L. longipaplpis
Modèles
murins
23. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Conclusion
La transfection cellulaire par Nucleofection semble une technique
prometteuse permettant l’étude de la réponse immune dirigée contre
les protéines salivaires des vecteurs de la leishmaniose.
Son utilisation a permis de mettre en évidence la capacité de trois
protéines salivaires PpSP44, PpSP42 et PpSP36 à induire une réponse
cellulaire potentiellement protectrice.
La protéine PpSP44 a montré les meilleures résultats de prolifération
cellulaire et de sécrétion d’IFN- constituant ainsi le meilleur candidat
vaccin contre la LCZ.
Les leishmanioses sont des maladies chroniques généralisées dues à la contamination par des protozoaires flagellés du genre Leishmania - transmises par la piqure infectante d’un insecte diptère hématophage - le phlébotome
En Tunisie leishmania major est l’agent responsable des leishmanioses cutanées dans des foyer de phlebotmus papatasi au centre du pays
Il s’agit d’un réel problème de santé publique avec un taux de létalité élevé peu de moyens diagnostiques et thérapeutiques. La thérapeutique reste basée sur des drogues anciennes et toxiques d’où la nécessité d’une prévention par vaccination
Cependant le problème majeur des vaccins qui ciblent l’agent pathogène reste la biologie complexe du parasite, la variabilité antigénique et la faible immunogénicité des antigènes.
Une autre alternative est l’immunisation contre la salive du vecteur. En effet, il a été démontré que la pré-exposition de souris à la salive du phlébotome confère une résistance à l’infection ultérieure par le parasite leishmania
Chez la souris l’extrait total de glande salivaire active une population T CD4+ protectrice de phénotype Th1 sécrétrice d’IFN-g et d’IL12.
Les études réalisées dans notre laboratoire ont montré que l’extrait de glande salivaire de phlebotomus papatasi active chez l’Homme une population T CD8 de phénotype Tc2 sécrétrice d’Il10 et responsable de l’exacerbation de la maladie. De façon intéressante, lorsqu’on bloque l’Il-10 l’extrait de glande salivaire active une population CD4 de phénotype Th1 productrice d’IFN-g et associée à la protection et c’est la caractérisation des protéines salivaires responsables de l’activation de cette population qui semble intéressante pour l’identification des candidats vaccins potentiels.
Pour cela nous nous sommes proposés de fractionner les glandes salivaires selon leur poids moléculaires et d’étudier leur effet sur la prolifération et la production d’IFN-g par les lymphocytes T CD4 et CD8 séparés à partir du sang de donneurs immunisés contre la salive de phlebotomus papatasi. Nous avons montré que les protéines appartenant à la fraction salivaire de + que 30 KDa induisent la prolifération des L ymphocytes T CD4 avec forte production d’IFN-g
Nous nous sommes fixés comme objectif d’identifier les protéines salivaires de phlebotomus papatasi qui activent une réponse immune de type Th1 et représentant ainsi des candidats vaccins potentiels contre la leishmaniose cutanée chez l’Homme.
Nous avons ciblé les protéines salivaires de + que 30KDa à savoir la SP28 qui appartient à la famille des D7 protéines, 2 yellow protéines SP42 et SP44 et une apyrase Sp36. Nous avons inclus la protéine Sp15 associée à la protection dans les modèle murins. Par contre nous avons exclu de notre étude la SP32 qui est la protéine immunodominante induisant une réponse Th2 et nous avons inclus la protéine non immunogène SP34 comme contrôle négatif.
Vu la disponibilité des plasmides recombinants pour les différentes protéines salivaires de papatasi, nous avons opté pour la technique Nucleofection qui repose sur l’application d’impulsions électriques qui provoquent l’ouverture transitoire des pores membranaires permettant le passage des plasmides vers les noyaux des cellules et l’expression des protéines d’intérêt.
Notre stratégie consiste ainsi à prélever du sang total d’individus exposés à la salive des phlébotomes, de séparer les PBMC sur gradient de densité et les transfecter par des plasmides recombinants contenant les séquences codant pour les protéines salivaires d’intérêt qui vont être produites dans les PBMC humaines. Puis nous étudions la réponse immune activée en vérifiant la prolifération cellulaire et l’induction d’IFN-g.
Dans le présent travail, les PBMC de 10 vivant dans la région d’endémie de sidi bouzid et immunisés contre la salive de phlebotomus papatasi ont été transfectés par des plasmides. La réponse immune activée des PBMC transfectés a été évalué en étudiant la prolifération cellulaire par l’incorporation de la thymidine tritiée et les cytokines sécrétées dans les surnageants de culture cellulaire par Elisa sandwich anti-IFN-g et cytokine multiplex th1 th2 et th17 . Le taux de transfection évalué par la transfection de plasmides contenant la GFP était autour de 20%.
L’étude de la réponse proliférative des PBMC transfectés a montré des résultatas significatifs avec les protéines PpSP36 PpSP42 et surtout PpSP44
Ceci est en corrélation avec les résultats de l’ELISA qui a montré une induction significative de l’IFN-g par les protéines PpSP36 PpSP42 et PpSP44 chez 7 donneurs. Les taux d’IFN-g les plus élevés ont été obtenus avec la yellow protéine PpSP44 avec une mediane de 320 pg/ml
L’étude des cytokines par une technique multiplex a confirmé la production l’IFN-g avec ces 3 protéines surtout la PpSP44 et a aussi confirmé le phénotype Th1 de la réponse vu l’absence de production de cytokines Th2. de façon surprenante nous avons démontré que la PPSP15 induit des cytokines Th2 comme l’IL4 et l’IL6 et surtout l’IL10 sur les PBMC
L’ensemble des données obtenus suggèrent que les 2 yellow protein PpSP42 et PpSP44 ainsi que l’apyrase PpSP36 induisent une réponse immune cellulaire de type Th1 et semblent constituer des candidats vaccins potentiels contre la leishmaniose cutanée chez l’Homme.
Parmi ces protéine, la PpSP44 a montré les meilleurs niveaux de prolifération cellulaire et d’induction d’IFN-g. pour cela nous nous sommes proposés de produire la forme recombinante de cette protéine pour l’utiliser comme stimulant directe des PBMC de donneurs immunisés afin de tester son effet sur la réponse immune activée.
Nos résultats montrent que la PpSP44 recombinante induit une prolifération significative des PBMC de tous les donneurs immuns.
Et que ces résultats corrèlent avec celles de l’ELISA qui montre une forte induction de l’IFN-g chez tous les donneurs confirmant ainsi la possibilité d’utiliser cette protéine comme candidat vaccin
Nos résultats sont en accord avec les données de littérature qui montrent que les yellow protein LJM11 et LJM17 présentes dans la salive de Lutzomya longipalpis et qui sont homologues aux yellow protein de phlebotomus papatasi, induisent la protection contre la leishmaniose cutanée dans les modèles murins. Cependant, ils ne confirment pas le statut de la PpSP15 comme candidat vaccin comme cela a été démontré chez la souris
En conclusion la transfection……………… cette technique nous a permis de mettre en évidence ………………… de façon très intéressante la PpSP44………………