Présentation faite dans le cadre de la JdCHE 20-21 le 25-02-21

1. Contact
Nom Prénom : QUINTING Birgit
Affiliation : HELMo
Adresse : Quai du Condroz 28, 4031 Angleur
E-mail : b.quinting@helmo.be Tél : 0472/26 54 46
Remerciements/Type de financement
Logos bailleurs de fonds
(si d’application)
RECHERCHE
Mise au point d’une technique rapide d’extraction de l’ARN viral du SARS-
Cov-2 en vue d’un diagnostic par qRT-PCR
JORIS Marine1, QUINTING Birgit1,2, JACQUEMIN Olivier2, VIGNEAUX Christophe2, MAHY Florence2
1 : CRIG; 2 : HELMo St Julienne
Objectif
Développement et la validation d’une méthode d’extraction
d’ARN viral « Home made », non toxique et bon marché
comme alternative à la méthode TRIzol.
Extraction du génome viral
(Trizol, Chloroforme)
Réactifs
Solution?
Introduction
Fin 2019, un nouveau coronavirus (SARS-CoV-2) est apparu en Chine. En trois mois, la communauté internationale a été confrontée à une pandémie dévastatrice. La rapidité de la propagation de ce virus (R0 > 3) a imposé
aux laboratoires cliniques le développement d’une puissance de diagnostic inégalée. Avec le tracing, la distanciation et la quarantaine, l’identification rapide de la présence du virus (diagnostic direct) chez des personnes
exposées est incontournable pour contrôler la recrudescence de la maladie. Actuellement, en moyenne 29.630 personnes sont testées tous les jours rien qu’en Belgique. Dans ce contexte, disposer d’une méthode de
diagnostic direct fiable, rapide et applicable en grand nombre est indispensable. La qRT-PCR est considérée comme méthode de référence pour le dépistage de la COVID-19. La première étape de ce diagnostic consiste en
l’extraction de l’ARN génomique viral. La méthode du TRIzol est la méthode de référence décrite pour cette étape. Vu l’important besoin mondial, ce réactif est à risque de pénurie. De plus, la méthode du TRIzol inclut
l’utilisation de réactifs toxiques (phénol et chloroforme) et plusieurs étapes manuelles impossibles à automatiser. En l’état, elle ne convient donc pas à une utilisation en routine à grande échelle.
Méthode
Extraction « Home made »
• Lyse alcaline (NaOH) en présence de SDS et de β-mercaptoéthanol 10 min à 70°C
• Neutralisation avec de l’acide acétique
• Précipitation de l’ARN en présence d’isopropanol et de glycoblue
• Lavage du culot à l’éthanol
Validation de l’extraction
• 40 échantillons cliniques de statut variable (12<Ct<50)
• Extraction ARN avec la méthode de référence au TRIZOL
• Extraction ARN par la méthode “Homemade”
• Présence d’un contrôle interne pour valider l’étape d’extraction (virus de Schmallenberg)
• Analyse des échantillons extraits avec les deux méthodes par qRT-PCR (SARS Cov-2 et
Virus Samellenberg)
• Comparaison des méthodes par tables de contingences
• Sensibilité = VP/(VP+FN)*100
• Spécificité = VN/(VN+FP)*100
• Valeur prédictive positive (VPP) = VP/(VP+ FP)
• Valeur prédictive négative (VPN) = VN/(VN+FN)
avec VN= Vrai négatif, VP = Vrai positif, FN= Faux négatif, FP = Faux positif
Amplification par qRT-PCR
Résultats
Sur les 40 échantillons extraits en parallèle par la méthode de référence (TRIzol) et la méthode
« Home made » développée,
• 34 échantillons sont positifs avec les deux méthodes (VP)
• 5 sont négatifs avec les deux méthodes (VN)
• 1 échantillon est positif avec la méthode de référence et négatif avec la méthode développée (FN)
Les résultats de cette comparaison de méthodes montrent que le protocole d’extraction développé
permet d’atteindre une spécificité de 100%, une sensibilité de 97.1% et des valeurs VPP et VPN de 1
et de 0.83, respectivement.
Conclusion et perspectives
La méthode développée montre une spécificité identique à celle de la méthode de
référence et la fiabilité des résultats positifs est maximale (VPP de 1). La sensibilité est
de plus de 95% et la fiabilité d’un résultat négatif est élevée (VPN 0,83). En cas de
pénurie de réactifs, cette méthode d’extraction du génome du SARS-Cov-2 pourra
donc remplacer la méthode au TRIzol. Elle présente également une alternative fiable
à faible coût accessible à tout laboratoire faisant face à des moyens financiers limités.
Avec le soutien financier de