1. PATHOGEN È SE DES L É SIONS H É PATIQUES DU VHC : MOD É LISATION ANIMALE Hervé LERAT INSERM U955 Département de Virologie Moléculaire et Immunologie Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky) Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.

5. Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007 Modèles d’infection (rongeurs)

6. Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007 Modèles d’infection (rongeurs)

7. Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007 Modèles d’infection (rongeurs)

10. Modèles transgéniques pour le VHC Lésions hépatiques induites par VHC spécifiques CTL Inhibition voie FAS Wakita, 1998 Core-E1-E2-p7-NS2 Production ROS augmentée Korenaga, 2002 Core-E1-E2-p7 Dysplasie pour le mutant S99Q Wang, 2004 Core (mutants) Modulation de l’apoptose induite par la voie FAS Honda, 1999 Core-E1-E2 Modulation de l’apoptose induite par la voie FAS, IR (IRS-1) Honda, 2000 Core Stéatose , Inhibition de MTTP et VLDL sécrétion, IR CHC , stress oxydatif, stress RE Modulation de la voie de l’IFN, Moriya 1997 Core Core-E1-E2-p7 Core-E1-E2 Core-E1-E2 Core Core Core Protéine(s) virale(s) Stéatose , CHC, sensibilité au stress oxydatif Lerat, 2002 Steatose , CHC Naas, 2005 Co-carcinogène (+DEN) Inhibition of Fas-mediated apoptosis Kamegaya, 2005 Co-carcinogène (+DEN) Kamegaya, 2005 Co-carcinogène (+CCl4) Kato, 2003 Lymphome et adénomes hépatocellulaires Ishikawa, 2003 Principales pathologies Article princeps

11. Modèles transgéniques pour le VHC (suite) Augmentation de l’incidence des CHC et de la Stéatose Keasler, Lerat et al. 2006 Polyprotéine entière + HbX Modulation de la voie TNFα Frelin, 2006 NS3-4A Exocrinopathie: Sialadenitis (glandes salivaires) Koike, 1997 E1-E2 Polyprotéine entière Polyprotéine entière NS5A Protéine(s) virale(s) Stéatose , nécrose Inhibition de la voie IFN (STAT) Blindenbacher, 2003 Stéatose , CHC , sensibilité au stress oxydatif inhibition voie FAS et réponse immune intra-hépatique Inhibition des protéines pro-apoptotiques CIDE-B et Bid CHC par surcharge en fer, inhibition de l’hepcidine Lerat, 2002 Modulation de la voie TNFα Majumder, 2003 Principales pathologies Article princeps

12. Les modèles transgéniques FL-N/35 et S-N/863 (Lerat et al., Gastroenterology, 2002) micro-injections C57BL6J x C3H/HeJ X C57BL6J souris F0, ADN VHC + souris F1, ARN VHC + X C57BL6J jusqu’à F8 Foie S-N/863 SL-139 FL-N/35 S-N SV40 PolyA FL-N E1 E2 core NS4a NS3 NS4b NS5a NS5b NS2 p7 Promoteur albumine Promoteur albumine E1 E2 p7 SV40 PolyA core

13. Carcinomes hépatocellulaires 1 cm 1 cm FL-N/35-170 FL-N/35-171 A Lerat et al., Gastroenterology 2002.

14. CHC viro-induits: mécanismes moléculaires?

15. CHC viro-induits: mécanismes moléculaires? Modulation du cycle cellulaire Incorporation de BrdU HCV TG Non TG ARNm Cyclin B1 MYC 1 3 5 7 9 mRNA (Fold increase) HCV TG Non TG HCV TG Non TG Détection PCNA HCV TG Non TG

16. Down-regulation of apoptosis in HCV-transgenic mice % apoptotic hepatocytes 0 10 20 30 40 50 non TG HCV TG P<0. 05 in vivo P<0.01 ex vivo HCV TG Non TG Hoechst + - Fluorescence intensity 0 1 6 15 Non TG HCV TG activated Casp 3 (17kDa) Hours post FasL injection

17. Down-regulation of pro-apoptotic proteins in HCV-transgenic mice (Disson et al., Gastroenterology, 2004) Bid GAPDH LIVER KIDNEY HCV tg - + - + Bid 24 kD Activated caspase 8 Bid-N 10 kD Bid-t 14 kD Cytochrome C + Apoptosis WT HCV tg 0 0.4 0.2 0.6 0.8 1 1.2 Bid protein level (AU) Bid N=13 N=10 p<0.01

18. Towards a mechanism for HCV-induced carcinogenesis? Apoptotic signaling alteration in HCV mice HCV APOPTOSIS caspase 3 caspase 9 cytochrome C caspase 8 Fas FasL Bid Cell membrane mitochondria HCV CIDE-B DNA fragmentation A step toward cancer CIDE-B Annexin V HCV TG + - Erdtmann et al., J Biol Chem 2003.

19. Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes (Disson et al., Gastroenterology, 2004) Day 3 Day 21 non TG HCV TG Ad  Gal 10 8 pfu/g D +3 Liver biopsy D +21 (sacrifice) Liver and spleen removal  -gal histology + enzymatic assay

20. Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes (Disson et al., Gastroenterology, 2004) 10 + 4 10 + 5 10 + 6 10 + 7 +3 +21 +3 +21 10 + 3 10 + 4 10 + 5 10 + 6 ßGAL activity in the liver (RLU) ßGAL activity in the spleen (RLU) LIVER SPLEEN p<0.05 N.S. Ad  Gal 10 8 pfu/g D +3 Liver biopsy D +21 (sacrifice) Liver and spleen removal  -gal histology + enzymatic assay

21. CHC viro-induits: mécanismes moléculaires? Lésions mitochondriales Surcharge en FER CHC inflammation fibrose Lésions ADN Coloration Perls (Fer) Nishina, Gastroenterology 2008 Chaîne de transport électrons (1) VHC (capside) ROS Glutathion Ca2+ Coloration au dihydroethidium (ROS)

22. Towards mechanisms for HCV-induced carcinogenesis? Chronicity of infection LIVER CARCINOMA HCV expression Immune response Inhibition Increased cell division Up-regulation of cyclins and oncogenes DNA Damage ROS production Apoptosis evasion Down-regulation of pro-apoptotic protein

23. Stéatose micro-vésiculaire Lerat et al., Gastroenterology 2002. Non TG VHC TG VHC TG VHC TG

24. Stéatose micro-vésiculaire coloration Oil Red O analyse in silico HCV TG NON TGM F M 0 5 10 15 20 25 12.5 ± 0.4 13 ± 0.8 14.4 ± 0.8 14.1 ± 0.3 n=12 n=12 n=10 n=7 p<0.001 % de l’aire total

25. HEPATOCELLULAR STEATOSIS Stéatose viro-induite: mécanismes moléculaires? de novo TG synthesis TG secretion default Increased TG serum uptake TG degradation default (oxydation) ER Stress ? VIRAL PROTEINS ? ? ? ?

26. Défaut d’exportation des triglycérides. La sécrétion des VLDL hépatiques chez la souris à jeun a été mesurée par l’augmentation des triglycérides plasmatiques (A et B) et de l’apolipoprotéine B (C) après inhibition de la lipoprotéine lipase par le triton WR1339 (B et C). Plasmatic TG (g/L) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 A WT HCV-tg 14 14 n 4 6 8 10 12 14 Plasmatic TG (g/L) B WT HCV-tg 13 13 n 1 2 3 4 5 6 Plasmatic ApoB (g/L) C WT HCV-tg 13 13 n

27. Inhibition de la « Microsomal Transfer Protein » WT HCV-tg 150 200 250 300 350 400 450 500 pmoles/100µg/4h Activité MTP

28. Stimulation de la lipogenèse Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1 * p=0.01 ** p=0.02 WT HCV-tg ARNm (augmentation relative) n 11 FAS SCD1 0 2 4 9 EM ACC ACL 11 14 11 11 8 8 16 8 8 * ** ** ** p=0.02 RT-qPCR

29. Stimulation de la lipogenèse * p=0.01 FAS/GAPDH WT HCV-tg 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 * 4 9 n Western Blot Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1

30. Régulation de la lipogenèse SREBP1c Domaine de transactivation (Noyau) SREBP1c Précurseur (RE puis Golgi) Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1

31. SREBP1c Domaine de transactivation (Noyau) SREBP1c Précurseur (RE puis Golgi) Régulation de la lipogenèse Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1 SREBP1c (clivé) SREBP1c (précurseur) Lamine A/C Actine noyau microsomes WT HCV-tg Western Blot

32. SREBP1c Domaine de transactivation (Noyau) SREBP1c Précurseur (RE puis Golgi) Régulation de la lipogenèse ARNm (augmentation relative) n 14 16 0 1 2 3 4 WT HCV-tg RT-qPCR Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1

33. Lipogenèse induite par le stress du RE? SREBP1c Domaine de transactivation (Noyau) SREBP1c Précurseur (RE puis Golgi) PERK ATF6 IRE-1 Stress RE RE Epissage ARNm XBP1 P-eiF2 α Arrêt traduction Dégradation protéique Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1

34. Lipogenèse induite par le stress du RE? SREBP1c Domaine de transactivation (Noyau) SREBP1c Précurseur (RE puis Golgi) PERK ATF6 IRE-1 Stress RE RE Epissage ARNm XBP1 P-eiF2 α Arrêt traduction Dégradation protéique Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1 eIF2-P/eIF2 0 1 2 3 4 WT HCV-tg Western blot Non-épissé Epissé Non-Tg HCV Tg + ARNm XBP1 RT-PCR

35. Lipogenèse induite par le stress du RE? EDEM 7 4 PDI 11 8 WT HCV-tg CHOP TRB3 15 18 7 4 n GRP78 16 15 ARNm (augmenation relative) 0 2 4 6 12 RT-QPCR 1 2 3 0 4 9 Phospho-Perk Phospho-Perk / PERK Western Blot

36. Résumé PERK ATF6 IRE-1 Stress RE RE Epissage ARNm XBP1 P-eiF2 α Arrêt traduction Dégradation protéique SREBP1c Domaine de transactivation (Noyau) SREBP1c Précurseur (RE puis Golgi) Citrate Acetyl-CoA ATP-CL Malonyl-CoA Acyl-CoAs TG Lipogenèse ACC FAS SCD1 VLDL MTP Exportation TG ApoB Accumulation TG intracellulaires STEATOSE HEPATIQUE = =

37. NO YES YES de novo TG synthesis TG secretion default Increased TG serum uptake HEPATOCELLULAR STEATOSIS TG degradation default (oxydation) ER Stress VIRAL PROTEINS ? ? Towards mechanisms for HCV-induced steatosis?