Mieux connaître les pratiques et les connaissances sur lesquelles repose la gestion des levains naturels complexes chez les producteurs de rigotte de Condrieu et le rôle qu'elles jouent dans la caractérisation de sa spécificité.

1. Le projet LNC (Levains Naturels
Complexes)
Yann Demarigny, Arnaud Hallier, Jean-Christophe Perrin, Didier
Hennequin, Martine Mérenvielle, Annick Lebecque, Françoise
Leriche, Karine Fayolle, Cécile Bord, Laurence Bérard, Nadia
Oulahal, Pascal Degraeve
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
1

2. Le contexte
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
2

3. Un levain…
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
3
Un levain…
…peut être obtenu différemment…
…suivant les technologies.
Grand nombre
Diversité de souches, d’activités
Acidification spontanée
Ajout de starters
Backslopping

4. Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
402/10/2017 Projet LNC 4
LNC
Résistance aux phages
Accidents
d’acidification
Manque de données
publiées
Grand nombre de microorganismes
Profil aromatique
Inscrit au cahier des charges de
nombreuses technologies
Qu’est-ce qu’un LNC ?
06 octobre 2017

5. Présentation du projet
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
5

6. Les objectifs du projet LNC
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
6
WP1 (anthropologie)
Quelles sont les pratiques associées au repiquage ? Sur quels savoirs mais aussi sur
quelles représentations reposent-ils et quelle place leur fait-on dans le métier ? Quelles
sont leurs incidences sur la biodiversité microbienne, et plus largement sur la qualité des
produits ?
WP2 (« typicité »)
Existe-t-il des différences sensorielles perceptibles par un jury entraîné ?
Ces différences sont-elles perceptibles par des consommateurs et se traduisent-elles par
une préférence pour ces produits traditionnels ?
WP3 (bioprotection)
L’utilisation des levains naturels conduit-elle à un contrôle sinon une réduction des flores
d’altération et pathogènes

7. Organisation
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
7
WP3 (bioprotection)WP3 (bioprotection)
Listeria
Pseudomonas
Moisissures
Moisissures
Pain fabriqué avec
du levain
Rigotte de Condrieu
WP1 (anthropologie)
WP2 (« typicité »)
L. Bérard
M. Mérenvielle, A. Vera, A
Lebecque
F. Leriche, N. Oulahal
Poster M. Busch et al.

8. 8
BioDyMIA
Cluster ALLIRARégion Rhône-Alpes
Levains de panification
(Philibert Savours)
Fromagerie (Guilloteau)
Projet LNC
VetAgroSup Actalia
FDR
Partenaires scientifiques
Partenaires financiers
Partenaires techniques
CNRS
ABTE
Partenaires
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"

9. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Une approche anthropologique
de la gestion des levains:
l'exemple du pain et de la Rigotte de
Condrieu.
Laurence Bérard
Mathilde lagrola
Elora Paris
9

10. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
PROBLÉMATIQUE
Mieux connaître les pratiques et les connaissances sur lesquelles
repose la gestion des levains naturels complexes chez les producteurs
de rigotte de Condrieu le rôle qu’elles jouent dans la caractérisation de
sa spécificité.
10

11. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
LE REPIQUAGE DU PETIT-LAIT DANS LES
EXPLOITATIONS FERMIÈRES DE RIGOTTE
DE CONDRIEU
11

12. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Légende
Producteur de rigotte de Condrieu AOP
Producteur fermier hors AOP
Fromagerie du Pilat
Commune
LYON
Vienne
Echalas
Ville de plus de 100 000 habitants
Ville moyenne de plus de 30 000 habitants
Ville ou village
Périmètre du PNR du Pilat
Périmètre de la zone AOP
10
3
6
5
7
Répartition des
informateurs
Exploitations
Rigotte de
Condrieu
Exploitations
hors AOP
Producteurs
retraités
10 km
La situation des producteurs rencontrés
12

13. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Ajout de petit-lait
Traite soir
Emprésurage
Traite
matin
Moulage
Louche ou
bloc-moule
1er salage
Retournement et
2ème salage
Maturation
2 à 12h
Caillage
24 h
Egouttage
24 h
J2J0 J1 J3
Démoulage
J3 J4 J6
LAIT CAILLE FROMAGE BLANC
FROMAGE FRAIS FROMAGE AFFINE
DIAGRAMME DE FABRICATION
Ressuyage
12 à 24 h
Séchage
24 à 48 h
Affinage
6 jours minimum
13

14. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
• Repiquage commun chez tous les producteurs rencontrés
• Du « bon caillé » au « bon petit-lait »
• Une pratique sans mémoire: recommandée par le technicien
dans les années 1970
 une hypothèse : l’appauvrissement du lait
LE REPIQUAGE DU PETIT LAIT
14

15. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
• Le petit-lait de la fabrication précédente
• Levain fermier
• Congélation
• Ferments du commerce: peu courants
• L’échange de petit-lait
EN CAS DE PROBLÈME : ROMPRE LE CYCLE DE REPIQUAGE
15

16. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
16

17. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
17

18. 06 octobre 2017 18
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Contribution des levains naturels complexes à la
typicité organoleptique du fromage
Annick LEBECQUE, Cécile BORD (VetAgroSup), Martine MERENVIELLE (Fromagerie
Guilloteau)

19. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
19
Mode opératoire
Protocole des repiquages

20. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
20
Mélange microbien complexe
Log(UFC)/ml LNC 1b
Coliformes 4,48
Staph. Aureus <1,7
E. Coli <1,7
Pseudomonas 4,48
Entérocoques 2,65
Hétérofermentaires
facultatifs
5,11
Levures 1,7
Moisissures 1,7
Flore lactique
aromatique
7,76
Bactéries lactiques 9,75
… composé essentiellement de bactéries
lactiques
… appartenant à l’espèce Lactococcus
lactis
inconnue
Lactococcus ssp
Lactococcus lactis
Lactococcus lactis subsp.
lactis
Lactococcus lactis subsp.
lactis biovar. diacetylactis
Enterococcus ssp
Enterococcus faecalis… présentant une diversité variable
d’activités
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Souches très acidifiantes
Souches acidifiantes
Souches peu acidifiantes
Les caractéristiques des LNC ?

21. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
21
Log(UFC)/ml LNC 12 LNC 30
Coliformes >4,48 5,62
Staph. aureus <1,70 <1,70
Pseudomonas IND 5,57
Entérocoques >5,48 7,69
Hétérofermentaires
facultatifs
7,62 7,11
Levures 7,23 6
Moisissures 7,93 7,95
Flore lactique aromatique 7,02 6
Bactéries lactiques 9,06 7,7
La flore lactique domine à 12 jours
mais se réduit avec l’affinage
Le LNC agit-il sur le fromage ?

22. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
22
Racl F1b30j
Racl F4b30j
Racl F3b30j
Racl LNC5b
Racl LNC4b
Racl LNC6b
Racl LNC3b
Racl LNC2b
Racl F6b12j
Racl LNC0b
Racl LNC1b
Racl F130j
Racl F5b30j
Racl F6b30j
Racl F2b30j
10090807060504030
100.00
200.00
300.00
400.00
500.00
600.00
700.00
800.00
1000
1500
2000
LNC
F 12jours
Le profil des flores lactiques des fromages à 12 jours est proche de celui des LNC
Les profils à 30 jours changent suivant les fromages
Des fromages « distants » présentent
les mêmes profils à 30 jours
Le LNC exerce-t-il un rôle sur le fromage ?

23. 06 octobre 2017 23
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
7,000
F1bis
30j
F2bis
30j
F3bis
30j
F4bis
30j
F5bis
30j
F6bis
30j
2-methyl-pentane
3-methyl-pentane
3-methyl-1-butanol
heptanal
unknown
acide hexanoique
2-phenylethanal
unknown
2-nonanone
2-phenylethanol
Fromages à 12 jours
Fromages à 30 jours0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
7,000
F1bis
12j
F2bis
12j
F3bis
12j
F4bis
12j
F5bis
12j
F6bis
12j
2-methyl-pentane
3-methyl-pentane
3-methyl-1-butanol
heptanal
benzaldehyde
acide hexanoique
unknown
2-nonanone
acide octanoique
acide decanoique
Chaque fromage possède sa
propre signature aromatique
Cela se traduit-il par un effet sur la biochimie
des fromages ?
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"

24. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
24
Les LNC ont-ils un effet sensoriel ?

25. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
25
 Le LNC est un mélange microbien complexe avec une flore dominante d’intérêt technologique.
Ses flores lactiques varient selon le repiquage qualitativement et quantitativement.
 Chaque fromage possède sa propre signature aromatique et semble évoluer au cours des
repiquages.
 Les fromages sont reconnus différents d’un point de vue sensoriel par un jury consommateur
et par un jury expert. Cela pourrait s’expliquer par des profils aromatiques différents et des
écarts de texture.
Synthèse du fromage

26. 06 octobre 2017
26Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Nadia Oulahal1, Karine Fayolle2, Chiraz Ben Sassi1, Sandie Gervason2,
Ghania Ben Alaya1, Yann Demarigny3, Françoise Leriche2.
1Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Laboratoire BioDyMIA, Equipe
Mixte d'Accueil n°3733, IUT Lyon 1, Technopole Alimentec, Rue Henri de
Boissieu, F-01000, Bourg en Bresse
2Clermont Université, VetAgro Sup, Unité CALITYSS, BP 10448, F-63000,
Clermont-Ferrand, France.
3Univ Lyon, ISARA Lyon , Laboratoire BioDyMIA, Equipe Mixte d'Accueil
n°3733, ISARA, Département Innovation Production Agro-Alimentaire et
Qualité, 23 rue Jean Baldassini F-69364 Lyon
Intérêt de l’utilisation des LNC pour la
maîtrise des flores indésirables
(Pseudomonas sp et Listeria sp)
en technologie fromagère

27. 06 octobre 2017
27Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Nadia Oulahal
Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Laboratoire BioDyMIA,
Equipe Mixte d'Accueil n°3733, IUT Lyon 1, Technopole Alimentec,
Rue Henri de Boissieu, F-01000, Bourg en Bresse
Intérêt de l’utilisation des LNC pour
la maîtrise des flores indésirables
en technologie fromagère
Effet sur Listeria sp

28. 06 octobre 2017 28
Etude des mécanismes de
bioprotection d’aliments
traditionnels
Bases scientifiques pour
l’encadrement des
pratiques de fabrication
Levains naturels complexes
Produits laitiers traditionnels
Fabrication N
Fabrication N+1
Lactosérum NFromage
La pratique du repiquage
Fromage Lactosérum N+1
…
Lactosérum N-1
Biodiversité microbienne et contrôle des
micro-organismes altérants, pathogènes
et des phages
genre Listeria
et
genre Pseudomonas
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"

29. 06 octobre
2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
29
souche microbienne bioprotectrice
microorganisme altérant
ou pathogène
métabolites
antimicrobiens

30. LNC: Biodiversité microbienne et contrôle
des microorganismes indésirables
Principaux genres
de LAB :
Lactobacillus
Streptococcus
Lactococcus
Leuconostoc
Pediococcus
Carnobacterium
Bifidobacterium
Acides organiques
(dont l’acide lactique)
Biomasse
Enzymes
Exopolysaccharides
Arômes (diacétyle,
acétoïne,
acétaldéhyde)
Actifs antimicrobiens
(bactériocines,
peroxydes)
Souches généralement considérées comme « GRAS »
(« Generally Recognized As Safe ») par la « Food and Drug Administration »
Pharmacie,
alimentaire, chimie
Cultures « Starter » :
produits fermentés
Probiotiques
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
30

31. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
31
Intérêt de l’utilisation des LNC dans la
maitrise des flores indésirables
en technologie fromagère : genre Listeria
1. Comportement des flores indésirables : Listeria sp dans les
conditions physico-chimiques de la technologie fromagère
2. Etude in vitro du comportement des consortia et/ou de
souches isolées de LNC vis-à-vis de Listeria innocua
3. Pré - caractérisation des métabolites antimicrobiens
produits par les consortia ou les souches isolées impliqués
dans l’effet inhibiteur
4. Etude des mécanismes d’action

32. 1. Comportement de
Listeria innocua LRGIA01 & ATCC33090
dans les conditions physico-chimiques
de la technologie fromagère
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
32
 Plan d’expérience Complet
 3 paramètres à 5 niveaux
 Culture dans le TSB (108 UFC/mL)
 3 répétitions
 DO entre 420 et 580 nm
 Durée=24h à T°=30°C
 Agitation moyenne, 15s
avant chaque mesure
 Traitement des résultats:
Excel et Statistica version 10
pH Taux de sel (M)
(soit en % NaCl)
Urée (mg/100mL)
4,5 0 (0%) 0
5 0,075 (0,44%) 5
5,5 0,15 (0,88%) 10
6 0,3 (1,75%) 20
6,5 0,6 (3,5%) 30

33. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
33
1. Comportement de Listeria innocua LRGIA01 &
ATCC33090 dans les conditions physico-chimiques
de la technologie fromagère
Effet du pH sur la cinétique de croissance de 2 souches
de L. innocua : ATCC33090 et LRGIA01 en milieu TSB
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
4,5 5 5,5 6 6,5
0,43
0,85
1,68 1,73
2,39
0,33
0,47
1,10 1,11 1,14
vitessespécifiqueµDO.h-1
pH
ATCC33090
LRGIA01
Effet plus marqué du pH sur L.
innocua ATCC 33090,
sa croissance est plus rapide
que celle de L. innocua LRGIA
à des pH proches de la
neutralité

34. Intérêt à limiter – bloquer la croissance
de Listeria
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
34
Les conditions testées montrent que :
 La variation de pH a un effet plus marqué sur L. innocua ATCC 33090,
 Listeria innocua n’est pas perturbée par les teneurs en sel testées
(Listeria innocua est halotolérante)
 L’urée est un facteur stimulant de la croissance de L. innocua. Cet effet
augmente en conditions de stress acide.
 Selon les facteurs étudiés, le comportement est souche dépendant
Par la
bioprotection –
isolats des LNCs

35. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
35
2. Etude in vitro du comportement des consortia
et/ou des isolats de LNC vis-à-vis de
L. innocua ATCC 33090 ou LRGIA01
 Test d’activité des 13 surnageants
(cultures de 48h à 30°C)
par la méthode de diffusion en puits
sur un milieu gélosé (TSA).
souche microbienne
bioprotectrice
microorganisme
altérant ou
pathogène
composés
antimicrobiens

36. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
36
13 isolats
Références : Isolats Références Isolats
F3 lcti 5 Lactococcus lactis F1.2 Lactococcus lactis
subsp. lactis
Lct AD2 Coques, G+, catalase-
: Lactococcus sp,
F2.3 Coques, G+, catalase-,
citrate +
Lct AD5 Lactococcus lactis
subsp. lactis
Levain Lc L14 Coques, G+, catalase- :
présumée Lc, lactis
Lct A1 Lactococcus lactis
subsp. lactis
Levain Lc L16 Lactococcus lactis
subsp. lactis
Lct A4 Lactococcus lactis
subsp. lactis
Levain Lc L20 Lactococcus lactis
subsp. lactis
Lc L15 Coques G+, catalase- :
Lc lactis
Lb levain L34 Lactococcus lactis
subsp. lactis
Lc L23 Coques, G+, catalase- :
Lc lactis
2 : Etude in vitro du comportement des consortia et/ou des
isolats de LNC vis-à-vis de Listeria innocua

37. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
37
F1.2 Lb levain L34
L. innocua
ATCC33090
L. innocua
LRGIA01

38. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
38
10
10,7
14,3
9
9
9,8
10,2
12,2
10,4
10,7
0
2
4
6
8
10
12
14
16
diamètred'inhibition(mm)
L.innocua ATCC33090
L.innocua LRGIA01
 Les 13 Sg de culture exercent une activité inhibitrice contre les 2 souches de
Listeria innocua testées (ATCC33090 et LRGIA01),
 12 Sg ont une activité marquée > 8mm, en particulier: F1.2>levain LcL20> LcL23
>Lct A1 qui ont un diamètre d’inhibition >10mm.
 Le Sg de l’isolat Lb levain 34 est le moins actif sur L. innocua.

39. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
39
L’effet inhibiteur des bactéries lactiques peut avoir plusieurs origines :
 acides organiques,
 peroxyde d’hydrogène
 bactériocines, etc…
3. Caractérisation des métabolites antimicrobiens
produits par les consortia ou les isolats impliqués
dans l’effet inhibiteur
microorganisme
altérant ou
pathogène
composés
antimicrobiens
libérés dans le
surnageant

40. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
40
Neutralisation des
13 surnageants de
cultures
 Eliminer l’effet des
acides organiques
Stabilité vis- à vis
des enzymes
protéolytiques
* Protéase
d’Aspergillus oryzae
*α-chymotrypsine
*trypsine
 Nature de l’agent
antimicrobien
Traitement
thermique
*40°C
*60°C
*100°C
 Évaluation de la
thermosensibilité des
composés
antimicrobiens

41. 06 octobre 2017 Formation "Perfectionnement des
41
8,2 8 8,3
10
7,8
7,1
8
10,7
14,3
9
5,9
9
3,4
6,8
7,3
5,9
7,4
6,7
5,8
6,6
8
10,8
6,5
3,3
8,1
0
-1
1
3
5
7
9
11
13
15
diamètred'inhibition(mm)
L.innocua ATCC33090
Sg non neutralisés
Sg neutralisés
Neutralisation des Sg des 13 cultures d’isolats
 Le Sg de l’isolat levain L34 est le seul à avoir perdu totalement son activité
inhibitrice contre L. innocua ATCC33090 lorsqu’il a été neutralisé.

42. 06 octobre 2017 Formation "Perfectionnement des
42
8,2 8 8,3
10
7,8
7,1
8
10,7
14,3
9
5,9
9
3,4
6,8
7,3
5,9
7,4
6,7
5,8
6,6
8
10,8
6,5
3,3
8,1
0
-1
1
3
5
7
9
11
13
15
diamètred'inhibition(mm) L.innocua ATCC33090
Sg non neutralisés
Sg neutralisés
F1.2
Sans traitement Ez Après traitement Ez
Stabilité des 13 Sg de culture
vis- à vis des enzymes protéolytiques

43. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
43
F1.2 Lb levain L34
L.innocua
ATCC33090
L. innocua
LRGIA01
40°C
60°C
100°C
Thermosensibilité des
composés antimicrobiens

44. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers" 44
Tests vis-à-vis de 2 souches de
L. innocua
Surnageants 3 à 14 mm de  d’inhibition
Surnageants neutralisés  des  d’inhibition
perte totale pour un isolat vis-à-
vis d’1 des 2 souches
Surnageants soumis à l’action
d’enzymes protéolytiques
perte de l’effet inhibiteur
Surnageants traités à 40°C pas d’effet excepté
pour 1 isolat
Surnageants traités à 60°C pas d’effet excepté
pour 1 isolat
Surnageants traités à 100°C perte de l’effet inhibiteur
Synthèse des résultats d’évaluation in vitro de l’activité anti-Listeria
des surnageants de culture (48 h, 30°C) de 13 isolats des levains :
méthode des puits en milieu gélosé (TSA)

45. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
45
Présence de « Bacteriocin Like
Susbtances » ?
Purification partielle ?
1) Conditions de production ?
2) Compatibles avec celles lors de
production, affinage puis conservation
des fromages?
Mécanismes d’action sur Listeria ?
 Lactococcus lactis produit plusieurs types de bactériocines telles que :
1. La Nisine
2. La Lacticine 3147
3. La Lacticine 481
4. La Lactococcine A, B et M ……
 La bactériocine la plus connue est la nisine, produite par Lactococcus lactis.
C’est la seule bactériocine, commercialisée sous le nom de Nisaplin®, autorisée
comme additif alimentaire E 234 depuis 1953.

46. 06 octobre 2017
46Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Françoise Leriche, Karine Fayolle, Didier
Hennequin , Philippe Veisseire et stagiaires
Clermont Université, VetAgro Sup, Unité CALITYSS, BP 10448, F-63000, Clermont-Ferrand, France
Laboratoire de biologie, Clermont Université, université d’Auvergne, IUT Aurillac
Université de Caen
Intérêt de l’utilisation des LNC pour
la maîtrise des flores indésirables
en technologie fromagère
Effet sur Pseudomonas spp.

47. Antagonisme vis-à-vis de Pseudomonas spp.: données
générales
Sur 53 isolats de LNC testés (LAB)
 4 présentent un fort antagonisme vis de Pseudomonas BO
 33 présentent un antagonisme « moyen » vis de Pseudomonas BO
 16 présentent un faible antagonisme vis de Pseudomonas BO
Pour un isolat LAB testé (Lb L34)
L’antagnonisme (d’intensité variable) a été mis en évidence vis-à-vis de 7
Pseudomonas / 14 (isolats et souches de référence)
Dans des conditions données, l’intensité de l’antagonisme entre
bactéries lactiques et Pseudomonas est souche dépendant
06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
47

48. 06 octobre 2017 48
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Premiers pas vers le décryptage des mécanismes
d’antagonisme (1/4 )
Cultures
entières
Surnageant de
culture filtré
Surnageant de culture
neutralisé et filtré
Cellules
fractionnées
Lb L 34
ZI Pseudomonas B0
16,7±0,6 Lysat cellulaire:
10,7±0,5
Contenu
intracellulaire:
0
Fragments
membranaires:
9,75
9,7±2,1 3,25±0,9
L’acidité joue un rôle majeur dans l’antagonisme
mais
Des composants membranaires semblent également impliqués

49. 06 octobre 2017 49
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Premiers pas vers le décryptage des mécanismes
d’antagonisme (2/4 ): focus acidité
4,5 4,5
7,5
Temps d'incubation
nécessaire pour cailler le lait
(en heures)
REGILAIT OXOID Chèvre UHT
Potentiel et cinétique
d’acidification corrects
pH 5,64 5,49 5,83
pHult 5,20 5, 08 5,20
Echantillons
Ac Lactique
g/L
Ac Formique
g/L
Ac Acétique
g/L
Ac Propionique
g/L
Ac Butyrique
g/L
Lait Chèvre + Lb L34
(caillé) 3,212 0,656 0,38 0,04 0
Lait Chèvre + Lb L34 +
Ps.BO (caillé) 3,54 0,7 0,348 0,048 0
Acide lactique majoritaire

50. 06 octobre 2017 51
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Premiers pas vers le décryptage des mécanismes
d’antagonisme (4/4): focus acidité
La nature, la concentration des acides produits par les
LAB (et notamment Lb l34), les valeur de pH et la
combinaison avec d’autres paramètres technologique ont
un impact majeur sur la croissance des Pseudomonas

51. 06 octobre 2017 52
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Premiers pas vers le décryptage des mécanismes
d’antagonisme: les métabolites de surnageant
Concentrât protéique
de surnageant (x10
et x100)
Surnageant
chauffé (40, 60,
100°c , 1h)
Surnageant
neutralisé
filtré
Surnageant de culture de Lb L 34
ZI Pseudomonas B0
1,5 à 2,25
±0,9
Les molécules du surnageant à activité antagoniste sont
thermostables Si bactériocines (conc trop faible)
Le peroxyde d’hydrogène ne semble pas impliqué dans l’antagonisme
3,25±0,9 0±0,9
Surnageant
traité à la
catalase
3,25±0,9

52. 06 octobre 2017 53
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
Premiers pas vers le décryptage des mécanismes
d’antagonisme: autres
Le diacétyle exerce un
effet bactériostatique sur
la croissance de
Pseudomonas BO
Les bas pH potentialisent l’effet de la
nisine qui est inactive aux pH proches de la
neutralité
Durée phase de latence
(jours)
Nisine 5 000 (UI/mL)
pH 4.5 pH 5 pH 5.5
2,75 1,19 0,23

53. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
54
 L’antagonisme entre bactéries lactiques et Pseudomonas est souche
dépendant
 L’antagonisme est fortement lié à l’action des acides produits par les
bactéries lactiques
 Les acides produits potentialisent l’action de molécules à activité
bactériostatiques/bactéricides
 Certaines molécules à activité bactériostique /bactéricide resteraient
liées à la membrane des Bactéries lactiques (contact nécessaire à
l’antagonisme)
 En présence d’acide (pH caillé) , les Pseudomonas pourraient être
dans un état physiologique dit VBNC (non dénombrables sur milieu
gélosé)
Conclusion et perspectives
Les LNC contiennent indéniablement des flores antagonistes des
Pseudomonas mais les travaux doivent se poursuivre afin de maitriser les
conditions de leur activité (effets conjoints)

54. 06 octobre 2017
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techniciens produits laitiers fermiers"
L. innocua Pseudomonas sp
Diamètre
d’inhibition (mm)
ATCC 33090 LRGIA01
F3 lcti5 8,20 ± 0,09 9,50 ± 0,09 < 2
Lct AD2 8,00 ± 0,09 9,80 ± 0,09 < 2
Lct AD5 8,30 ± 0,04 9,50 ± 0,09 0
Lct A1 10,00 ± 0,27 9,80 ± 0,09 3,3±1,1
Lct A4 7,80 ± 0,09 8,50± 0,33 10,3±2,1
Levain Lc L14 7,10 ± 0,13 9,30± 0,18 < 2
Levain Lc L16 8,00 ± 0,18 9,60 ± 0,04 9,3±2,3
Levain Lc L20 10,70 ± 0,13 10,20 ± 0,09 10,7±1,5
F1.2 14,30 ± 0,18 12,20 ± 0,00 2±0
F2.3 9,00 ± 0,27 10,40 ± 0,22 < 2
Lb Levain L34 3,40 ± 0,24 6,00 ± 0,13 16,7±0,6
Différentes souches/ isolats/ espèces concernées: des mécanismes communs et
des mécanismes spécifiques
Isolats de LNC: Potentiel antagoniste
55

55. 06 octobre 2017
Formation "Perfectionnement des
techniciens produits laitiers fermiers"
56
Mise en évidence du potentiel bioprotecteur de bactéries
lactiques issus des LNCs
Des mécanismes complexes et conjoints d’antagonismes
Des mécanismes différents selon les flores « cibles » -
Evaluation de cette capacité à exercer leur
effet bioprotecteur in situ
(dans les conditions de la matrice fromagère)