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Tutorat Associatif Toulousain
                              Année universitaire 2010-2011
                                        PACES




   UE 1 : Chimie, Organisation, évolution et fonction du génome humain.
             Structure, diversité et fonction des biomolécules.


       Organisation, évolution et
         fonction du génome
                              (Biologie Moléculaire)
                          Fiches de cours et QCM




                       Partenaire du Tutorat Associatif Toulousain
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ATTENTION !


    Ce polycopié a été relu sur la base des cours dispensés à la
faculté de Rangueil pour l'année 2009-2010.

     Cependant, suite à la réforme de la PACES, le programme de
Biologie Moléculaire a été quelque peu modifié. Par conséquent,
certains éléments présents dans ce polycopié peuvent ne plus être
d'actualité.
     A vous de trier parmi les différentes fiches de cours et les
différents items proposés ceux qui restent en accord avec les cours
dispensés par mesdames et messieurs les professeurs.
    N'hésitez pas à signaler toutes les erreurs éventuelles ou
remarques concernant ce polycopié sur tutoweb dans la rubrique
« Forum polycopiés » ou lors de l'une des permanences du tutorat.

En aucun cas le contenu de ce polycopié ne pourra
engager la responsabilité de la faculté de médecine ou
de mesdames et messieurs les professeurs.
Ce polycopié a été réalisé par :
Mirvat Hamdan, Nicolas Bernabeu
Yohann Vergès, Claire Buirette
Julie Calonge ,Marine Herman
Capucine Tatin
Relecture par les tuteurs des années 2010-2011

Compilé par Guillaume Gilbert

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Plan
I              Présentation de la biologie moléculaire
                                                page 5

II             Notions de cours                                                      page 6

III            QCM d’entraînement                                                    page 32

IV             Correction détaillée du concours officiel
               de janvier 2006                  page 173

V              QCM supplémentaires du Tutorat
               2005 - 2006                  page 181




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I Présentation de la biologie moléculaire
                         et du polycopié
   La biologie est une matière qui n’est pas des plus difficiles pour le concours d’après les
étudiants. Cependant, la partie qui pose généralement le plus de problème est celle qui
concerne les techniques et animaux transgéniques.

   Il y a de nombreuses notions à apprendre par cœur mais relativement peu par rapport à
l’ensemble des autres matières. Il s’agit en fait plus d’exercices de compréhension et de
logique. L’entraînement à ces exercices est primordial, d’où l’importance d’assister aux
séances de TD durant lesquelles les réponses des QCM du polycopié d’entraînement de la
faculté vous serons données ; vous pourrez aussi y posez vos questions et suivre quelques
rappels de cours.

   Ce polycopié que nous avons réalisé pour le T.A.T a pour vocation de vous
permettre un entraînement varié et optimal pour le concours. Nous avons essayé de suivre
directement le modèle des QCM de la faculté, mais il est fort possible qu’un petit nombre
des QCM que vous trouverez ici sont plus ardus et font référence à des détails plus
poussés que ceux demandés le jour du concours. Ne vous focalisez pas sur ces éléments.

       Si vous avez des questions, consultez le forum http://www.tutoweb.org ou les
tuteurs que vous trouverez pendant les permanences du Tutorat.

   Dans les cas éventuels où il y aurait des erreurs concernant les QCM ou les fiches de
cours de ce polycopié, nous mettrons en ligne (sur le site) les errata correspondant et nous
vous en informerons par l’intermédiaire des colles.


   Bonne chance à tous !


   NB : vous aurez besoin du tableau du code génétique et de la correspondance des
bases wobble (qui ne sont pas inclus dans ce poly, mais qui sont présents sur la première
page de chaque sujet de concours de la fac) pour répondre à certains QCM.




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II Fiches de cours
        Voici un petit nombre de fiches explicatives de points du cours qui peuvent poser problème.
Beaucoup d’autres éléments indispensables à assimiler sont expliqués dans la correction des QCM qui
concernent directement ces points (partie IV). Les tuteurs éditerons des fiches explicatives au cours de
l’année s’il apparaît que certains points du cours ne sont pas bien compris par une grande partie des
étudiants. Si certaines choses restent mystérieuses à vos yeux, le forum tutoweb.org et les permanences
des tuteurs sont là pour vous les expliquer.

       -   Classification des acides aminés                                                     page 7

       -   Dosage et densité optique                                                            page 8

       -   Chromatographies échangeuses d’ions                                                  page 9

       -   Bases, nucléosides et nucléotides                                                    page 10

       -   Enzymes de restriction                                                               page 13

       -   Sondes                                                                               page 14

       -   Amplification élective in vitro : PCR                                                page 19

       -   Analyse du génome                                                                    page 21

       -   Séquençage nucléotidique                                                             page 23

       -   Analyse de l'expression des gènes                                                    page 24

       -   Analyse génotypique                                                                  page 28




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Classification des acides aminés (aa)
     1 AA = une fonction amine NH2 + un radical R + une fonction acide carboxylique COOH

         R – CH – COOH                      le carbone lié a la fois au groupement COOH et
              /                                NH2 est dit « carbone α »
           NH2

             Selon la nature de R on parle d’AA polaires ou apolaires, il s’agit de la réaction de l’AA vis-
à-vis de l’eau. En effet le corps humain est constitué en grande majorité d’eau, il est logique d’envisager
la réaction des AA dans un milieu aqueux.

              Polarité : tendance de la molécule à agir avec l’eau au pH physiologique de 7,42

         ------------------------------------------/-------------------------------------------------->
                       acide                      7,42                        alcalin

             AA apolaires                                           AA polaires
                                                  Neutres                   Acides              Basiques

     Glycine          G    (Gly)        Serine        S     (Ser)      Ac. Aspartique       Lysine K
     Alanine          A    (Ala)        Thréonine     T    (Thr)        D ( Asp)           (Lys)
     Valine           V    (Val)        Asparagine    N    (Asn)
     Leucine          L    (Leu)        Glutamine     Q    (Gln)       Ac. Glutamique      Arginine R
     Isoleucine       I    (Ile)        Cystéine      C    (Cys)        E (Glu)            (Arg)
     Phenylalanine     F   (Phe)        Tyrosine      Y    (Tyr)
     Tryptohane       W     (Trp)                                                          Histidine H
     Méthionine       M    (Met)                                                           (His )
     Proline          P    (Pro)

Quelques petites précisions sur les AA qui tombent souvent dans les QCMs!
Glycine ou Glycocolle: le plus petit des AA (R=H)
Proline: iminoacide (fonction imine NH), cyclique donc jouant un rôle important dans la structure spatiale
des protéines.
Cystéine: présence d'un groupement Thiol SH qui, par condensation de deux cystéines, permet la
formation d'un pont dissulfure et l'obtention d'une cystine.
Asparagine et Glutamine: amides
Ac aspartique et ac glutamique: ac dicarboxyliques ( 2 fonction COOH)

Au sein d’une protéine dans un milieu aqueux :

-   les AA apolaires sont enfouis au cœur de la protéine
-   les AA polaires sont à la surface, en contact avec l’eau

=> substituer un AA par un autre de la même polarité au sein d’une même protéine a moins d’effet sur
son éventuelle déformation que si les deux acides aminés n'ont pas la même polarité.




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Dosage et densité optique
         Pour mesurer la concentration (dans une solution) de certaines molécules organiques, on peut
utiliser la spectrophotométrie. Il s’agit de mesurer en unités arbitraires la D.O. (ou densité optique) d’une
solution traversée par un faisceau de lumière, et dont la longueur d’onde λ est fixée au préalable par
l’expérimentateur.

                                                          Pour calculer la D.O., on mesure l’intensité du
                                                          faisceau lumineux avant et après la traversée de la
   1,2                                                    solution. Ainsi : D.O. = log I0
    1
                                                                                        I
   0,8
   0,6                                      D.O.          Retenir absolument que :
   0,4
                                                             - les Bases azotées puriques et pyrimidiques
   0,2                                                           présentent un pic d’absorption à 260 nm
    0
                                                             - le PHénol à 270 nm
            250   260    270    280
            nm    nm     nm     nm
                                                             - les Protéines à 280 nm

                                                          (exemple de moyen mnémotechnique : BFP)

         NB : Présenter un pic d’absorption ne veut pas dire que le composé n’absorbe pas une lumière
          monochromatique d’une autre λ mais qu’il absorbe le plus la lumière à la λ qui donne le pic

   -      1 D.O. à 260 nm est équivalente à une concentration de 50 μg/ml de DNA double brin
          ou de 40 μg/ml de DNA simple brin ou de RNA.
          Donc l’ARN absorbe plus que l’ADN à 260 nm (parce que pour absorber la même valeur on a
          besoin de moins d’ARN que d’ADN).

Applications :

   -       Apprécier le degré de pureté du DNA :

           Pour savoir si une solution contient du DNA pur ou contaminé par des protéines, on fait 2
           mesures, la 1ère à 260 et une 2nde 280 nm. Les protéines présentent un pic d’absorption à 280 nm
           mais absorbent aussi à 260 nm, même si l’absorption est moins importante.
           Après les 2 lectures, on fait le rapport D.O. 260
                                                    D.O. 280

           Si le rapport est de l’ordre de 1,8-2 (ou plus) => la solution d’acide nucléique est pure
           Si le rapport est inférieur à 1,8 => solution d’acide nucléique contaminée par des protéines

           On peut aussi faire le rapport DO 280 / DO 260 :
           Si le rapport est d'environ = 0,5 => pure
           Si le rapport est > 0,5 => contaminée

   -       Apprécier le degré de contamination par du phénol :

           On fait le rapport D.O. 260
                              D.O. 270



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Chromatographies échangeuses d’ions
                                      Petit rappel essentiel :
            Les CATIONS sont chargés + et se déplacent vers la CATHODE qui est chargée –
              Les ANIONS sont chargés – et se déplacent vers l’ANODE qui est chargée +

         A un pH neutre, un aa ACIDE est ANIONIQUE et un aa BASIQUE est CATIONIQUE

        Les chromatographies échangeuses d’ions se font sur des résines chargées électriquement. Elles
servent à détecter et isoler les ions d’une même charge. Elles se font en général sur des colonnes ou
résines sur lesquelles des groupements de charges positives ou négatives sont liées par covalence. On fait
passer sur ces résines les solutions, et y adhèrent les groupements de charge opposée au support. En fin
d’expérience on peut faire passer une solution éluante, plus chargée que la résine et qui entre en
compétition avec elle, qui permet le décrochage des éléments accrochés.

Résine échangeuse       Ions fixés      Charges électriques résine
D’anions                 anions (-)             positives
De cations              cations (+)             négative

Conseil : Ce sont en général des acides aminés qu’il vous sera donné de séparer par cette méthode.
Il est préférable de toujours poser vos acides aminés sur une feuille à part et faire un petit tableau. Ces
acides aminés baignent dans un milieu de pH qui vous sera donné. Marquez le pH du milieu à l’aide d’un
gros trait en considérant la ligne horizontale comme l’échelle du pH allant croissant de gauche à droite.

                                                          pH de l’expérience
         aa acides                            aa neutre                           aa basiques

           pHiA                        pHiN                                pHiB                   pH
    Il s’agit ensuite de comparer le pH du milieu et le pHi des acides aminés. Soit le pH du milieu est
extrême donc vous saurez pertinemment le situer par rapport à celui des acides aminés (si les valeurs ne
sont pas données, on peut retenir pHiA=2, pHiN=7, pHiB=12), soit il vous sera fourni dans l’exercice le
pHi de chacun des acides aminés mis en question.

- Si pH < pHi, c’est le milieu qui est plus acide, les acides aminés seront basiques par rapport au milieu,
ils attirent donc les protons et se chargent positivement.
- Si pH > pHi, les acides aminés sont acides par rapport au milieu, ils céderont des protons au milieu et
seront chargés négativement.

 Ainsi, après une chromatographie, les aa seront                Une résine échangeuse de cation peut être
 séparés en fonction de leur charge : les élués (non                       représentée ainsi :
 fixés à la colonne) seront ceux de même charge que la
 résine. Tandis que ceux de charge opposée seront
 fixés. Plus l’acide aminé a un pHi éloigné du pH du
 milieu plus il sera acide ou basique par rapport à
 celui-ci, donc d’autant plus chargé ; il sera le premier
 à être élué ou fixé, si respectivement il est ou n’est
 pas de même charge que la résine.




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Bases, nucléosides et nucléotides
I - LES BASES

Bases puriques et pyrimidiques :

       Elles dérivent d’hétérocycles azotés : le noyau purine ( 2 cycles) ou le noyau pyrimidine (1 cycle).
Ces 2 cycles sont insaturés, conjugués, les liaisons peuvent donc se déplacer.

                     PURIQUES                                              PYRIMIDIQUES
                                                                             C : Cytosine
                     A : Adénine
                                                                             U : Uracile
                     G : Guanine
                                                                             T : Thymine
      Bases : - communes au DNA et RNA : A, C et G
              - spécifique au RNA : U
              - généralement spécifique au DNA : T

Isoméries et tautoméries des bases :

        Amine NH2  Imine NH                        Cétones O  Hydroxyle (énol) OH
Chaque radical des bases peut être présent sous 1 des 2 formes tautomériques, ces 2 formes étant en
équilibre mais il y en a toujours une dominante par rapport à l’autre : la forme amine et la forme cétone.

Dérivés de bases :

       - A partir de la purine (A ou G), et par une succession de désaminations et d’oxydations :


  Base Purique                Hypoxanthine (Hx)                 Xanthine                Acide Urique

                        Présente dans certains ARNt (de                         Chez l’homme, étape finale du
                         transfert) dans les anticodons                                  catabolisme.
   Nombre de                         1 (en 6)                  2 (en 2 et 6)            3 (en 2, 6 et 8)
 radicaux OH et
    positions
   Pathologie               Présente anormalement en                            En cas d’excès, pathologie de
                         grande quantité dans le DNA en                                   la goutte
                             cas d’attaque oxydative

       - Bromouracile (BrU) :
Le BrU est un analogue de la thymine, sa présence augmente la présence des formes tautomériques rares,
donc de mésappariements. C’est un agent mutagène, il augmente près de 100 fois le risque de mutations.
Le BrU s’apparie normalement avec A, mais présente une forme énol 100 fois plus abondante qui
s’apparie avec G.

       - Méthylxanthines :

              Triméthylxanthine : caféine                     Diméthylxanthine : théophylline et
                                                                        théobromine


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Ce sont des excitants au niveau cardiaque et du SNC :
- effets inotrope ( force de contraction du cœur ) et chronotrope ( fréquence cardiaque) positifs =>
augmente le débit cardiaque, mais avec une certaine limite (si excès, le débit chute).
- effet broncho-dilatateur sur les muscles lisses bronchiques, utilisés pour calmer la crise d’asthme.

II – LES NUCLEOSIDES = Association d’une base avec un sucre qui peut être

                           -   soit le ribose : dans le RNA  forme un ribonucléoside
                           -   soit le désoxyribose : dans le DNA  forme un désoxyribonucléoside

               Base              Associée au ribose               Associée au désoxyribose
                               RIBONUCLEOSIDE                   DESOXYRIBONUCLEOSIDE
                A         Adénosine A                          Désoxyadénosine     dA
                G         Guanosine G                          Désoxyguanosine     dG
                U         Uridine U
                C         Cytidine C                           Désoxycytidine           dC
                T         Ribothymidine T (dans ARNt)          Thymidine                dT
                Hx        Inosine I (hypoxanthine + sucre)


III – LES NUCLEOTIDES = Association d’un nucléoside (base + sucre) avec 1,2 ou 3 phosphates

         Le 1er phosphate est lié au sucre en 5’ par une liaison ester, puis entre les groupements phosphates
il y a établissement de liaison anhydride d’acide.

                   RIBONUCLEOTIDES                                 DESOXYRIBONUCLEOTIDES
 Base          mono         di        tri                         mono       di        tri
incluse      phosphaté  phosphaté phosphaté                     phosphaté phosphaté phosphaté
   C           CMP        CDP       CTP                           dCMP      dCDP      dCTP
   U           UMP        UDP       UTP
   G           GMP        GDP       GTP                           dGMP             dGDP             dGTP
   A           AMP        ADP       ATP                           dAMP             dADP             dATP
   I           IMP         IDP       ITP
   T           TMP        TDP       TTP                            dTMP            dTDP             dTTP

Il existe aussi des nucléotides cycliques : AMPc (3’-5’) et AMPc (2’-3’)       (liaison phosphodiester)

IV – LES DERIVES

    S-adénosylméthionine               Rôle dans la méthylation
Phosphoadénosylphosphosulfate          Rôle dans la sulfatation
      Amino-acyl- AMP                  Intermédiaire de l’activation des AA dans la synthèse des protéines
         Acyl- AMP                     Intermédiaire de l’activation des acides gras dans leur transfert
   Co-enzymes NAD/ NADP
UDP-glucose, CDP-choline, etc…         Forme activée de diverses molécules pour leur transfert




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Antimétabolites :

6-mercaptopurine        Atome de soufre en 6, utilisé pour le traitement des leucémies.
   Allopurinol          Inhibiteur de la xanthine-oxydase, donc de la formation de l’acide urique
                        => traitement de la goutte. Ce n’est pas un noyau purine !!!
   thioguanine          Atome de soufre en 6 et fonction amine en 2. Utilisé dans le traitement des
                        leucémies.
  5-fluoro-uracile      Analogue de la thymine, anti-cancéreux.
         5-             Analogue de la thymidine, Anti-herpès.
iododésoxyuridine
   Puromycine           Structure : adénine diméthylée + analogue ribose avec NH2 en 3’ + AA non présent
                        chez l’humain (donc liaison amide entre ces 2 derniers !)
                        Analogie avec l’extrémité CCA-terminale des tRNA portant un AA.
                        La puromycine agit donc en compétition avec les tRNA, se pose sur le site A du
                        ribosome et bloque la synthèse des protéines
 5-fluorocytosine       Anti-fongique
       AZT              Anti HIV
(azidothymidine)
     Acyclovir          Structure proche d'une guanosine. Anti herpès/varicell/zona
 Ara-C (cytosine        Traitement des leucémies aigües.
   arabinoside)
   Gemcitabine          2 fluors au niveau du C2 du ribose accroché à une cytosine. Traitement des cancers.




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Enzymes de restriction
        Les enzymes de restriction coupent uniquement le DNA double brin ; ce sont des endonucléases,
elles coupent à l’intérieur de la chaîne nucléotidique après reconnaissance d’une séquence spécifique.
Ces endonucléases sont parfois synthétisées par des bactéries suite à une agression par des phages. Elles
coupent le matériel génétique du phage, ce qui neutralise son pouvoir infectieux.

On classe les endonucléases de restriction en 3 catégories :

            Classe         Reconnaissance de la séquence                 Lieu de la coupure
                                    spécifique
               I                       oui                             1000 à 5000 pb plus loin
              II                       oui                              La séquence elle même
              III                      oui                                  20 pb plus loin


       Les endonucléases de classe II coupent des séquences dites « palindromiques », ce qui signifie en
terme de DNA double brin que la séquence nucléotidique lue de 5’ en 3’ est la même sur les 2 brins
complémentaires (parfois à l’exception de la base centrale, si la séquence de reconnaissance est impaire).

On distingue 2 types de coupure :

   - la coupure franche :
    Après intervention de l’enzyme, la chaîne initiale de DNA est divisée en 2, les 2 bouts de chaîne étant
   droits.
   Ex : 5’--- G T T ║ A A C --- 3’      Hpa I
        3’ ---C A A ║ T T G --- 5’

   - la coupure cohésive ou saillante ou en baïonnette ou protrusive :
    L’enzyme coupe le palindrome au centre, en laissant 2 bouts saillants, ce qui permet le recollement
   des 2 extrémités si mises en présence, par complémentarité des bases azotées.
   Ex : 5’ --- G║AACTT C --- 3’ EcoRI
                  ╚═════╗
          3’ --- C TTGAA║G ---5’


Isoschizomères :

        Sont dites isoschizomères des enzymes de classe II reconnaissant la même séquence nucléotidique
et la coupant de la même façon. Cependant il arrive que les conditions dans lesquelles les enzymes sont
capables d’exercer leurs fonctions ne soient pas les mêmes.
        Souvent, une des deux enzymes est sensible à la méthylation, c’est-à-dire que si la séquence est
méthylée, l’enzyme sensible ne peut plus la couper. On peut donc utiliser les isoschizomères comme outil
diagnostique, les méthylations pouvant être à l’origine de maladies génétiques.




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Sondes
Partie 1 : DENATURATION = FUSION
Dénaturation = Fusion = passage de l’ADN double brin à l’ADN simple brin par coupure des liaisons
hydrogènes suite à l’augmentation de la température.




                                                                Evolution de la DO de l’ADN en fonction
                                                                           de la température.


                                                               Rappel : ADN sb absorbe davantage qu’ADN
                                                               db (cf. De Graeve)




PARAMETRES INFLUENCANT LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm)
Tm : température à laquelle les brins d’ADN sont dénaturés.
-   Composition en bases car fonction du nombre de liaisons :
    AT qui a 2 liaisons hydrogène, a un Tm plus faible (donc est plus facilement dénaturable) que GC qui
    a 3 liaisons hydrogène.
-   Longueur de l’Acide Nucléique car il y a une multiplication du nombre de liaisons hydrogène.
-   Présence de més/non-appariements car les liaisons hydrogène sont fragilisées :
    plus il y a de mésappariements, plus le Tm est abaissé).
-   Concentration en sels dans le milieu :
    la baisse de la concentration en sels diminue le Tm.
NB : Une solution est d’autant plus stringente que sa concentration en sels est faible.
-   Formamide dans le milieu déstabilise le Tm.




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Partie 2 : HYBRIDATION
       = association de deux brins d’acides nucléiques complémentaires suite à un refroidissement lent.
Attention ! Un refroidissement brutal condamne l’ADN à rester à l’état simple brin.


FACTEURS INFLUENCANT L’HYBRIDATION
   -   Cot (Concentration d’ADN et temps que l’on donne à ces séquences pour se réassocier)
NB : Au Cot ½, 50% des séquences d’ADN sont associés.
   -   Température qui doit être inférieure au Tm
   -   Longueur des fragments
   -   Complexité des séquences
   -   Nature des acides nucléiques
   -   Force ionique


METHODES


1) Hybridation en phase liquide
       Applications : Taille du génome : Cot ½ proportionnel à la taille du génome
                        Etude des séquences répétitives




                                                          1. Séquences hautement répétitives
                                                          (satellites)


                                                          2. Séquences moyennement répétitives


                                                          3. Séquences uniques


2) Hybridation sur support solide


3) Hybridation in situ
       Application : Localisation d’un gène sur des chromosomes
                      Criblage de banques
                      FISH


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Partie 3 : TECHNIQUE DE MARQUAGE DES SONDES

Sonde = séquence polynucléotidique complémentaire d’une séquence d’ADN ou d’ARN avec laquelle
elle s’hybride.
L’hybridation est spécifique (seule la sonde spécifique pourra s’apparier avec la séquence
correspondante) et sa sensibilité dépend du marquage des sondes. Ce marquage peut être de deux types :
    -    Radioactifs                  sondes chaudes
    -    Non radioactifs              sondes froides


1) NICK TRANSLATION


But : couper des petits bouts d’ADN pour les remplacer par de l’ADN marqué




a) Cassures aléatoires par une endonucléase, la
DNAse
b) Agrandissement des cassures par l’activité
exonucléase 5’  3’ de l’ADNpol I


c) Synthèse d’ADN grâce à l’activité polymérase
de l’ADNpol I en utilisant des dXTP marqués.


Résultat : obtention d’un ADN bicaténaire
contenant des nucléotides marqués sur les deux
brins.




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2) MULTI-RANDOM PRIMING = Multi-amorçage au hasard


But : Synthétiser de l’ADN marqué




a) Chauffage de l’ADN double brin puis
refroidissement brutal entraînant une séparation
définitive des deux brins


b) Synthèse de façon aléatoire d’une multitude
d’amorces hexanucléotidiques.



c) Parmi ces amorces, certaines vont forcément
rencontrer leurs séquences complémentaires sur
l’un des brins d’ADN.



d) Synthèse d’ADN par l’ADNpol en utilisant
des dXTP marqués


Résultat : obtention de deux molécules d’ADN
bicaténaires dont un seul brin est marqué (par
molécule)
3) T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE

Marque l’extrémité 5’ par ajout ou substitution du phosphate γ du 1er nucléotide.


4) SONDES CLONNEES DANS LE PHAGE M13

       Le phage M13 est un vecteur monobrin dont la séquence est entièrement connue et qui va
transporter la séquence d’ADN d’intérêt, la sonde.
       On créée une amorce complémentaire de la partie adjacente à la sonde. Cette amorce permet à
l’ADNpol de synthétiser un brin d’ADN marqué à partir de dXTP marqués. Cette synthèse va très vite
s’interrompre et ne couvre ainsi que le gène d’intérêt.
NB : la sonde elle-même n’est pas marquée, c’est son complémentaire.
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5) RIBOSONDES : sondes ARN


                    Nick           Multi-Random        T4 polynucléotide
Technique                                                                        Phage M13
                Translation           Priming                 kinase
                Sur les deux       Sur un des deux
Marquage        brins d’ADN          brins d’une           Extrémité 5’             Vecteur
                 par endroit      molécule d’ADN
Amorce ?            Non                  Oui                   Non                   Oui
                                  Oui, car formation
Fragment
                     Non          de nouveaux brins            Non                    Non
de Klenow
                                    (~ réplication)
                   DNAse              Amorces           Phosphate marqué
                                                                                   Amorce
  Outils          ADNpol I             ADNpol           T4 polunucléotide
                                                                               Vecteur : phage
               dXTP marqués        dXTP marqués               kinase




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AMPLIFICATION ELECTIVE IN VITRO :
                   PCR

OBJECTIF : Amplifier la quantité d’ADN (uniquement l’ADN)

OUTILS :
               -    2 amorces (= oligonucléotides)
               -    ADNpol
               -    Substrats : dXTP


PRINCIPE : Grâce à un couple d’amorces strictement complémentaires des bornes de la région d’ADN
à amplifier, on synthétise une très grande quantité d’ADN à la suite de plusieurs cycles.

1) DENATURATION : séparation des brins par
augmentation de la température (95°C environ)



2) HYBRIDATION des AMORCES avec les
bornes de la région à amplifier. (50°C environ)
NB : la température doit être diminuée pour que
l’hybridation est lieue.




3) SYNTHESE : l’ADNpol synthétise de
l’ADN. Ainsi, à la fin d’un cycle, on double la
quantité initiale. (70°C environ)


                   Fin du Cycle

Après n cycles, on obtient 2n nouveaux
exemplaires du fragment d’ADN




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RESULTATS :

Qu’obtient-on au bout du 1er cycle ?




                                   2 copies avec les extrémités 3’ variables.




Qu’obtient-on au bout du 2ème cycle ?




                                8 copies dont 2 avec les extrémités 3’ fixes




LIMITES :

           - Taille : on ne peut amplifier que des petits fragments (taille inférieure à 2 kpb)
           - Connaissance d’une partie de l’ADN à amplifier (pour l’amorce)
           - ADNpol thermorésitante est dépourvue de la fonction proof-reading d’où un risque
           d’erreur.
           - Amplification parasite : mauvaise hybridation et contamination



APPLICATIONS :

           - Génération des sondes
           - Recherche de mutations
           - RT-PCR : étude des ARN
           - Clonage
           - PCR quantitative
           - PCR en temps réel : quantification précise




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Analyse du génome

   Le génome comprend l’ADN génomique nucléaire et mitochondrial.

         Southern Blot

                 1. Méthode

                    - Fragmentation de l’ADN (bicaténaire) par une enzyme de restriction
                    - Séparation des fragments par électrophorèse
                    - Dénaturation (solution alcaline sur le gel)
                    - Transfert des fragments par capillarité sur une membrane (nylon ou nitrocellulose)
                    - Fixation des fragments (UV ou chauffage)
                    - Pré-hybridation des sites non occupés par un ADN hétérologue
                    - Hybridation avec une sonde froide ou chaude : incubation de l’ADN fixé sur le support avec
                    la sonde, puis lavages avec des solutions salines de force ionique variable :
                            - Solution très concentrée (haute force ionique ou faible stringence) => Hybrides peu
                            déstabilisés => signaux non spécifiques++
                            - Solution très diluée (faible force ionique, forte stringence) => Séparation de tous les
                            hybrides => aucun signal après le lavage

   La taille des fragments peut être déterminée grâce à un système d’étalonnage avec des marqueurs de
   taille.

                 2. Application

   - Carte de restriction
   Identification de fragments d’ADN après digestion par des enzymes de restriction.

   Ex :                                                                           SONDE
                            6kb                    8kb
EcoRI


IndIII
                                        7kb                          10kb

   Southern Blot :
             -                                               10 kb

                                                             8 kb

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         +
                    EcoRI          IndIII     EcoRI+IndIII

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- Détection : - de pseudo-gènes (gènes non fonctionnels car non transcrits) et de gènes
               apparentés (appartenant à la même famille, Hb par exemple), à la même superfamille (Ig
               par exemple) ou à différentes espèces (séquences homologues) : les séquences n’étant pas
               parfaitement complémentaire il ne faut pas que la stringence soit trop forte.
             - de polymorphismes (RFLP)
             - de délétions
             - de mutations ponctuelles
             - de recombinaisons

       1. Exemples

QCM : À partir d’ADN génomique de deux individus A et B on analyse par Southern un fragment de
600pb d’un gène porté par le chromosome X. Ce fragment ne contient qu’un seul site de restriction Apa I
(insensible à la méthylation) et Hae III (sensible à la méthylation, c'est-à-dire qu’elle n’agit pas quand le
site est méthylé).
La sonde utilisée couvre tout le fragment du gène.
Digestion par les enzymes. Résultats :


                 Individu A                                   Individu B
       Apa I     -      +      -                Apa I     -      +         -
       HaeIII   -       -      +                HaeIII   -       -         +
                                       600 pb




                                       400pb


                                       200pb




Rappel : chez un homme (XY) les gènes du chromosome X sont actifs, tandis que chez une femme (XX)
l’un des 2 X est inactivé « au hasard » par méthylation.
Ce que l’on peut conclure à partir de ces résultats :
L’individu A a un allèle coupé par Hae III mais pas l’autre, ce qui signifie qu’un des 2 allèles est
méthylé. Cela correspond à un profil XX.
Chez l’individu B tous les chromosomes X sont coupés par Hae III, donc aucun n’est méthylé, ce qui est
compatible avec le profil d’un homme.



Rq : Une absence de signal peut correspondre à une grande délétion ou à une erreur technique !




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Séquençage nucléotidique
Aussi appelé méthode de SANGER, le séquençage utilise des 2’-3’didésoxynucléotides.

            Méthode
        Pour séquencer une séquence d’ADN on place une amorce puis on synthétise son complémentaire
avec des désoxynucléotides (dNTP), et une petite quantité de didésoxynucléotides (ddNTP) (rapport
1/100 environ). Les ddNTP seront utilisés aléatoirement par la polymérase qui va les fixer au dNTP
précédent par le 3’OH. Ce 3’OH étant absent sur les ddNTP, leur fixation va interrompre la chaîne.
On obtient ainsi toute une population de fragments interrompus à divers stades.
        Pour visualiser les fragments on peut marquer l’amorce (d’abord radiomarquées puis remplacées
par des amorces portant des fluorophores), les dNTP ou les ddNTP. Actuellement on utilise
l’électrophorèse capillaire (migration dans de petits tubes capillaires). Le risque d’erreur lors du
séquençage est de 1/100 000 bases.

            Exemple
        Marquage radioactif => Expérience divisée en 4 : ddATP + dNTP dans le tube 1, ddTTP + dNTP
dans le tube 2, ddCTP + dNTP dans le tube 3, ddGTP + dNTP dans le tube 4
Puis on fait migrer sur un gel d’électrophorèse :
                     A           T        C       G
           -                                                 3’

 Sens de
 migratio
 n



                                                                        du brin
                                                                        néosynthétisé




            +
                                                                   5’

On a donc : Brin complémentaire : 5’ ATACGTACTGTA 3’
            Séquence initiale :   3’ TATGCATGACAT 5’
       La synthèse du brin néosynthétisé se fait de 5’ en 3’.

Sur le gel, les brins d’ADN les plus proches de l’anode (-) sont ceux qui ont migré le moins, ce sont donc
les plus grands, ce sont ceux qui ont incorporé le plus tardivement un ddNTP, ils correspondent à
l’extrémité 3’. Les brins les plus petits migrent beacoup et sont proches de la cathode. Ainsi la lecture de
la séquence se fait dans le sens inverse du sens de migration électrophorétique. Pour connaître la séquence
initiale on prend le complémentaire du brin néosynthétisé. Si on utilise la fluorescence on marque les
différentes bases avec un fluorophore différent dans 4 tubes différents puis on mélange et on fait migrer
sur un gel d’électrophorèse : on obtient alors une succession de pics fluorescents (sens 5’-3’ généralement
de gauche à droite).


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Analyse de l'expression des gènes
Expression des gènes => mRNA : fragiles (détruits par les ribonucléases), peu abondants et tissu
spécifiques (par exemple le gène de l’Hb est très exprimé dans les cellules hématopoïétiques).


         I.       Analyse qualitative des ARN

                  1. Northern Blot

                          a. Méthode

Electrophorèse des ARN en gel dénaturant, transfert sur une membrane et hybridation avec une sonde =>
PAS DE FRAGMENTATION (≠ Southern blot)
Le gel dénaturant sert à éviter les structures secondaires qui peuvent modifier la migration des ARN, ils
migrent ainsi seulement suivant leur taille, ce qui permet par exemple d’identifier des RNA ayant subi des
épissages alternatifs.


                          b. Exemples

L’étude en Northern Blot d’un ARN donné chez 3 individus donne les résultats suivants :

              1       2        3


 2,8kb                                  Individu 1 : peut être hétérozygote pour un défaut d’épissage, une
                                        délétion…
 2kb                                    Individu 2 : peut être homozygote pour une délétion de tout le gène.
                                        Ce résultat peut aussi être dû à une erreur technique.
 1,2kb                                  Individu 3 : peut être homozygote pour un défaut d’épissage ou une
                                        délétion




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2. Cartographie à la nucléase S1 ou à la RNase A


  Rappel : La nucléase S1 clive seulement l’ADN ou l’ARN simple brin.
             La RNase A n’agit que sur l’ARN simple brin.
  Cette méthode sert à repérer les mésappariements entre un mRNA et une sonde d’ADN génomique (on
  utilisera alors la nucléase S1) ou une ribosonde (RNase A).

                               Gel d’électrophorèse
                       -


       Sonde marquée
                                                                                 Nucléase S1 ou
Nucléase S1                                                                      RNase A
ou RNase A



                       +




  La nucléase S1 permet de cliver des mésappariements de plus de 3 bases.
  La RNase A permet de cliver les mésappariements de 1 base ou plus.



                  3. RT-PCR

                           a. Méthode

  C’est une PCR précédée d’une rétrotranscription.
  C’est une technique sensible qui permet d’amplifier suivants les amorces choisies tel ou tel ARN sous
  forme de cDNA.
  Elle a notamment démontré le phénomène de transcription illégitime, c'est-à-dire que dans chaque cellule
  tous les gènes sont transcrits mais en plus ou moins grande quantité selon la différenciation de la cellule.


                           b. Remarques

  Penser que les cDNA sont exempts d’introns.
  Les modifications de taille des cDNA peuvent être dus à des épissages alternatifs ou à des mutations
  entraînant des défauts d’épissage (conservation d’introns ou excision d’exons),…
  L’absence de résultat peut être dû à une mutation dans la région d’appariement des amorces ou à une
  erreur technique.




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II.     Analyse quantitative des ARN

                        Dot Blot

                             On dépose des ARN issu de cellules sur une membrane et on hybride avec une
                             sonde permettant de voir ce que l’on cherche.
                             On compare ensuite l’intensité du signal obtenu avec l’intensité du signal
                             obtenu par la gamme étalon, ce qui permet d’avoir une analyse quantitative.


       III.    Analyse de la transcription

                             = analyse de l’activité transcriptionnelle d’un gène donné
      Pour cela on poursuit dans le tube à essai la transcription qui se produit dans une cellule vivante
= RUN ON.
      L’activité transcriptionnelle d’un gène donné est proportionnelle à la quantité de RNA
polymérases fixées sur ce gène et au nombre de mRNA produits


       IV.     Analyse des mécanismes de régulation des gènes

        Cette régulation passe par la présence de protéines qui se fixent sur l’ADN : facteurs de
régulation, facteurs de transcription…

               1. Foot printing

       On part du principe que ces différentes protéines régulatrices fixées sur l’ADN vont protéger ce
dernier de l’action des nucléases.
       Pour visualiser cette interaction il faut marquer l’ADN en 5’ grâce à la polynucléotide kinase.
       La DNase I clive ces molécules n’importe où (ADN non protégé) et va donc cliver en dehors des
régions occupées par les protéines.
       C’est une technique précise qui fait en quelque sorte l’empreinte de la protéine et définit ainsi le
siège de l’interaction ADN/protéine.


               2. Retardement sur gel ou gel shift

                         a. Méthode

        Permet de déterminer la spécificité de liaison d’un facteur de transcription (FT) à une séquence
donnée d’ADN.
        Pour cela on synthétise cette séquence (oligonucléotide=ON), on la marque et on l’incube avec
des extraits nucléaires. On fait migrer ce complexe et on étudie sa spécificité grâce à des compétiteurs
spécifiques ou non (séquence hétérologue dIdC par exemple).
        On peut aussi faire un supersshift, c'est-à-dire que l’on met l’oligonucléotide en présence du FT
avec des anticorps anti-FT : ce complexe va alors être encore plus retardé.




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b. Exemples

       1ère étape : synthèse et marquage de l’oligonucléotide au 32P (radioactif) puis électrophorèse.
L’ON marqué va migrer en fonction de sa taille et de sa charge vers l’anode (apparition d’une bande).
Puis on met cet ON en présence d’une solution de protéines :
       - si fixation protéique : 1 bande + 1 bande retardée qui a migré moins loin car plus lourde
            (formation de complexes ON-protéines)
       - si pas de fixation protéique : 1 seule bande comme le témoin

       La 2ème étape consiste à savoir si cette liaison est spécifique. Pour cela on ajoute un compétiteur
(de séquence très différente de l’ON) :       - si la liaison est non spécifique, une partie de la bande
retardée                                      disparaîtra.
                                              - si la liaison est spécifique, la bande restera inchangée en
                                              présence d’un compétiteur de séquence très différente alors
                                              qu’elle aura tendance à disparaître en présence d’une grande
                                              quantité de l’ON non marqué.




2 : ON marqué + solution protéique => Retard donc fixation
3 : ON marqué + solution protéique + compétiteur de séquence différente => pas de changement =>
liaison spécifique
4 : ON marqué + solution protéique + compétiteur de séquence différente => diminution du signal de la
bande retardée => liaison non spécifique
5 : ON marqué + solution protéique + ON non marqué en grande quantité => diminution du signal de la
bande retardée => liaison spécifique




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Analyse génotypique
   I-        Pathologies de l’ADN : héréditaires (maladies génétiques) ou acquises (cancers, maladies
             infectieuses ou parasitaires).
   II-       Pour toute analyse génotypique il faut : une séquence connue ou une sonde adéquate
   III-      2 types de diagnostics génotypiques : DIRECT (on connaît le gène ou le locus affecté par la
             pathologie) ou INDIRECT (plus complexe, il utilise des méthodes dites indirectes pour
             préciser le risque chez un individu d’être atteint ou non, sans connaître la séquence impliquée).
   IV-       Rappel : règles de généalogie :




                - Stratégies diagnostiques

          1. Le diagnostic génotypique direct (DGD)

Il passe par la recherche de sites polymorphes associés à la maladie.

Plusieurs techniques peuvent être utilisées suivant la nature des lésions :

   I-       Lésions grossières (inversion, fusion, translocation, délétion,…) : Southern ou PCR
        Par exemple pour les délétions on va avoir une diminution de taille du fragment ou une absence de
signal. Mais attention, une absence de signal complète est difficile à interpréter car elle peut signifier une
délétion totale ou erreur technique. Donc on étudie aussi l’expression d’un gène domestique (si absence
de signal => erreur technique).
        Aujourd’hui on remplace le Southern par la PCR : on amplifie ainsi la région que l’on veut. Si
l’amorce est dans la région délétée, on n’aura pas d’amplification de l’ADN et donc pas de signal.


   V-        Mutations ponctuelles :

1. Carte de restriction
      Mutation entraînant la création ou l’abolition d’un site de restriction pour une enzyme donnée.


         - Hybridation spécifique d’allèle (ASO= oligosonde spécifique d’allèle)
     Elle met en évidence une mutation particulière.
     On synthétise et on marque une sonde « normale » et une sonde « mutée » que l’on pose sur une
membrane puis on met chaque sonde avec l’ADN du patient.




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ASO normal =                                 N = normal, M = muté


ASO muté =

                 N/N    N/M    M/M



Exemple :



                                         Le patient 1 est hétérozygote pour la mutation étudiée.
                                         Le patient 2 peut être homozygote (muté) ou bien hétérozygote
                                         muté/délété.
                                         Le patient 3 est soit homozygote pour la délétion de la région étudiée
                                         ou il y a eu une erreur technique.
                                         Le patient 4 est soit homozygote normal ou hétérozygote
                                         normal/délété (pour Levade, on parle d'homozygote pour un
                                         individu malade seulement)

La présence d’une mutation n’implique pas que l’individu soit porteur d’une maladie.
A l’inverse l’individu avec un ASO normal n’est pas forcément sain !


            - PCR
Elle peut être suivie d’une digestion enzymatique de restriction ou d’un ASO.

Exemple :


                       EXON 4 (250 pb)


                                            Amorces de PCR



Une mutation ponctuelle dans cet exon introduit un site pour l’enzyme de restriction Hind III.
Une électrophorèse est réalisée après PCR de cette région génique sur l’ADN de plusieurs sujets puis
incubation avec Hind III (digestion complète). Puis coloration au bromure d’éthidium.
Résultats :

         1       2        3


                                          On peut dire que :
250pb                                     - le sujet 1 est hétérozygote N/M
                                          - le sujet 2 est homozygote N/N ou hétérozygote N/D
                                          - le sujet 3 est homozygote M/M ou hétérozygote M/D
150pb

                                          N = non muté (pour la mutation étudiée)
100pb                                     M = muté
                                          D = délété pour toute la région étudiée




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Rq :
        L’apparition de bandes de faible intensité correspond à des amplifications parasites : les amorces
se sont hybridées sur des zones du génomes dont elles ne sont pas tout à fait complémentaires. Pour éviter
cela on peut modifier les conditions de stringence (augmentation température par exemple).
        Attention aussi à d’éventuelles contaminations par un fragment d’ADN étranger qui peut fausser
les résultats. (peut être mis en évidence par la réalisation d’un « tube blanc »)


   VI-      Détection d’une mutation inconnue

          1. Séquençage : le plus souvent on séquence le cDNA car il est plus court.

          2. Méthode à la RNase A (détecte des mutations ponctuelles ≠ nucléase S1)

          3. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

       Dans cette méthode on part du principe que la présence d’une mutation ponctuelle dans une
séquence donnée peut modifier la température de fusion (Tm) du domaine muté.
       On met donc l’ADN double brin sur un gel électrophorétique avec une concentration croissante de
gel dénaturant : la séparation des brins va ralentir leur progression, on considère qu’elle est stoppée.
ATTENTION : une mutation n’entraîne pas forcément de différence de migration !


                 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

       Pour cette méthode on considère qu’une mutation du DNA génomique peut entraîner une
modification de la conformation des brins séparés.
       Pour le mettre en évidence on marque les extrémités grâce à la polynucléotide kinase, on dénature
les doubles brins puis on les refroidit brutalement pour qu’ils restent physiquement séparés.
       Sur l’électrophorèse des conformations différentes vont entraîner des migrations différentes.

ATTENTION : - Il n’y a pas d’agent dénaturant sur le gel électrophorétique.
                 - Cette différence de migration est possible mais pas systématique
                 - S’il y a une différence, c’est qu’il existe une mutation : pour savoir de quelle nature est
cette mutation il faut faire un séquençage.
                 - Une mutation n’entraîne pas forcément de différence de conformation.

Rq : ces deux méthodes DGGE et SSCP peuvent permettre de mettre en évidence la présence d’une
mutation mais ne renseignent pas sur la nature de cette mutation.


         2. Diagnostic génotypique indirect

            1. Méthode

RFLP = Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction = variations interindividuelles de
séquences, révélées par des modifications de la carte de restriction.

        Ces variations sont souvent dans des régions non codantes (intergéniques, régulatrices, introns,…)
et n’ont pas de rôle pathologique en elles-mêmes.
        On étudie alors l’abolition ou la création de sites de restriction et la probabilité de leur association
avec une pathologie donnée.

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Cette méthode nécessite des sites de restriction polymorphes et l’étude d’un grand nombre
membres d’une famille où les personnes atteintes ont le même polymorphisme.
        Le diagnostic sera d’autant plus fiable que le site de restriction est proche du locus impliqué dans
la maladie (car cela diminue le risque de recombinaison).
        Lorsque l’on analyse des polymorphismes intra ou juxta-géniques, on parle de diagnostic semi-
direct, et lorsque les marqueurs sont extra-géniques, on parle de diagnostic indirect.

ATTENTION : Ce sont des diagnostics probabilistes, il n’y a pas de certitudes absolues !

           2. Exemples

   Exemple 1 :


                                        Diagnostic prénatal par RFLP pour une maladie autosomale
                                        récessive (avec utilisation d’une sonde et d’une enzyme de
                                        restriction donnée) : pour chaque individu on donne la taille des
                                        fragments sur chaque allèle.




Le fœtus aura un allèle de chacun de ses parents soit :
    600/500 ou 800/500 ou 800/700 ou 600/700.

Les parents sont hétérozygotes pour la maladie.
Au vu des résultats, la maladie semble provoquée par l’association des fragments 700 et 800.


   Exemple 2 :
   Un test de diagnostic prénatal est basé sur l’analyse d’un RFLP pour une maladie autosomale
   récessive.




Les résultats de la famille A ne peuvent pas être interprétés car on ne connaît pas le profil de l’enfant
décédé.
Pour la famille B, le fœtus pourra être 3-3 et sera probablement porteur de la maladie,
                                        3-1 donc hétérozygote et indemne
                                       1-1 donc homozygote indemne
Pour la famille C, pas de prédiction possible car les régions étudiées ne semblent pas être en rapport
avec l’état malade ou non.




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III QCM d’entraînement

               -   GENERALITES SUR LES PROTEINES
               -   NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES
               -   ADN
               -   REPLICATION
               -   ELEMENTS GENETIQUES MOBILES
               -   STRUCTURES DES GENES
               -   ARN ET TRANSCRIPTION
               -   TRADUCTION
               -   MUTATIONS ET MUTATIONS
                   HEMOGLOBINE
               -   ANTIBIOTIQUES ET ANTIMETABOLITES
               -   TECHNIQUES GENERALES – OUTILS
                   ENZYMATIQUES
               -   HYBRIDATION MOLECULAIRES ET SONDES
               -   PCR
               -   SOUTHERN ET CARTOGRAPHIE RNASE
               -   SEQUENCAGE (SANGER)
               -   ANALYSE DE L’EXPRESSION DES GENES
               -   ANALYSE GENOTYPIQUE
               -   VECTEURS ET CLONAGE
               -   ANIMAUX TRANSGENIQUES
               -   TECHNIQUES EN VRAC



     Avec la participation de l'équipe de Biologie Moléculaire 2006-2007 et
                  relecture des tuteurs 2009-2010 et 2010-2011



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GENERALITES SUR LES PROTEINES
                                                44 QCM
QCM 1 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A/ Le génome représente l’ensemble de l’ADN nucléaire
B/ Les « séquences poubelles » entre les différents gènes n’ont aucun rôle
C/ Un gène codant pour une protéine, il y a autant de protéines que de gènes
D/ Le génome nucléaire humain comprend entre 30 000 et 50 000 gènes
E/ Le génome des cellules de notre foie est différent avant et après le réveillon

QCM 2 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ Glu B/ Asp C/ Leu D/ Gly E/ Pro
Le(s)quel(s) vous attendez-vous à trouver à l’intérieur d’une protéine ?

QCM 3 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ Gln B/ His C/ Lys D/ Asp E/ Pro
Le(s)quel(s) est (sont) acide(s) ?

QCM 4 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ Asp B/ Arg C/ Val D/ Leu E/ Met
Le(s)quel(s) est (sont) retenu(s) par un tampon à pH 2 lors d’une chromatographie échangeuse de
cations ?

QCM 5 : Les acides aminés :
A/ Sont au nombre de 20 dont un est en fait un acide iminé (le tryptophane)
B/ Certains sont hydrophobes (apolaires) et d’autres hydrophiles (polaires)
C/ Les acides aminés apolaires peuvent être acides, neutres ou basiques au pH physiologique
D/ Portent leur radical sur le carbone α (alpha)
E/ Ont tous une seule fonction amine (NH2) et une seule fonction acide (COOH)

QCM 6 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ Glu B/ Arg C/ Val D/ Ser E/ Asn
Le(s)quel(s) est (sont) chargé(s) au pH physiologique ?

QCM 7 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ His B/ Tyr C/ Asp D/ Met E/ Leu
Le(s)quel(s) est (sont) polaire(s) ?

QCM 8 : Parmi les acide aminés suivants :
A/ Thr B/ Gln C/ Ala D/ Trp E/ Glu
Le(s)quel(s) est (sont) apolaire(s) ?

QCM 9 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ His B/ Gly C/ Ser D/ Cys E/ Asp
Le(s)quel(s) est (sont) élué(s) par un tampon à pH 10 lors d’une chromatographie échangeuse de cations ?

QCM 10 : A propos des acides aminés :
A/ Ils sont classés en différentes catégories selon leur capacité à interagir avec l’eau
B/ La proline induit un coude dans les protéines qui la contiennent
C/ Le radical de la glycine correspond à un atome d’hydrogène
D/ Il y a plus d’acides aminés apolaires différents que d’acides aminés polaires neutres différents
E/ La cystéine possède un atome de soufre

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QCM 11 : Les protéines :
A/ Sont formées par combinaison linéaire d’acides aminés
B/ Une molécule d’eau est éliminée lors de la formation de la liaison peptidique
C/ Sont des enchaînements de plus de 100 acides aminés et de poids moléculaire (PM) supérieur à 10 000
sinon on aurait appelé ces enchaînements des polypeptides
D/ Ont toutes une structure quaternaire
E/ Possèdent un potentiel informationnel considérable

QCM 12 : Structure des polypeptides/protéines :
A/ Un polypeptide de 10 acides aminés peut prendre 100 structures primaires différentes (10²) selon les
acides aminés qui le composent
B/ La structure secondo-tertiaire correspond à la structure spatiale de la protéine
C/ La structure secondaire correspond à la géométrie dans l’espace des liaisons peptidiques
D/ La structure tertiaire correspond au positionnement dans l’espace des radicaux de chaque acide aminé
E/ Ces repliements sont nécessaires au fonctionnement normal de la protéine

QCM 13 : Electrophorèse :
On réalise une électrophorèse à pH 7,5 d’un mélange d’acide aspartique, de lysine et de proline. Quelle
sera la migration obtenue ?
A/ (pole -) Asp, Pro, Lys (pole +)          B/ (pole -) Pro, Lys, Asp (pole +)
C/ (pole -) Lys, Pro, Asp (pole +)          D/ (pole -) Asp, Lys, Pro (pole +)
E/ (pole -) Lys, Asp, Pro (pole +)

QCM 14 : Classification des protéines :
A/ Les holoprotéines comprennent l’apoprotéine et un groupement prosthétique
B/ On classe les protéines selon leur forme en albumines et globulines
C/ Leurs fonctions sont extrêmement variées : structure, récepteur, catalytique, transport, régulation…
D/ Les protéines globulaires ont un rôle de soutien, de protection
E/ Ces différences de propriétés entre les protéines sont exploitées en biologie moléculaire afin de les
séparer par diverses techniques (chromatographie, centrifugation, électrophorèse…)

QCM 15 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A/ Les acides nucléiques sont solubles dans le phénol
B/ Chloroforme et éther à volume équivalent (1/1, v/v) servent à extraire le phénol
C/ L’isopropanol permet l’extraction du bromure d’éthidium
D/ Les acides nucléiques sont précipités dans les solutions aqueuses salées à faible concentration
E/ Les protéines sont solubles dans les solvants organiques

QCM 16 : Chromatographie d’exclusion-diffusion (gel filtration) :
A/ La séparation repose sur la taille et le poids moléculaire (PM) des molécules
B/ Si on verse un mélange de protéines et de polypeptides ce sont les protéines qui sont le plus retenues
car ce sont des molécules plus grosses donc leur passage à travers le gel est plus difficile
C/ Pour que les premières molécules commencent à sortir il faut verser un volume supérieur au volume de
la colonne (dit « volume mort »)
D/ Si on doit se placer dans des conditions expérimentales qui empêchent l’agrégation des molécules en
complexe c’est justement car cette technique se base sur la taille des molécules et que celle-ci s’en
trouverait modifiée
E/ Cette méthode permet de calculer la taille et le poids moléculaire des protéines si le dispositif est
correctement étalonné




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QCM 17 : Les protéines :
A/ Ont un sens conventionnel d’orientation : l’extrémité N-terminale à gauche et l’extrémité C-terminale
à droite
B/ Présentent un pic d’absorption maximal à 280 nm
C/ Sont issues de l’expression des gènes après transcription et réplication
D/ Ont plus de chance de perdre leur fonction si la mutation qui se produit est la substitution d’un acide
aminé polaire par un acide aminé apolaire que s’il s’agit d’une substitution par un autre acide aminé
polaire
E/ Les albumines sont modérément solubles dans l’eau mais solubles dans les solutions salines

QCM 18 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ Glu B/ Asn C/ Lys D/ Pro E/ Phe
Lesquels sont élués les premiers par un tampon à pH 5 lors d’une chromatographie échangeuse d’anions ?

QCM 19 : Electrophorèse :
On réalise une électrophorèse à pH 4 d’un mélange d’acide glutamique, d’histidine et de serine. Quelle
sera la migration obtenue ?
A/ (pole -) Glu, Ser, His (pole +)         B/ (pole -) Ser, Glu, His (pole +)
C/ (pole -) His, Glu, Ser (pole +)         D/ (pole -) Glu, His, Ser (pole +)
E/ (pole -) His, Ser, Glu (pole +)

QCM 20 : Densité optique (DO) :
A/ Les protéines présentent un pic d’absorption maximal à 280 nm
B/ Pour une quantité donnée d’ADN en solution, la DO à 280 nm du double brin est inférieure à celle du
simple brin
C/ La recherche de contamination des acides nucléiques par des protéines s’effectue en mesurant le
rapport DO à 280 nm sur DO à 260 nm ; pour être optimal il doit être de l’ordre de 1,8 – 2
D/ Le phénol présente un pic d’absorption maximal à 260 et 280 nm
E/ La mesure de la densité optique à 260 nm d’une solution d’ADN permet d’évaluer sa concentration

QCM 21 : Parmi les acides aminés suivants :
A/ Ala B/ Tyr C/ His D/ Arg E/ Asp
Lesquels sont élués par un tampon à pH 1 lors d’une chromatographie échangeuse d’anions ?

QCM 22 : Chromatographie de partage sur papier :
A/ La migration (représentée par le Rf) plus ou moins rapide des substances est fonction de l’affinité de
ces substances pour les solvants
B/ Nous avons dans cette technique 2 phases non miscibles : une solide (fixée) et une liquide (mobile)
C/ La migration peut se faire par capillarité (chromatographie ascendante) ou par gravité
(chromatographie descendante)
D/ On peut identifier les éléments séparés en effectuant une pulvérisation de colorants adapté ou une
auto-radiographie par exemple
E/ Le Rf est caractéristique de certaines substances

QCM 23 : Electrophorèse :
On réalise une électrophorèse à pH 10 d’un mélange de tyrosine, d’acide aspartique et d’arginine. Quelle
sera la migration obtenue ?
A/ (pole +) Asp, Arg, Tyr (pole -)          B/ (pole +) Asp, Tyr, Arg (pole -)
C/ (pole +) Arg, Tyr, Asp (pole -)          D/ (pole +) Arg, Asp, Tyr (pole -)
E/ (pole +) Tyr, Asp, Arg (pole -)




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QCM 24 : Calcul de rendement :
Après une étape de broyage d’un extrait brut de cerveau de bœuf (à l’aide d’un appareil de Potter) le
rendement est de 80%, on effectue une ultracentrifugation à l’issue de laquelle le rendement est de 60%,
puis une séparation chromatographique difficile (rendement de 50%). Si dans l’extrait brut on avait au
départ 200 mg de protéines nous obtiendrons au final :
A/ 96 mg de protéines      B/ 160 mg de protéines        C/ 48 mg de protéines
D/ 25 mg de protéines      E/ 0,048 g de protéines

QCM 25 : Calcul de rendement :
Après le broyage d’un extrait brut de foie de rat à l’aide d’un appareil de Potter dont le rendement est de
90%, on effectue une première centrifugation à l’issue de laquelle la perte est de 10% puis une
ultracentrifugation au rendement de 50%, une séparation chromatographique dont le rendement est de
80% est effectuée, puis enfin une dernière technique où la perte de rendement est de 20%. En cours
d’expérimentation la température a entraîné, à la suite d’une légère modification de la configuration, une
perte de l’activité biologique d’environ 65%. Si dans l’extrait brut il y avait au départ 600 mg de
protéines, nous obtiendrons à l’issue de l’ultracentrifugation :
A/ 155,52 mg de protéines       B/ 486 mg de protéines       C/ 150 mg de protéines
D/ 390 mg de protéines          E/ 243 mg de protéines

QCM 26 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. La glycine est le plus petit acide aminé.
B. Il n’existe pas d’acide aminé apolaire cyclique.
C. Une protéine est un enchaînement d’acides aminés (plus de 100) liés par des liaisons peptidiques.
D. Si on a une séquence de 10 acides aminés, il existe 2010 possibilités de protéines, d’où la notion
d’immense potentiel informationnel des protéines.
E. Les acides aminés polaires comme la Leucine (Leu) sont généralement retrouvés à l’extérieur de la
protéine.

QCM 27 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. Toutes les protéines n’ont pas une structure quaternaire.
B. L’hémoglobine humaine est une structure volumineuse comprenant 4 chaînes associées dont chacune
est liée à un hème qui comprend 1 atome de Mg.
C. La structure secondaire résulte de la géométrie dans l’espace des liaisons peptidiques et des radicaux.
D. Les ponts disulfures entre deux Lysines (Lys) stabilisent la molécule.
E. La myoglobine comme l’hémoglobine sont des protéines héminiques.

QCM 28 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. Les protéines ont généralement plus de 100 acides aminés dans leur composition donc un poids
moléculaire supérieur à 100.
B. L’Asparagine (Asn) est un acide aminé polaire acide.
C. Un acide aminé a une fonction amine (NH2 ) et acide (COOH) sur le carbone β.
D. Les acides aminés apolaires interagissent peu avec l’eau au pH physiologique et sont donc
généralement retrouvés à l’extérieur des protéines.
E. La Lysine (Lys) est un acide aminé polaire basique.

QCM 29 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. Les gènes, dont le nombre est estimé entre 30 000 et 50 000, codent pour autant d’ARNm.
B. Le plus petit des acides aminés appartient à la familles des acides aminés apolaires qui ont peu
tendance à interagir avec l’eau au pH physiologique.
C. Depuis 2001, le programme génome humain a permis d’identifier tous les gènes ainsi que leur
fonction.
D. Le Fer et le Zinc entrent dans la structure respectivement de l’insuline et de l’hémoglobine.
E. La molécule d’ADN est constituée d’une continuité de séquences codantes.
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QCM 30 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. 7,42 est la valeur de référence du pH physiologique de l’estomac.
B. La Proline est un imino-acide qui peut entraîner une coudure des séquences d’acides aminés.
C. C’est l’atome de soufre de la Méthionine qui forme des pont disulfures.
D. La Sérine, la Glycine et la Thréonine sont des acides aminés polaires neutres.
E. La structure quaternaire de la myoglobine correspond à la juxtaposition de plusieurs sous-unités
protéiques.

QCM 31 : Parmi les acides aminés suivants, le(s)quel(s) est (sont) hydrophobe(s) ?
A. Ser      B. Trp        C. Thr       D. Ile          E. Lys

QCM 32 : A propos de la chromatographie sur résine échangeuse d’ions :
A. Elle sépare les produits en fonction du poids moléculaire.
B. Les échangeuses de cations retiennent les molécules chargées négativement.
C. Sur les échangeuses d’anions, les molécules éluées sont celles qui sont chargées +.
D. Elle permet de séparer les molécules en fonction de leur pHi.
E. Le support d’une échangeuse d’anion est faite de carboxyméthyl cellulose.

QCM 33 : A propos des techniques en général :
A. La chromatographie d’affinité joue sur les interactions spécifiques entre 2 molécules comme
antigène/anticorps par exemple.
B. Les méthodes de chromatographie peuvent avoir un but analytique ou préparatif.
C. Le résultat d’une chromatographie d’adsorption peut être visualisé grâce à des produits radioactifs.
D. Quelle que soit la technique utilisée les notions de rendement et de dénaturation sont intimement liées.
E. La chromatographie hydrophobe joue sur le caractère polaire ou apolaire des produits.

QCM 34 : Concernant la chromatographie par élution ou de partage sur papier :
A. Les 2 phases en présence sont liquides et miscibles.
B. Elle peut être ascendante ou descendante.
C. Le rapport frontal (Rf) est caractéristique du produit analysé.
D. Elle se fait par transfert d’une substance d’une phase liquide (mobile) vers une phase liquide (fixe).
E. Elle sépare les produits en fonction de leur charge.

QCM 35 : Concernant la chromatographie d’exclusion-diffusion :
A. Elle sépare les produits en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire.
B. Les premières molécules sont récupérées dans le volume mort.
C. Le volume d’élution est inversement proportionnel à la taille de la molécule.
D. Avec un mélange de protéines et de peptides, les protéines sortent en premier.
E. Avec un mélange de protéines et de peptides, les peptides sortent en premier.

QCM 36 : On réalise une gel-filtration d’un mélange de protéines et de peptides :
P1(PM=5 000), P2 (PM=390 000), P3 (PM=24 000), P4 (PM=100 000), P5 (PM=86 000).
Quel sera l’ordre d’élution (en commençant par le premier sorti de la colonne) ?
A. 1,3,5,4,2
B. 2,4,3,5,1
C. 1,5,3,4,2
D. 2,4,5,3,1
E. 1,2,3,4,5




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QCM 37 : On réalise une électrophorèse à pH 3 d’un mélange d’arginine, d’acide aspartique et
d’asparagine. Quelle sera la migration obtenue en partant de l’anode vers la cathode ?
A. Arg, Asn, Asp
B. Asp, Arg, Asn
C. Asp, Asn, Arg
D. Asn, Asp, Arg
E. Arg, Asp, Asn

QCM 38 : Au sujet de la densité optique:
A. Les protéines absorbent à une DO de 270 nm.
B. Les bases puriques absorbent à 260 nm.
C. Les bases pyrimidiques absorbent à 280 nm.
D. Une unité de DO à 260 nm d’ARN correspond à 40 μg/mL.
E. La recherche de contamination des acides nucléiques par des protéines peut s’effectuer en mesurant le
rapport DO à 260 nm sur DO à 280 nm.

QCM 39 : Au sujet des techniques d’extraction :
A. Le phénol permet l’extraction des acides nucléiques en précipitant les protéines.
B. Suite à l’extraction au phénol, les acides nucléiques se retrouvent dans la phase aqueuse c’est-à-dire la
phase inférieure.
C. Le chloroforme permet l’extraction du bromure d’éthidium.
D. L’isopropanol permet la précipitation des acides nucléiques.
E. Le phénol est extrait par un mélange de chloroforme-éther à volume équivalent.

QCM 40 : Après une étape de broyage de foie de souris à l’aide d’un appareil de Potter dont le
rendement est de 80%, on effectue une centrifugation dont la moitié de la préparation est éliminée.
Ensuite, on effectue une ultracentrifugation pour laquelle le rendement est de 70%. Enfin, on
réalise une électrophorèse dont le rendement est de 50%. Si dans l’extrait final, on obtient 70 mg de
protéines, combien avions-nous de protéines en mg dans l’extrait initial ?
A. 350 mg de protéines
B. 980 mg de protéines
C. Environ 10 mg de protéines
D. 500 mg de protéines
E. 380 mg de protéines

QCM 41 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. Les protéines ont des propriétés variées : physiques, chimiques, antigéniques…
B. Des anticorps peuvent être dirigés contre certains motifs antigéniques de la protéine que l’on appelle
paratopes.
C. Deux protéines différentes ne peuvent pas posséder un même motif antigénique.
D. Les holoprotéines sont composées de 96% à 100% d’acides amines.
E. Les hétéroprotéines sont composées d’une partie protéique appelée apoprotéine qui ne contient que des
acides aminés, et d’une partie non protéique appelée groupement prosthétique qui n’est composée que de
traces de métaux.

QCM 42 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. Les albumines et les globulines sont solubles dans les solutions salines.
B. Les protéines globulaires, telles les immunoglobulines, ont leur rapport D/d supérieur à 10.
C. La fraction sub-cellulaire contenant les protéines à étudier peut être isolée par des produits comme le
Triton X100 ou le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate).
D. La dialyse/filtration utilise des membranes semi-perméables.
E. La lyophilisation, aussi appelée « déshydratation à froid », permet de concentrer et de conserver les
protéines.
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QCM 43 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. Le phénol entraîne la précipitation des protéines tandis que les acides nucléiques se retrouvent dans la
partie supérieure non-soluble.
B. Le phénol est ensuite extrait par du chloroforme ou par un mélange chloroforme/éther.
C. Le bromure d’éthidium est extrait par l’isopropanol.
D. Les acides nucléiques précipitent en présence d’alcool éthylique (à force ionique élevée) ou
d’isobutanol.
E. Le sel pouvant être néfaste à la suite de l’expérimentation, on utilise plutôt l’isobutanol pour précipiter
les acides nucléiques.

QCM 44 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?
A. Le collagène est un exemple de protéine fibrillaire.
B. Les lipoprotéines peuvent être séparées par ultracentrifugation ou par séparation électrique.
C. La purification des protéines ne nécessite pas l’observance de conduites opératoires strictes.
D. L’utilisation de solutions salines à différentes concentrations n’ayant aucune utilité pour séparer ou
isoler des protéines ou des acides nucléiques, on utilise préférentiellement des solvants sans sel.
E. Une unité de densité optique à 260 nm peut correspondre à du DNA double brin ayant une
concentration de 50 μg/ml.




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Correction
QCM 1 : D
A/ ADN nucléaire + ADN mitochondrial
B/ Au moins un rôle dans la régulation
C/ Beaucoup plus de protéines que de gènes. En effet un même gène peut donner des ARNm différents et
des protéines différentes selon le type cellulaire et le temps [modifications post-transcriptionnelles (ex :
épissage alternatif ou phénomène d’édition) et post-traductionnelles].
E/ Le génome est le même dans toutes les cellules nucléées de l’organisme ! Par contre ces gènes ne sont
pas exprimés de la même façon selon le type cellulaire ou le temps donc c’est le protéome des cellules qui
diffère selon le type cellulaire et le temps.

QCM 2 : CDE

QCM 3 : D

QCM 4 : BCDE
A pH 2 Asp est neutre, Val, Leu et Met sont chargés positivement et Arg est chargé très positivement.
Val, Leu, Met et Arg sont ici des cations donc seront retenus dans ce type de colonne.
Attention parfois le pHi (pH auquel la charge électrique globale est nulle) de chaque acide-aminé est
précisé ! Dans ce cas là il faudra être précis : tous les acides aminés dont le pHi sera supérieur au pH de la
solution seront chargés positivement et tous les acides aminés dont le pHi sera inférieur seront chargés
négativement, pour être neutre l’acide aminé devra avoir son pHi égal au pH de la solution, tout cela
pourrait changer certaines réponses…

QCM 5 : BD
A/ L’acide iminé ou imino-acide est la proline
C/ Ce sont les acides aminés polaires qui sont acides, neutres ou basiques. Les apolaires sont tous neutres
au pH physiologique.
E/ Non car ils peuvent avoir d’autres fonctions amines ou acides dans leur radical. Toutefois ils ont tous
au moins une fonction amine et une fonction acide sauf la proline qui est un imino-acide [une fonction
imine (NH) et une fonction acide].

QCM 6 : AB
Glu est acide, Arg est basique, les autres sont neutres.

QCM 7 : ABC

QCM 8 : CD

QCM 9 : BCDE
A pH 10 His est neutre, les autres (Gly, Ser, Cys, Asp) sont chargés négativement. Ces derniers sont donc
des anions et ne seront pas retenus dans une chromatographie échangeuse de cations, ils seront élués.
Notez que si on nous avait demandé lesquels étaient élués en premiers il aurait fallu répondre Asp
seulement car en tant qu’acide aminé normalement acide Asp est ici chargé très négativement comparé à
Gly, Ser et Cys.

QCM 10 : ABCDE
D/ Vrai : 9 apolaires et 6 polaires neutres



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QCM 11 : ABCE
A/ Oui, il n’y a jamais de ramifications d’acides aminés !
D/ Non, les protéines qui ont une structure quaternaire sont celles composées de plusieurs sous-unités
(plusieurs enchaînements polypeptidiques).

QCM 12 : BCDE
A/ 20 puissance 10 soit 10 240 000 000 000 possibilités différents !!!!! Imaginez alors pour des protéines
de plusieurs milliers d’acides aminés…⇒ potentiel informationnel énoooorme !

QCM 13 : C
Aucune difficulté dans ce genre d’exercice, les professeurs proposant normalement toujours 1 acide
aminé acide, 1 basique et 1 neutre. Du coup la mention du pH dans l’énoncé n’a aucune importance.
L’acide aminé acide (anion) va toujours vers le pôle + (anode), l’acide aminé basique (cation) va toujours
vers le pôle – (cathode) et l’acide aminé neutre se trouve entre les deux autres.

QCM 14 : CE
A/ Ce sont les hétéroprotéines
B/ « Albumines » et « globulines » sont des termes qui correspondraient à une classification selon la
solubilité des protéines ! Selon la forme ⇒ « globulaires » ou « fibrillaires ». Attention à ne pas
confondre globulines et globulaires !!
D/ Non les protéines globulaires ont plutôt un rôle biologique. Ce sont les protéines fibrillaires (ex : le
collagène) qui ont un rôle de protection, de soutien.

QCM 15 : BE
Pour répondre à ce genre de questions sans problème il serait bienvenue de retenir parfaitement
l’expérience de « l’extraction phénolique des acides nucléiques » !
A/ Les acides nucléiques sont solubles dans l’eau pure ou dans les solutions aqueuses salées à faible
concentration
B/ Le phénol peut aussi être extrait par le chloroforme seul
C/ L’isoPRopanol permet la PRécipitation des acides nucléiques (pas besoin de sels contrairement à
l’éthanol). C’est l’isoButanol qui permet d’extraire le Bromure d’éthidium.
D/ Les acides nucléiques sont précipités par l’isopropanol ou par le mélange éthanol + sels
E/ Les protéines sont solubles dans les solvants organiques comme le phénol (+++), le chloroforme ou
l’éther et plus ou moins solubles dans l’eau (cf. albumines et globulines). Notez que des protéines sont
précipitées par les solutions aqueuses salées à forte concentration (cf. item 8-E du concours blanc de
novembre 2005).

QCM 16 : ACDE
B/ La taille supérieure des protéines fait au contraire migrer celles-ci plus vite car elles sont trop grosses
pour être accrochées par les mailles du gel
E/ Vrai car la vitesse de descente des protéines dans la colonne est directement liée à leur taille ou poids
moléculaire (PM)

QCM 17 : ABD
C/ Gène ---transcription---> ARNm ---traduction---> protéine
E/ Cette définition correspond aux globulines. Les albumines sont solubles dans l’eau et dans les
solutions salines.




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QCM 18 : C
A pH 5 seul Glu est chargé négativement (anion), les autres (Asn, Lys, Pro, Phe) sont tous chargés
positivement. S’agissant d’une chromatographie échangeuse d’anions, ce sont les anions qui seront
retenus par le gel c’est-à-dire Glu. Tous les autres seront élués ! Mais ici on demande le(s) premier(s) à
être élué et ce sera l’acide aminé chargé très positivement c’est-à-dire la Lysine qui est un acide aminé
basique alors que les autres (Asn, Pro, Phe) sont seulement neutres au pH physiologique.

QCM 19 : E

QCM 20 : AE
B/ Les acides nucléiques absorbent à 260 nm
C/ Le rapport DO à 280 nm sur DO à 260 nm correspond au rapport protéines sur acides nucléiques (AN).
S’il était de 1,8 - 2 cela signifierait qu’il y a 2 fois plus de protéines que d’AN et donc qu’il y a
contamination. Pour être optimal le rapport doit être d’environ 0,5 soit 2 fois plus d’AN que de protéines.
S’il est supérieur à 0,5 cela signifie qu’il y a contamination (trop de protéines).
Par contre si le rapport est DO à 260 nm sur DO à 280 nm, le résultat optimal est effectivement de 1,8 –
2. Si le rapport est inférieur à 1,8 cela montrerai une contamination de la solution d’AN par les protéines.
D/ 270 nm

QCM 21 : ABCDE
Ici la solution est tellement acide (pH 1) que tous les acides aminés seront chargés positivement. Ce sont
des cations et ils seront donc élués dans une chromatographie échangeuse d’anions. Notez que si on nous
avait demandé lesquels étaient élués en premiers il aurait fallu répondre His et Arg car ils sont déjà
basiques à l’origine donc encore plus chargés positivement (viennent ensuite Ala et Tyr, le dernier à être
élué serait Asp car c’est le plus faiblement chargé positivement).

QCM 22 : ACDE
B/ Les deux phases sont liquides ! Effectivement l’une est fixée et l’autre mobile et elles sont non
miscibles.

QCM 23 : B

QCM 24 : CE
Je ne vais pas vous faire l’offense de vous réapprendre les calculs de pourcentages… Sachez seulement
que pour vos calculs vous pouvez utilisez les différents pourcentages dans l’ordre que vous voulez, le
résultat final restera identique.
Toutefois il existe de nombreux pièges : calculer l’extrait final ou l’extrait de départ ? calculer l’extrait
final ou l’extrait après la 2ème ou la 3ème étape seulement ? Calculer le poids de protéines ou l’activité
biologique ? Faîtes donc bien attention à la dernière phrase notamment ! Attention aussi à l’énoncé : « à
l’issue de laquelle le rendement est de 60% » est différent de « à l’issue de laquelle la perte est de
60% » car dans le dernier cas le rendement n’est alors que de 40% !! Pour finir soyez bien vigilants sur
les unités des différentes réponses !

QCM 25 : E
600*90% = 540
540-10% = 540-54 = 486
486*50% = 243

QCM 26 : ACD
B. La Proline
E. La Leucine est apolaire



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QCM 27 : AE
B. 1 atome de Fer
C. Structure tertiaire
D. Entre 2 Cystéines

QCM 28 : E
A. PM supérieur à 10 000
B. Polaire neutre
C. Carbone α
D. A l’intérieur

QCM 29 : B
A. Plus d’ARNm
C. On ne connaît pas tous les gènes et encore moins la fonction de tous
D. L’inverse
E. Il y a des séquences poubelles non codantes

QCM 30 : B
A. pH très acide dans l’estomac
B. Vrai car structure cyclique
C. Entre 2 Cystéines
D. Pas la Glycine (apolaire)
E. Pas de structure quaternaire pour la myoglobine

QCM 31 : BD

QCM 32 : CD
A. Sépare les produits en fonction de leur charge
B. Echangeuses de cations => résine chargée – donc retient les molécules chargées +
E. Support d’une échangeuse d’anions est du DEAE cellulose

QCM 33 : ABCDE

QCM 34 : BCD
A. Les 2 phases sont liquides et non miscibles.
E. Sépare les produits en fonction de leur solubilité.

QCM 35 : ACD
B. On ne récupère rien dans le volume mort.
E. Les peptides sortent en dernier.

QCM 36 : D
Les protéines de plus gros PM sortent en premier et les plus petits peptides sortent en dernier donc :
l’ordre d’élution sera P2,P4,P5,P3,P1.

QCM 37 : C
(pôle +) Asp Asn Arg (pôle -)
pHi(Arg) >> pH donc il est le plus positif des 3 donc migrera le plus vers le pôle - c’est-à-dire la cathode.

QCM 38 : BDE
A. Les protéines absorbent à 280 nm, le phénol absorbe à 270 nm.
C. Les acides nucléiques absorbent à 260 nm que ce soient des bases puriques ou pyrimidiques.
D. L’ARN est simple brin donc 1 DO à 260 nm correspond à 40 μg/mL.
E. Contamination des Acides nucléiques / Protéines  DO [Acides nucléiques] / DO [Protéines]
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QCM 39 : ADE
B. La phase aqueuse correspond à la phase supérieure. La phase inférieure comprendra le phénol avec les
protéines.
C. Le bromure d’éthidium est extrait par l’isobutanol. Le chloroforme sert à extraire le phénol.

QCM 40 : D
Attention à ne pas lire trop vite l’énoncé. Faire attention si la quantité donnée est celle du départ, de
l’arrivée ou après une étape. Etre attentif au résultat demandé : quantité de départ, quantité d’arrivée ou
quantité après un certain nombre d’étapes. De plus, ne pas confondre 70% de rendement et le fait que
70% de la préparation est éliminé, par exemple.

Soit x, la quantité de protéines au départ.
Calcul :




       x = 500 mg de protéines

QCM 41 : AD
B. Ces motifs antigéniques sont appelés « épitopes ». Les « paratopes » sont les sites des anticorps qui
reconnaissent un épitope.
C. Deux protéines différentes peuvent avoir le même motif antigénique (épitope), ce qui aboutit à des
réactions croisées ; l’anticorps dirigé contre cet épitope reconnaîtra les deux protéines.
E. Le groupement prosthétique ne contient pas que des traces de métaux, il peut contenir d’autres
molécules comme des lipides ou des glucides par exemple. De plus, on peut trouver des traces de métaux
dans les holoprotéines (de l’ordre de 0 à 4%).

QCM 42 : ADE
B. Leur rapport D/d est inférieur à 10, ce qui explique qu’elles aient une forme plutôt globulaire.
C. Le Triton X100 et le SDS sont des détergents que l’on utilise pour solubiliser l’extrait tissulaire qui
contient les protéines que l’on désire étudier. La fraction sub-cellulaire est, elle, isolée grâce à des
centrifugations différentielles.

QCM 43 : B
A. Les acides nucléiques se retrouvent dans la phase supérieure soluble tandis que les protéines
précipitent dans la phase inférieure contenant du phénol.
C. Il est extrait par l’isobutanol.
D. En présence d’alcool éthylique (+ sels) ou d’isopropanol.
E. On utilise l’isopropanol qui précipite les acides nucléiques sans avoir besoin de sel.

QCM 44 : ABE
C. Au contraire, c’est indispensable pour une bonne purification.
D. L’utilisation de solutions salines à différentes concentrations permet une précipitation/solubilisation
différentielle des acides nucléiques par exemple. Elle peut donc être utile.




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NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES
                               43 QCM

Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants :
A/ thymidine     B/ adénosine tri-phosphate (ATP)       C/ cytosine
D/ uridine       E/ désoxyguanosine

QCM 1 : Le(s)quel(s) est (sont) un (des) nucléoside(s) ?

QCM 2 : Le(s)quel(s) contien(nen)t une liaison N-osidique entre le désoxyribose et la base
pyrimidique ?

QCM 3 : Le(s)quel(s) constitu(en)t une forme chimique de réserve d’énergie ?


Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants :
A/ désoxyadénosine      B/ cytidine         C/ uracile
D/ hypoxanthine         E/ guanosine

QCM 4 : Le(s)quel(s) a (ont) un noyau purine ?

QCM 5 : Le(s)quel(s) peu(ven)t être métabolisé(s) en acide urique ?

QCM 6 : Le(s)quel(s) est (sont) présent(s) dans les tRNA ?


Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants :
A/ inosine               B/ uridine                C/ théophylline
D/ hypoxanthine          E/ méthylcytosine

QCM 7 : Le(s)quel(s) est (sont) un (des) nucléoside(s) présent(s) dans les tRNA ?

QCM 8 : Le(s)quel(s) inhibe(nt) la cAMP-phosphodiestérase ?

QCM 9 : Le(s)quel(s) provien(nen)t de la désamination oxydative d’une adénosine ?


QCM 10 : Les antimétabolites :
A/ L’allopurinol est un analogue de l’hypoxanthine
B/ Le 5-fluoro-uracile est en compétition avec la thymine lors des biosynthèses d’ARN
C/ La 6-thiopurine (= 6-mercaptopurine) est un noyau pyrimidique qui a la particularité d’avoir un atome
de soufre
D/ Les antimétabolites sont tous utilisés pour soigner l’homme car ils dérèglent le fonctionnement des
cellules bactériennes (procaryotes)
E/ La puromycine mime la structure terminale des tRNA chargés de leur acide-aminé




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  • 1. Tutorat Associatif Toulousain Année universitaire 2010-2011 PACES UE 1 : Chimie, Organisation, évolution et fonction du génome humain. Structure, diversité et fonction des biomolécules. Organisation, évolution et fonction du génome (Biologie Moléculaire) Fiches de cours et QCM Partenaire du Tutorat Associatif Toulousain © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 1
  • 2. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 2
  • 3. ATTENTION ! Ce polycopié a été relu sur la base des cours dispensés à la faculté de Rangueil pour l'année 2009-2010. Cependant, suite à la réforme de la PACES, le programme de Biologie Moléculaire a été quelque peu modifié. Par conséquent, certains éléments présents dans ce polycopié peuvent ne plus être d'actualité. A vous de trier parmi les différentes fiches de cours et les différents items proposés ceux qui restent en accord avec les cours dispensés par mesdames et messieurs les professeurs. N'hésitez pas à signaler toutes les erreurs éventuelles ou remarques concernant ce polycopié sur tutoweb dans la rubrique « Forum polycopiés » ou lors de l'une des permanences du tutorat. En aucun cas le contenu de ce polycopié ne pourra engager la responsabilité de la faculté de médecine ou de mesdames et messieurs les professeurs. Ce polycopié a été réalisé par : Mirvat Hamdan, Nicolas Bernabeu Yohann Vergès, Claire Buirette Julie Calonge ,Marine Herman Capucine Tatin Relecture par les tuteurs des années 2010-2011 Compilé par Guillaume Gilbert © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 3
  • 4. Plan I Présentation de la biologie moléculaire page 5 II Notions de cours page 6 III QCM d’entraînement page 32 IV Correction détaillée du concours officiel de janvier 2006 page 173 V QCM supplémentaires du Tutorat 2005 - 2006 page 181 © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 4
  • 5. I Présentation de la biologie moléculaire et du polycopié La biologie est une matière qui n’est pas des plus difficiles pour le concours d’après les étudiants. Cependant, la partie qui pose généralement le plus de problème est celle qui concerne les techniques et animaux transgéniques. Il y a de nombreuses notions à apprendre par cœur mais relativement peu par rapport à l’ensemble des autres matières. Il s’agit en fait plus d’exercices de compréhension et de logique. L’entraînement à ces exercices est primordial, d’où l’importance d’assister aux séances de TD durant lesquelles les réponses des QCM du polycopié d’entraînement de la faculté vous serons données ; vous pourrez aussi y posez vos questions et suivre quelques rappels de cours. Ce polycopié que nous avons réalisé pour le T.A.T a pour vocation de vous permettre un entraînement varié et optimal pour le concours. Nous avons essayé de suivre directement le modèle des QCM de la faculté, mais il est fort possible qu’un petit nombre des QCM que vous trouverez ici sont plus ardus et font référence à des détails plus poussés que ceux demandés le jour du concours. Ne vous focalisez pas sur ces éléments. Si vous avez des questions, consultez le forum http://www.tutoweb.org ou les tuteurs que vous trouverez pendant les permanences du Tutorat. Dans les cas éventuels où il y aurait des erreurs concernant les QCM ou les fiches de cours de ce polycopié, nous mettrons en ligne (sur le site) les errata correspondant et nous vous en informerons par l’intermédiaire des colles. Bonne chance à tous ! NB : vous aurez besoin du tableau du code génétique et de la correspondance des bases wobble (qui ne sont pas inclus dans ce poly, mais qui sont présents sur la première page de chaque sujet de concours de la fac) pour répondre à certains QCM. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 5
  • 6. II Fiches de cours Voici un petit nombre de fiches explicatives de points du cours qui peuvent poser problème. Beaucoup d’autres éléments indispensables à assimiler sont expliqués dans la correction des QCM qui concernent directement ces points (partie IV). Les tuteurs éditerons des fiches explicatives au cours de l’année s’il apparaît que certains points du cours ne sont pas bien compris par une grande partie des étudiants. Si certaines choses restent mystérieuses à vos yeux, le forum tutoweb.org et les permanences des tuteurs sont là pour vous les expliquer. - Classification des acides aminés page 7 - Dosage et densité optique page 8 - Chromatographies échangeuses d’ions page 9 - Bases, nucléosides et nucléotides page 10 - Enzymes de restriction page 13 - Sondes page 14 - Amplification élective in vitro : PCR page 19 - Analyse du génome page 21 - Séquençage nucléotidique page 23 - Analyse de l'expression des gènes page 24 - Analyse génotypique page 28 © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 6
  • 7. Classification des acides aminés (aa) 1 AA = une fonction amine NH2 + un radical R + une fonction acide carboxylique COOH R – CH – COOH le carbone lié a la fois au groupement COOH et / NH2 est dit « carbone α » NH2 Selon la nature de R on parle d’AA polaires ou apolaires, il s’agit de la réaction de l’AA vis- à-vis de l’eau. En effet le corps humain est constitué en grande majorité d’eau, il est logique d’envisager la réaction des AA dans un milieu aqueux.  Polarité : tendance de la molécule à agir avec l’eau au pH physiologique de 7,42 ------------------------------------------/--------------------------------------------------> acide 7,42 alcalin AA apolaires AA polaires Neutres Acides Basiques Glycine G (Gly) Serine S (Ser) Ac. Aspartique Lysine K Alanine A (Ala) Thréonine T (Thr) D ( Asp) (Lys) Valine V (Val) Asparagine N (Asn) Leucine L (Leu) Glutamine Q (Gln) Ac. Glutamique Arginine R Isoleucine I (Ile) Cystéine C (Cys) E (Glu) (Arg) Phenylalanine F (Phe) Tyrosine Y (Tyr) Tryptohane W (Trp) Histidine H Méthionine M (Met) (His ) Proline P (Pro) Quelques petites précisions sur les AA qui tombent souvent dans les QCMs! Glycine ou Glycocolle: le plus petit des AA (R=H) Proline: iminoacide (fonction imine NH), cyclique donc jouant un rôle important dans la structure spatiale des protéines. Cystéine: présence d'un groupement Thiol SH qui, par condensation de deux cystéines, permet la formation d'un pont dissulfure et l'obtention d'une cystine. Asparagine et Glutamine: amides Ac aspartique et ac glutamique: ac dicarboxyliques ( 2 fonction COOH) Au sein d’une protéine dans un milieu aqueux : - les AA apolaires sont enfouis au cœur de la protéine - les AA polaires sont à la surface, en contact avec l’eau => substituer un AA par un autre de la même polarité au sein d’une même protéine a moins d’effet sur son éventuelle déformation que si les deux acides aminés n'ont pas la même polarité. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 7
  • 8. Dosage et densité optique Pour mesurer la concentration (dans une solution) de certaines molécules organiques, on peut utiliser la spectrophotométrie. Il s’agit de mesurer en unités arbitraires la D.O. (ou densité optique) d’une solution traversée par un faisceau de lumière, et dont la longueur d’onde λ est fixée au préalable par l’expérimentateur. Pour calculer la D.O., on mesure l’intensité du faisceau lumineux avant et après la traversée de la 1,2 solution. Ainsi : D.O. = log I0 1 I 0,8 0,6 D.O. Retenir absolument que : 0,4 - les Bases azotées puriques et pyrimidiques 0,2 présentent un pic d’absorption à 260 nm 0 - le PHénol à 270 nm 250 260 270 280 nm nm nm nm - les Protéines à 280 nm (exemple de moyen mnémotechnique : BFP) NB : Présenter un pic d’absorption ne veut pas dire que le composé n’absorbe pas une lumière monochromatique d’une autre λ mais qu’il absorbe le plus la lumière à la λ qui donne le pic - 1 D.O. à 260 nm est équivalente à une concentration de 50 μg/ml de DNA double brin ou de 40 μg/ml de DNA simple brin ou de RNA. Donc l’ARN absorbe plus que l’ADN à 260 nm (parce que pour absorber la même valeur on a besoin de moins d’ARN que d’ADN). Applications : - Apprécier le degré de pureté du DNA : Pour savoir si une solution contient du DNA pur ou contaminé par des protéines, on fait 2 mesures, la 1ère à 260 et une 2nde 280 nm. Les protéines présentent un pic d’absorption à 280 nm mais absorbent aussi à 260 nm, même si l’absorption est moins importante. Après les 2 lectures, on fait le rapport D.O. 260 D.O. 280 Si le rapport est de l’ordre de 1,8-2 (ou plus) => la solution d’acide nucléique est pure Si le rapport est inférieur à 1,8 => solution d’acide nucléique contaminée par des protéines On peut aussi faire le rapport DO 280 / DO 260 : Si le rapport est d'environ = 0,5 => pure Si le rapport est > 0,5 => contaminée - Apprécier le degré de contamination par du phénol : On fait le rapport D.O. 260 D.O. 270 © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 8
  • 9. Chromatographies échangeuses d’ions Petit rappel essentiel : Les CATIONS sont chargés + et se déplacent vers la CATHODE qui est chargée – Les ANIONS sont chargés – et se déplacent vers l’ANODE qui est chargée + A un pH neutre, un aa ACIDE est ANIONIQUE et un aa BASIQUE est CATIONIQUE Les chromatographies échangeuses d’ions se font sur des résines chargées électriquement. Elles servent à détecter et isoler les ions d’une même charge. Elles se font en général sur des colonnes ou résines sur lesquelles des groupements de charges positives ou négatives sont liées par covalence. On fait passer sur ces résines les solutions, et y adhèrent les groupements de charge opposée au support. En fin d’expérience on peut faire passer une solution éluante, plus chargée que la résine et qui entre en compétition avec elle, qui permet le décrochage des éléments accrochés. Résine échangeuse Ions fixés Charges électriques résine D’anions anions (-) positives De cations cations (+) négative Conseil : Ce sont en général des acides aminés qu’il vous sera donné de séparer par cette méthode. Il est préférable de toujours poser vos acides aminés sur une feuille à part et faire un petit tableau. Ces acides aminés baignent dans un milieu de pH qui vous sera donné. Marquez le pH du milieu à l’aide d’un gros trait en considérant la ligne horizontale comme l’échelle du pH allant croissant de gauche à droite. pH de l’expérience aa acides aa neutre aa basiques pHiA pHiN pHiB pH Il s’agit ensuite de comparer le pH du milieu et le pHi des acides aminés. Soit le pH du milieu est extrême donc vous saurez pertinemment le situer par rapport à celui des acides aminés (si les valeurs ne sont pas données, on peut retenir pHiA=2, pHiN=7, pHiB=12), soit il vous sera fourni dans l’exercice le pHi de chacun des acides aminés mis en question. - Si pH < pHi, c’est le milieu qui est plus acide, les acides aminés seront basiques par rapport au milieu, ils attirent donc les protons et se chargent positivement. - Si pH > pHi, les acides aminés sont acides par rapport au milieu, ils céderont des protons au milieu et seront chargés négativement. Ainsi, après une chromatographie, les aa seront Une résine échangeuse de cation peut être séparés en fonction de leur charge : les élués (non représentée ainsi : fixés à la colonne) seront ceux de même charge que la résine. Tandis que ceux de charge opposée seront fixés. Plus l’acide aminé a un pHi éloigné du pH du milieu plus il sera acide ou basique par rapport à celui-ci, donc d’autant plus chargé ; il sera le premier à être élué ou fixé, si respectivement il est ou n’est pas de même charge que la résine. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 9
  • 10. Bases, nucléosides et nucléotides I - LES BASES Bases puriques et pyrimidiques : Elles dérivent d’hétérocycles azotés : le noyau purine ( 2 cycles) ou le noyau pyrimidine (1 cycle). Ces 2 cycles sont insaturés, conjugués, les liaisons peuvent donc se déplacer. PURIQUES PYRIMIDIQUES C : Cytosine A : Adénine U : Uracile G : Guanine T : Thymine Bases : - communes au DNA et RNA : A, C et G - spécifique au RNA : U - généralement spécifique au DNA : T Isoméries et tautoméries des bases : Amine NH2  Imine NH Cétones O  Hydroxyle (énol) OH Chaque radical des bases peut être présent sous 1 des 2 formes tautomériques, ces 2 formes étant en équilibre mais il y en a toujours une dominante par rapport à l’autre : la forme amine et la forme cétone. Dérivés de bases : - A partir de la purine (A ou G), et par une succession de désaminations et d’oxydations : Base Purique Hypoxanthine (Hx) Xanthine Acide Urique Présente dans certains ARNt (de Chez l’homme, étape finale du transfert) dans les anticodons catabolisme. Nombre de 1 (en 6) 2 (en 2 et 6) 3 (en 2, 6 et 8) radicaux OH et positions Pathologie Présente anormalement en En cas d’excès, pathologie de grande quantité dans le DNA en la goutte cas d’attaque oxydative - Bromouracile (BrU) : Le BrU est un analogue de la thymine, sa présence augmente la présence des formes tautomériques rares, donc de mésappariements. C’est un agent mutagène, il augmente près de 100 fois le risque de mutations. Le BrU s’apparie normalement avec A, mais présente une forme énol 100 fois plus abondante qui s’apparie avec G. - Méthylxanthines : Triméthylxanthine : caféine Diméthylxanthine : théophylline et théobromine © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 10
  • 11. Ce sont des excitants au niveau cardiaque et du SNC : - effets inotrope ( force de contraction du cœur ) et chronotrope ( fréquence cardiaque) positifs => augmente le débit cardiaque, mais avec une certaine limite (si excès, le débit chute). - effet broncho-dilatateur sur les muscles lisses bronchiques, utilisés pour calmer la crise d’asthme. II – LES NUCLEOSIDES = Association d’une base avec un sucre qui peut être - soit le ribose : dans le RNA  forme un ribonucléoside - soit le désoxyribose : dans le DNA  forme un désoxyribonucléoside Base Associée au ribose Associée au désoxyribose RIBONUCLEOSIDE DESOXYRIBONUCLEOSIDE A Adénosine A Désoxyadénosine dA G Guanosine G Désoxyguanosine dG U Uridine U C Cytidine C Désoxycytidine dC T Ribothymidine T (dans ARNt) Thymidine dT Hx Inosine I (hypoxanthine + sucre) III – LES NUCLEOTIDES = Association d’un nucléoside (base + sucre) avec 1,2 ou 3 phosphates Le 1er phosphate est lié au sucre en 5’ par une liaison ester, puis entre les groupements phosphates il y a établissement de liaison anhydride d’acide. RIBONUCLEOTIDES DESOXYRIBONUCLEOTIDES Base mono di tri mono di tri incluse phosphaté phosphaté phosphaté phosphaté phosphaté phosphaté C CMP CDP CTP dCMP dCDP dCTP U UMP UDP UTP G GMP GDP GTP dGMP dGDP dGTP A AMP ADP ATP dAMP dADP dATP I IMP IDP ITP T TMP TDP TTP dTMP dTDP dTTP Il existe aussi des nucléotides cycliques : AMPc (3’-5’) et AMPc (2’-3’) (liaison phosphodiester) IV – LES DERIVES S-adénosylméthionine Rôle dans la méthylation Phosphoadénosylphosphosulfate Rôle dans la sulfatation Amino-acyl- AMP Intermédiaire de l’activation des AA dans la synthèse des protéines Acyl- AMP Intermédiaire de l’activation des acides gras dans leur transfert Co-enzymes NAD/ NADP UDP-glucose, CDP-choline, etc… Forme activée de diverses molécules pour leur transfert © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 11
  • 12. Antimétabolites : 6-mercaptopurine Atome de soufre en 6, utilisé pour le traitement des leucémies. Allopurinol Inhibiteur de la xanthine-oxydase, donc de la formation de l’acide urique => traitement de la goutte. Ce n’est pas un noyau purine !!! thioguanine Atome de soufre en 6 et fonction amine en 2. Utilisé dans le traitement des leucémies. 5-fluoro-uracile Analogue de la thymine, anti-cancéreux. 5- Analogue de la thymidine, Anti-herpès. iododésoxyuridine Puromycine Structure : adénine diméthylée + analogue ribose avec NH2 en 3’ + AA non présent chez l’humain (donc liaison amide entre ces 2 derniers !) Analogie avec l’extrémité CCA-terminale des tRNA portant un AA. La puromycine agit donc en compétition avec les tRNA, se pose sur le site A du ribosome et bloque la synthèse des protéines 5-fluorocytosine Anti-fongique AZT Anti HIV (azidothymidine) Acyclovir Structure proche d'une guanosine. Anti herpès/varicell/zona Ara-C (cytosine Traitement des leucémies aigües. arabinoside) Gemcitabine 2 fluors au niveau du C2 du ribose accroché à une cytosine. Traitement des cancers. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 12
  • 13. Enzymes de restriction Les enzymes de restriction coupent uniquement le DNA double brin ; ce sont des endonucléases, elles coupent à l’intérieur de la chaîne nucléotidique après reconnaissance d’une séquence spécifique. Ces endonucléases sont parfois synthétisées par des bactéries suite à une agression par des phages. Elles coupent le matériel génétique du phage, ce qui neutralise son pouvoir infectieux. On classe les endonucléases de restriction en 3 catégories : Classe Reconnaissance de la séquence Lieu de la coupure spécifique I oui 1000 à 5000 pb plus loin II oui La séquence elle même III oui 20 pb plus loin Les endonucléases de classe II coupent des séquences dites « palindromiques », ce qui signifie en terme de DNA double brin que la séquence nucléotidique lue de 5’ en 3’ est la même sur les 2 brins complémentaires (parfois à l’exception de la base centrale, si la séquence de reconnaissance est impaire). On distingue 2 types de coupure : - la coupure franche : Après intervention de l’enzyme, la chaîne initiale de DNA est divisée en 2, les 2 bouts de chaîne étant droits. Ex : 5’--- G T T ║ A A C --- 3’ Hpa I 3’ ---C A A ║ T T G --- 5’ - la coupure cohésive ou saillante ou en baïonnette ou protrusive : L’enzyme coupe le palindrome au centre, en laissant 2 bouts saillants, ce qui permet le recollement des 2 extrémités si mises en présence, par complémentarité des bases azotées. Ex : 5’ --- G║AACTT C --- 3’ EcoRI ╚═════╗ 3’ --- C TTGAA║G ---5’ Isoschizomères : Sont dites isoschizomères des enzymes de classe II reconnaissant la même séquence nucléotidique et la coupant de la même façon. Cependant il arrive que les conditions dans lesquelles les enzymes sont capables d’exercer leurs fonctions ne soient pas les mêmes. Souvent, une des deux enzymes est sensible à la méthylation, c’est-à-dire que si la séquence est méthylée, l’enzyme sensible ne peut plus la couper. On peut donc utiliser les isoschizomères comme outil diagnostique, les méthylations pouvant être à l’origine de maladies génétiques. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 13
  • 14. Sondes Partie 1 : DENATURATION = FUSION Dénaturation = Fusion = passage de l’ADN double brin à l’ADN simple brin par coupure des liaisons hydrogènes suite à l’augmentation de la température. Evolution de la DO de l’ADN en fonction de la température. Rappel : ADN sb absorbe davantage qu’ADN db (cf. De Graeve) PARAMETRES INFLUENCANT LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm) Tm : température à laquelle les brins d’ADN sont dénaturés. - Composition en bases car fonction du nombre de liaisons : AT qui a 2 liaisons hydrogène, a un Tm plus faible (donc est plus facilement dénaturable) que GC qui a 3 liaisons hydrogène. - Longueur de l’Acide Nucléique car il y a une multiplication du nombre de liaisons hydrogène. - Présence de més/non-appariements car les liaisons hydrogène sont fragilisées : plus il y a de mésappariements, plus le Tm est abaissé). - Concentration en sels dans le milieu : la baisse de la concentration en sels diminue le Tm. NB : Une solution est d’autant plus stringente que sa concentration en sels est faible. - Formamide dans le milieu déstabilise le Tm. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 14
  • 15. Partie 2 : HYBRIDATION = association de deux brins d’acides nucléiques complémentaires suite à un refroidissement lent. Attention ! Un refroidissement brutal condamne l’ADN à rester à l’état simple brin. FACTEURS INFLUENCANT L’HYBRIDATION - Cot (Concentration d’ADN et temps que l’on donne à ces séquences pour se réassocier) NB : Au Cot ½, 50% des séquences d’ADN sont associés. - Température qui doit être inférieure au Tm - Longueur des fragments - Complexité des séquences - Nature des acides nucléiques - Force ionique METHODES 1) Hybridation en phase liquide Applications : Taille du génome : Cot ½ proportionnel à la taille du génome Etude des séquences répétitives 1. Séquences hautement répétitives (satellites) 2. Séquences moyennement répétitives 3. Séquences uniques 2) Hybridation sur support solide 3) Hybridation in situ Application : Localisation d’un gène sur des chromosomes Criblage de banques FISH © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 15
  • 16. Partie 3 : TECHNIQUE DE MARQUAGE DES SONDES Sonde = séquence polynucléotidique complémentaire d’une séquence d’ADN ou d’ARN avec laquelle elle s’hybride. L’hybridation est spécifique (seule la sonde spécifique pourra s’apparier avec la séquence correspondante) et sa sensibilité dépend du marquage des sondes. Ce marquage peut être de deux types : - Radioactifs  sondes chaudes - Non radioactifs  sondes froides 1) NICK TRANSLATION But : couper des petits bouts d’ADN pour les remplacer par de l’ADN marqué a) Cassures aléatoires par une endonucléase, la DNAse b) Agrandissement des cassures par l’activité exonucléase 5’  3’ de l’ADNpol I c) Synthèse d’ADN grâce à l’activité polymérase de l’ADNpol I en utilisant des dXTP marqués. Résultat : obtention d’un ADN bicaténaire contenant des nucléotides marqués sur les deux brins. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 16
  • 17. 2) MULTI-RANDOM PRIMING = Multi-amorçage au hasard But : Synthétiser de l’ADN marqué a) Chauffage de l’ADN double brin puis refroidissement brutal entraînant une séparation définitive des deux brins b) Synthèse de façon aléatoire d’une multitude d’amorces hexanucléotidiques. c) Parmi ces amorces, certaines vont forcément rencontrer leurs séquences complémentaires sur l’un des brins d’ADN. d) Synthèse d’ADN par l’ADNpol en utilisant des dXTP marqués Résultat : obtention de deux molécules d’ADN bicaténaires dont un seul brin est marqué (par molécule) 3) T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE Marque l’extrémité 5’ par ajout ou substitution du phosphate γ du 1er nucléotide. 4) SONDES CLONNEES DANS LE PHAGE M13 Le phage M13 est un vecteur monobrin dont la séquence est entièrement connue et qui va transporter la séquence d’ADN d’intérêt, la sonde. On créée une amorce complémentaire de la partie adjacente à la sonde. Cette amorce permet à l’ADNpol de synthétiser un brin d’ADN marqué à partir de dXTP marqués. Cette synthèse va très vite s’interrompre et ne couvre ainsi que le gène d’intérêt. NB : la sonde elle-même n’est pas marquée, c’est son complémentaire. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 17
  • 18. 5) RIBOSONDES : sondes ARN Nick Multi-Random T4 polynucléotide Technique Phage M13 Translation Priming kinase Sur les deux Sur un des deux Marquage brins d’ADN brins d’une Extrémité 5’ Vecteur par endroit molécule d’ADN Amorce ? Non Oui Non Oui Oui, car formation Fragment Non de nouveaux brins Non Non de Klenow (~ réplication) DNAse Amorces Phosphate marqué Amorce Outils ADNpol I ADNpol T4 polunucléotide Vecteur : phage dXTP marqués dXTP marqués kinase © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 18
  • 19. AMPLIFICATION ELECTIVE IN VITRO : PCR OBJECTIF : Amplifier la quantité d’ADN (uniquement l’ADN) OUTILS : - 2 amorces (= oligonucléotides) - ADNpol - Substrats : dXTP PRINCIPE : Grâce à un couple d’amorces strictement complémentaires des bornes de la région d’ADN à amplifier, on synthétise une très grande quantité d’ADN à la suite de plusieurs cycles. 1) DENATURATION : séparation des brins par augmentation de la température (95°C environ) 2) HYBRIDATION des AMORCES avec les bornes de la région à amplifier. (50°C environ) NB : la température doit être diminuée pour que l’hybridation est lieue. 3) SYNTHESE : l’ADNpol synthétise de l’ADN. Ainsi, à la fin d’un cycle, on double la quantité initiale. (70°C environ) Fin du Cycle Après n cycles, on obtient 2n nouveaux exemplaires du fragment d’ADN © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 19
  • 20. RESULTATS : Qu’obtient-on au bout du 1er cycle ? 2 copies avec les extrémités 3’ variables. Qu’obtient-on au bout du 2ème cycle ? 8 copies dont 2 avec les extrémités 3’ fixes LIMITES : - Taille : on ne peut amplifier que des petits fragments (taille inférieure à 2 kpb) - Connaissance d’une partie de l’ADN à amplifier (pour l’amorce) - ADNpol thermorésitante est dépourvue de la fonction proof-reading d’où un risque d’erreur. - Amplification parasite : mauvaise hybridation et contamination APPLICATIONS : - Génération des sondes - Recherche de mutations - RT-PCR : étude des ARN - Clonage - PCR quantitative - PCR en temps réel : quantification précise © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 20
  • 21. Analyse du génome Le génome comprend l’ADN génomique nucléaire et mitochondrial. Southern Blot 1. Méthode - Fragmentation de l’ADN (bicaténaire) par une enzyme de restriction - Séparation des fragments par électrophorèse - Dénaturation (solution alcaline sur le gel) - Transfert des fragments par capillarité sur une membrane (nylon ou nitrocellulose) - Fixation des fragments (UV ou chauffage) - Pré-hybridation des sites non occupés par un ADN hétérologue - Hybridation avec une sonde froide ou chaude : incubation de l’ADN fixé sur le support avec la sonde, puis lavages avec des solutions salines de force ionique variable : - Solution très concentrée (haute force ionique ou faible stringence) => Hybrides peu déstabilisés => signaux non spécifiques++ - Solution très diluée (faible force ionique, forte stringence) => Séparation de tous les hybrides => aucun signal après le lavage La taille des fragments peut être déterminée grâce à un système d’étalonnage avec des marqueurs de taille. 2. Application - Carte de restriction Identification de fragments d’ADN après digestion par des enzymes de restriction. Ex : SONDE 6kb 8kb EcoRI IndIII 7kb 10kb Southern Blot : - 10 kb 8 kb 7,5kb 7kb 6kb 5,5kb 1kb 0,5kb + EcoRI IndIII EcoRI+IndIII © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 21
  • 22. - Détection : - de pseudo-gènes (gènes non fonctionnels car non transcrits) et de gènes apparentés (appartenant à la même famille, Hb par exemple), à la même superfamille (Ig par exemple) ou à différentes espèces (séquences homologues) : les séquences n’étant pas parfaitement complémentaire il ne faut pas que la stringence soit trop forte. - de polymorphismes (RFLP) - de délétions - de mutations ponctuelles - de recombinaisons 1. Exemples QCM : À partir d’ADN génomique de deux individus A et B on analyse par Southern un fragment de 600pb d’un gène porté par le chromosome X. Ce fragment ne contient qu’un seul site de restriction Apa I (insensible à la méthylation) et Hae III (sensible à la méthylation, c'est-à-dire qu’elle n’agit pas quand le site est méthylé). La sonde utilisée couvre tout le fragment du gène. Digestion par les enzymes. Résultats : Individu A Individu B Apa I - + - Apa I - + - HaeIII - - + HaeIII - - + 600 pb 400pb 200pb Rappel : chez un homme (XY) les gènes du chromosome X sont actifs, tandis que chez une femme (XX) l’un des 2 X est inactivé « au hasard » par méthylation. Ce que l’on peut conclure à partir de ces résultats : L’individu A a un allèle coupé par Hae III mais pas l’autre, ce qui signifie qu’un des 2 allèles est méthylé. Cela correspond à un profil XX. Chez l’individu B tous les chromosomes X sont coupés par Hae III, donc aucun n’est méthylé, ce qui est compatible avec le profil d’un homme. Rq : Une absence de signal peut correspondre à une grande délétion ou à une erreur technique ! © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 22
  • 23. Séquençage nucléotidique Aussi appelé méthode de SANGER, le séquençage utilise des 2’-3’didésoxynucléotides. Méthode Pour séquencer une séquence d’ADN on place une amorce puis on synthétise son complémentaire avec des désoxynucléotides (dNTP), et une petite quantité de didésoxynucléotides (ddNTP) (rapport 1/100 environ). Les ddNTP seront utilisés aléatoirement par la polymérase qui va les fixer au dNTP précédent par le 3’OH. Ce 3’OH étant absent sur les ddNTP, leur fixation va interrompre la chaîne. On obtient ainsi toute une population de fragments interrompus à divers stades. Pour visualiser les fragments on peut marquer l’amorce (d’abord radiomarquées puis remplacées par des amorces portant des fluorophores), les dNTP ou les ddNTP. Actuellement on utilise l’électrophorèse capillaire (migration dans de petits tubes capillaires). Le risque d’erreur lors du séquençage est de 1/100 000 bases. Exemple Marquage radioactif => Expérience divisée en 4 : ddATP + dNTP dans le tube 1, ddTTP + dNTP dans le tube 2, ddCTP + dNTP dans le tube 3, ddGTP + dNTP dans le tube 4 Puis on fait migrer sur un gel d’électrophorèse : A T C G - 3’ Sens de migratio n du brin néosynthétisé + 5’ On a donc : Brin complémentaire : 5’ ATACGTACTGTA 3’ Séquence initiale : 3’ TATGCATGACAT 5’ La synthèse du brin néosynthétisé se fait de 5’ en 3’. Sur le gel, les brins d’ADN les plus proches de l’anode (-) sont ceux qui ont migré le moins, ce sont donc les plus grands, ce sont ceux qui ont incorporé le plus tardivement un ddNTP, ils correspondent à l’extrémité 3’. Les brins les plus petits migrent beacoup et sont proches de la cathode. Ainsi la lecture de la séquence se fait dans le sens inverse du sens de migration électrophorétique. Pour connaître la séquence initiale on prend le complémentaire du brin néosynthétisé. Si on utilise la fluorescence on marque les différentes bases avec un fluorophore différent dans 4 tubes différents puis on mélange et on fait migrer sur un gel d’électrophorèse : on obtient alors une succession de pics fluorescents (sens 5’-3’ généralement de gauche à droite). © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 23
  • 24. Analyse de l'expression des gènes Expression des gènes => mRNA : fragiles (détruits par les ribonucléases), peu abondants et tissu spécifiques (par exemple le gène de l’Hb est très exprimé dans les cellules hématopoïétiques). I. Analyse qualitative des ARN 1. Northern Blot a. Méthode Electrophorèse des ARN en gel dénaturant, transfert sur une membrane et hybridation avec une sonde => PAS DE FRAGMENTATION (≠ Southern blot) Le gel dénaturant sert à éviter les structures secondaires qui peuvent modifier la migration des ARN, ils migrent ainsi seulement suivant leur taille, ce qui permet par exemple d’identifier des RNA ayant subi des épissages alternatifs. b. Exemples L’étude en Northern Blot d’un ARN donné chez 3 individus donne les résultats suivants : 1 2 3 2,8kb Individu 1 : peut être hétérozygote pour un défaut d’épissage, une délétion… 2kb Individu 2 : peut être homozygote pour une délétion de tout le gène. Ce résultat peut aussi être dû à une erreur technique. 1,2kb Individu 3 : peut être homozygote pour un défaut d’épissage ou une délétion © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 24
  • 25. 2. Cartographie à la nucléase S1 ou à la RNase A Rappel : La nucléase S1 clive seulement l’ADN ou l’ARN simple brin. La RNase A n’agit que sur l’ARN simple brin. Cette méthode sert à repérer les mésappariements entre un mRNA et une sonde d’ADN génomique (on utilisera alors la nucléase S1) ou une ribosonde (RNase A). Gel d’électrophorèse - Sonde marquée Nucléase S1 ou Nucléase S1 RNase A ou RNase A + La nucléase S1 permet de cliver des mésappariements de plus de 3 bases. La RNase A permet de cliver les mésappariements de 1 base ou plus. 3. RT-PCR a. Méthode C’est une PCR précédée d’une rétrotranscription. C’est une technique sensible qui permet d’amplifier suivants les amorces choisies tel ou tel ARN sous forme de cDNA. Elle a notamment démontré le phénomène de transcription illégitime, c'est-à-dire que dans chaque cellule tous les gènes sont transcrits mais en plus ou moins grande quantité selon la différenciation de la cellule. b. Remarques Penser que les cDNA sont exempts d’introns. Les modifications de taille des cDNA peuvent être dus à des épissages alternatifs ou à des mutations entraînant des défauts d’épissage (conservation d’introns ou excision d’exons),… L’absence de résultat peut être dû à une mutation dans la région d’appariement des amorces ou à une erreur technique. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 25
  • 26. II. Analyse quantitative des ARN Dot Blot On dépose des ARN issu de cellules sur une membrane et on hybride avec une sonde permettant de voir ce que l’on cherche. On compare ensuite l’intensité du signal obtenu avec l’intensité du signal obtenu par la gamme étalon, ce qui permet d’avoir une analyse quantitative. III. Analyse de la transcription = analyse de l’activité transcriptionnelle d’un gène donné Pour cela on poursuit dans le tube à essai la transcription qui se produit dans une cellule vivante = RUN ON. L’activité transcriptionnelle d’un gène donné est proportionnelle à la quantité de RNA polymérases fixées sur ce gène et au nombre de mRNA produits IV. Analyse des mécanismes de régulation des gènes Cette régulation passe par la présence de protéines qui se fixent sur l’ADN : facteurs de régulation, facteurs de transcription… 1. Foot printing On part du principe que ces différentes protéines régulatrices fixées sur l’ADN vont protéger ce dernier de l’action des nucléases. Pour visualiser cette interaction il faut marquer l’ADN en 5’ grâce à la polynucléotide kinase. La DNase I clive ces molécules n’importe où (ADN non protégé) et va donc cliver en dehors des régions occupées par les protéines. C’est une technique précise qui fait en quelque sorte l’empreinte de la protéine et définit ainsi le siège de l’interaction ADN/protéine. 2. Retardement sur gel ou gel shift a. Méthode Permet de déterminer la spécificité de liaison d’un facteur de transcription (FT) à une séquence donnée d’ADN. Pour cela on synthétise cette séquence (oligonucléotide=ON), on la marque et on l’incube avec des extraits nucléaires. On fait migrer ce complexe et on étudie sa spécificité grâce à des compétiteurs spécifiques ou non (séquence hétérologue dIdC par exemple). On peut aussi faire un supersshift, c'est-à-dire que l’on met l’oligonucléotide en présence du FT avec des anticorps anti-FT : ce complexe va alors être encore plus retardé. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 26
  • 27. b. Exemples 1ère étape : synthèse et marquage de l’oligonucléotide au 32P (radioactif) puis électrophorèse. L’ON marqué va migrer en fonction de sa taille et de sa charge vers l’anode (apparition d’une bande). Puis on met cet ON en présence d’une solution de protéines : - si fixation protéique : 1 bande + 1 bande retardée qui a migré moins loin car plus lourde (formation de complexes ON-protéines) - si pas de fixation protéique : 1 seule bande comme le témoin La 2ème étape consiste à savoir si cette liaison est spécifique. Pour cela on ajoute un compétiteur (de séquence très différente de l’ON) : - si la liaison est non spécifique, une partie de la bande retardée disparaîtra. - si la liaison est spécifique, la bande restera inchangée en présence d’un compétiteur de séquence très différente alors qu’elle aura tendance à disparaître en présence d’une grande quantité de l’ON non marqué. 2 : ON marqué + solution protéique => Retard donc fixation 3 : ON marqué + solution protéique + compétiteur de séquence différente => pas de changement => liaison spécifique 4 : ON marqué + solution protéique + compétiteur de séquence différente => diminution du signal de la bande retardée => liaison non spécifique 5 : ON marqué + solution protéique + ON non marqué en grande quantité => diminution du signal de la bande retardée => liaison spécifique © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 27
  • 28. Analyse génotypique I- Pathologies de l’ADN : héréditaires (maladies génétiques) ou acquises (cancers, maladies infectieuses ou parasitaires). II- Pour toute analyse génotypique il faut : une séquence connue ou une sonde adéquate III- 2 types de diagnostics génotypiques : DIRECT (on connaît le gène ou le locus affecté par la pathologie) ou INDIRECT (plus complexe, il utilise des méthodes dites indirectes pour préciser le risque chez un individu d’être atteint ou non, sans connaître la séquence impliquée). IV- Rappel : règles de généalogie : - Stratégies diagnostiques 1. Le diagnostic génotypique direct (DGD) Il passe par la recherche de sites polymorphes associés à la maladie. Plusieurs techniques peuvent être utilisées suivant la nature des lésions : I- Lésions grossières (inversion, fusion, translocation, délétion,…) : Southern ou PCR Par exemple pour les délétions on va avoir une diminution de taille du fragment ou une absence de signal. Mais attention, une absence de signal complète est difficile à interpréter car elle peut signifier une délétion totale ou erreur technique. Donc on étudie aussi l’expression d’un gène domestique (si absence de signal => erreur technique). Aujourd’hui on remplace le Southern par la PCR : on amplifie ainsi la région que l’on veut. Si l’amorce est dans la région délétée, on n’aura pas d’amplification de l’ADN et donc pas de signal. V- Mutations ponctuelles : 1. Carte de restriction Mutation entraînant la création ou l’abolition d’un site de restriction pour une enzyme donnée. - Hybridation spécifique d’allèle (ASO= oligosonde spécifique d’allèle) Elle met en évidence une mutation particulière. On synthétise et on marque une sonde « normale » et une sonde « mutée » que l’on pose sur une membrane puis on met chaque sonde avec l’ADN du patient. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 28
  • 29. ASO normal = N = normal, M = muté ASO muté = N/N N/M M/M Exemple : Le patient 1 est hétérozygote pour la mutation étudiée. Le patient 2 peut être homozygote (muté) ou bien hétérozygote muté/délété. Le patient 3 est soit homozygote pour la délétion de la région étudiée ou il y a eu une erreur technique. Le patient 4 est soit homozygote normal ou hétérozygote normal/délété (pour Levade, on parle d'homozygote pour un individu malade seulement) La présence d’une mutation n’implique pas que l’individu soit porteur d’une maladie. A l’inverse l’individu avec un ASO normal n’est pas forcément sain ! - PCR Elle peut être suivie d’une digestion enzymatique de restriction ou d’un ASO. Exemple : EXON 4 (250 pb) Amorces de PCR Une mutation ponctuelle dans cet exon introduit un site pour l’enzyme de restriction Hind III. Une électrophorèse est réalisée après PCR de cette région génique sur l’ADN de plusieurs sujets puis incubation avec Hind III (digestion complète). Puis coloration au bromure d’éthidium. Résultats : 1 2 3 On peut dire que : 250pb - le sujet 1 est hétérozygote N/M - le sujet 2 est homozygote N/N ou hétérozygote N/D - le sujet 3 est homozygote M/M ou hétérozygote M/D 150pb N = non muté (pour la mutation étudiée) 100pb M = muté D = délété pour toute la région étudiée © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 29
  • 30. Rq : L’apparition de bandes de faible intensité correspond à des amplifications parasites : les amorces se sont hybridées sur des zones du génomes dont elles ne sont pas tout à fait complémentaires. Pour éviter cela on peut modifier les conditions de stringence (augmentation température par exemple). Attention aussi à d’éventuelles contaminations par un fragment d’ADN étranger qui peut fausser les résultats. (peut être mis en évidence par la réalisation d’un « tube blanc ») VI- Détection d’une mutation inconnue 1. Séquençage : le plus souvent on séquence le cDNA car il est plus court. 2. Méthode à la RNase A (détecte des mutations ponctuelles ≠ nucléase S1) 3. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Dans cette méthode on part du principe que la présence d’une mutation ponctuelle dans une séquence donnée peut modifier la température de fusion (Tm) du domaine muté. On met donc l’ADN double brin sur un gel électrophorétique avec une concentration croissante de gel dénaturant : la séparation des brins va ralentir leur progression, on considère qu’elle est stoppée. ATTENTION : une mutation n’entraîne pas forcément de différence de migration ! SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) Pour cette méthode on considère qu’une mutation du DNA génomique peut entraîner une modification de la conformation des brins séparés. Pour le mettre en évidence on marque les extrémités grâce à la polynucléotide kinase, on dénature les doubles brins puis on les refroidit brutalement pour qu’ils restent physiquement séparés. Sur l’électrophorèse des conformations différentes vont entraîner des migrations différentes. ATTENTION : - Il n’y a pas d’agent dénaturant sur le gel électrophorétique. - Cette différence de migration est possible mais pas systématique - S’il y a une différence, c’est qu’il existe une mutation : pour savoir de quelle nature est cette mutation il faut faire un séquençage. - Une mutation n’entraîne pas forcément de différence de conformation. Rq : ces deux méthodes DGGE et SSCP peuvent permettre de mettre en évidence la présence d’une mutation mais ne renseignent pas sur la nature de cette mutation. 2. Diagnostic génotypique indirect 1. Méthode RFLP = Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction = variations interindividuelles de séquences, révélées par des modifications de la carte de restriction. Ces variations sont souvent dans des régions non codantes (intergéniques, régulatrices, introns,…) et n’ont pas de rôle pathologique en elles-mêmes. On étudie alors l’abolition ou la création de sites de restriction et la probabilité de leur association avec une pathologie donnée. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 30
  • 31. Cette méthode nécessite des sites de restriction polymorphes et l’étude d’un grand nombre membres d’une famille où les personnes atteintes ont le même polymorphisme. Le diagnostic sera d’autant plus fiable que le site de restriction est proche du locus impliqué dans la maladie (car cela diminue le risque de recombinaison). Lorsque l’on analyse des polymorphismes intra ou juxta-géniques, on parle de diagnostic semi- direct, et lorsque les marqueurs sont extra-géniques, on parle de diagnostic indirect. ATTENTION : Ce sont des diagnostics probabilistes, il n’y a pas de certitudes absolues ! 2. Exemples Exemple 1 : Diagnostic prénatal par RFLP pour une maladie autosomale récessive (avec utilisation d’une sonde et d’une enzyme de restriction donnée) : pour chaque individu on donne la taille des fragments sur chaque allèle. Le fœtus aura un allèle de chacun de ses parents soit : 600/500 ou 800/500 ou 800/700 ou 600/700. Les parents sont hétérozygotes pour la maladie. Au vu des résultats, la maladie semble provoquée par l’association des fragments 700 et 800. Exemple 2 : Un test de diagnostic prénatal est basé sur l’analyse d’un RFLP pour une maladie autosomale récessive. Les résultats de la famille A ne peuvent pas être interprétés car on ne connaît pas le profil de l’enfant décédé. Pour la famille B, le fœtus pourra être 3-3 et sera probablement porteur de la maladie, 3-1 donc hétérozygote et indemne 1-1 donc homozygote indemne Pour la famille C, pas de prédiction possible car les régions étudiées ne semblent pas être en rapport avec l’état malade ou non. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 31
  • 32. III QCM d’entraînement - GENERALITES SUR LES PROTEINES - NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES - ADN - REPLICATION - ELEMENTS GENETIQUES MOBILES - STRUCTURES DES GENES - ARN ET TRANSCRIPTION - TRADUCTION - MUTATIONS ET MUTATIONS HEMOGLOBINE - ANTIBIOTIQUES ET ANTIMETABOLITES - TECHNIQUES GENERALES – OUTILS ENZYMATIQUES - HYBRIDATION MOLECULAIRES ET SONDES - PCR - SOUTHERN ET CARTOGRAPHIE RNASE - SEQUENCAGE (SANGER) - ANALYSE DE L’EXPRESSION DES GENES - ANALYSE GENOTYPIQUE - VECTEURS ET CLONAGE - ANIMAUX TRANSGENIQUES - TECHNIQUES EN VRAC Avec la participation de l'équipe de Biologie Moléculaire 2006-2007 et relecture des tuteurs 2009-2010 et 2010-2011 © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 32
  • 33. GENERALITES SUR LES PROTEINES 44 QCM QCM 1 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A/ Le génome représente l’ensemble de l’ADN nucléaire B/ Les « séquences poubelles » entre les différents gènes n’ont aucun rôle C/ Un gène codant pour une protéine, il y a autant de protéines que de gènes D/ Le génome nucléaire humain comprend entre 30 000 et 50 000 gènes E/ Le génome des cellules de notre foie est différent avant et après le réveillon QCM 2 : Parmi les acides aminés suivants : A/ Glu B/ Asp C/ Leu D/ Gly E/ Pro Le(s)quel(s) vous attendez-vous à trouver à l’intérieur d’une protéine ? QCM 3 : Parmi les acides aminés suivants : A/ Gln B/ His C/ Lys D/ Asp E/ Pro Le(s)quel(s) est (sont) acide(s) ? QCM 4 : Parmi les acides aminés suivants : A/ Asp B/ Arg C/ Val D/ Leu E/ Met Le(s)quel(s) est (sont) retenu(s) par un tampon à pH 2 lors d’une chromatographie échangeuse de cations ? QCM 5 : Les acides aminés : A/ Sont au nombre de 20 dont un est en fait un acide iminé (le tryptophane) B/ Certains sont hydrophobes (apolaires) et d’autres hydrophiles (polaires) C/ Les acides aminés apolaires peuvent être acides, neutres ou basiques au pH physiologique D/ Portent leur radical sur le carbone α (alpha) E/ Ont tous une seule fonction amine (NH2) et une seule fonction acide (COOH) QCM 6 : Parmi les acides aminés suivants : A/ Glu B/ Arg C/ Val D/ Ser E/ Asn Le(s)quel(s) est (sont) chargé(s) au pH physiologique ? QCM 7 : Parmi les acides aminés suivants : A/ His B/ Tyr C/ Asp D/ Met E/ Leu Le(s)quel(s) est (sont) polaire(s) ? QCM 8 : Parmi les acide aminés suivants : A/ Thr B/ Gln C/ Ala D/ Trp E/ Glu Le(s)quel(s) est (sont) apolaire(s) ? QCM 9 : Parmi les acides aminés suivants : A/ His B/ Gly C/ Ser D/ Cys E/ Asp Le(s)quel(s) est (sont) élué(s) par un tampon à pH 10 lors d’une chromatographie échangeuse de cations ? QCM 10 : A propos des acides aminés : A/ Ils sont classés en différentes catégories selon leur capacité à interagir avec l’eau B/ La proline induit un coude dans les protéines qui la contiennent C/ Le radical de la glycine correspond à un atome d’hydrogène D/ Il y a plus d’acides aminés apolaires différents que d’acides aminés polaires neutres différents E/ La cystéine possède un atome de soufre © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 33
  • 34. QCM 11 : Les protéines : A/ Sont formées par combinaison linéaire d’acides aminés B/ Une molécule d’eau est éliminée lors de la formation de la liaison peptidique C/ Sont des enchaînements de plus de 100 acides aminés et de poids moléculaire (PM) supérieur à 10 000 sinon on aurait appelé ces enchaînements des polypeptides D/ Ont toutes une structure quaternaire E/ Possèdent un potentiel informationnel considérable QCM 12 : Structure des polypeptides/protéines : A/ Un polypeptide de 10 acides aminés peut prendre 100 structures primaires différentes (10²) selon les acides aminés qui le composent B/ La structure secondo-tertiaire correspond à la structure spatiale de la protéine C/ La structure secondaire correspond à la géométrie dans l’espace des liaisons peptidiques D/ La structure tertiaire correspond au positionnement dans l’espace des radicaux de chaque acide aminé E/ Ces repliements sont nécessaires au fonctionnement normal de la protéine QCM 13 : Electrophorèse : On réalise une électrophorèse à pH 7,5 d’un mélange d’acide aspartique, de lysine et de proline. Quelle sera la migration obtenue ? A/ (pole -) Asp, Pro, Lys (pole +) B/ (pole -) Pro, Lys, Asp (pole +) C/ (pole -) Lys, Pro, Asp (pole +) D/ (pole -) Asp, Lys, Pro (pole +) E/ (pole -) Lys, Asp, Pro (pole +) QCM 14 : Classification des protéines : A/ Les holoprotéines comprennent l’apoprotéine et un groupement prosthétique B/ On classe les protéines selon leur forme en albumines et globulines C/ Leurs fonctions sont extrêmement variées : structure, récepteur, catalytique, transport, régulation… D/ Les protéines globulaires ont un rôle de soutien, de protection E/ Ces différences de propriétés entre les protéines sont exploitées en biologie moléculaire afin de les séparer par diverses techniques (chromatographie, centrifugation, électrophorèse…) QCM 15 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A/ Les acides nucléiques sont solubles dans le phénol B/ Chloroforme et éther à volume équivalent (1/1, v/v) servent à extraire le phénol C/ L’isopropanol permet l’extraction du bromure d’éthidium D/ Les acides nucléiques sont précipités dans les solutions aqueuses salées à faible concentration E/ Les protéines sont solubles dans les solvants organiques QCM 16 : Chromatographie d’exclusion-diffusion (gel filtration) : A/ La séparation repose sur la taille et le poids moléculaire (PM) des molécules B/ Si on verse un mélange de protéines et de polypeptides ce sont les protéines qui sont le plus retenues car ce sont des molécules plus grosses donc leur passage à travers le gel est plus difficile C/ Pour que les premières molécules commencent à sortir il faut verser un volume supérieur au volume de la colonne (dit « volume mort ») D/ Si on doit se placer dans des conditions expérimentales qui empêchent l’agrégation des molécules en complexe c’est justement car cette technique se base sur la taille des molécules et que celle-ci s’en trouverait modifiée E/ Cette méthode permet de calculer la taille et le poids moléculaire des protéines si le dispositif est correctement étalonné © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 34
  • 35. QCM 17 : Les protéines : A/ Ont un sens conventionnel d’orientation : l’extrémité N-terminale à gauche et l’extrémité C-terminale à droite B/ Présentent un pic d’absorption maximal à 280 nm C/ Sont issues de l’expression des gènes après transcription et réplication D/ Ont plus de chance de perdre leur fonction si la mutation qui se produit est la substitution d’un acide aminé polaire par un acide aminé apolaire que s’il s’agit d’une substitution par un autre acide aminé polaire E/ Les albumines sont modérément solubles dans l’eau mais solubles dans les solutions salines QCM 18 : Parmi les acides aminés suivants : A/ Glu B/ Asn C/ Lys D/ Pro E/ Phe Lesquels sont élués les premiers par un tampon à pH 5 lors d’une chromatographie échangeuse d’anions ? QCM 19 : Electrophorèse : On réalise une électrophorèse à pH 4 d’un mélange d’acide glutamique, d’histidine et de serine. Quelle sera la migration obtenue ? A/ (pole -) Glu, Ser, His (pole +) B/ (pole -) Ser, Glu, His (pole +) C/ (pole -) His, Glu, Ser (pole +) D/ (pole -) Glu, His, Ser (pole +) E/ (pole -) His, Ser, Glu (pole +) QCM 20 : Densité optique (DO) : A/ Les protéines présentent un pic d’absorption maximal à 280 nm B/ Pour une quantité donnée d’ADN en solution, la DO à 280 nm du double brin est inférieure à celle du simple brin C/ La recherche de contamination des acides nucléiques par des protéines s’effectue en mesurant le rapport DO à 280 nm sur DO à 260 nm ; pour être optimal il doit être de l’ordre de 1,8 – 2 D/ Le phénol présente un pic d’absorption maximal à 260 et 280 nm E/ La mesure de la densité optique à 260 nm d’une solution d’ADN permet d’évaluer sa concentration QCM 21 : Parmi les acides aminés suivants : A/ Ala B/ Tyr C/ His D/ Arg E/ Asp Lesquels sont élués par un tampon à pH 1 lors d’une chromatographie échangeuse d’anions ? QCM 22 : Chromatographie de partage sur papier : A/ La migration (représentée par le Rf) plus ou moins rapide des substances est fonction de l’affinité de ces substances pour les solvants B/ Nous avons dans cette technique 2 phases non miscibles : une solide (fixée) et une liquide (mobile) C/ La migration peut se faire par capillarité (chromatographie ascendante) ou par gravité (chromatographie descendante) D/ On peut identifier les éléments séparés en effectuant une pulvérisation de colorants adapté ou une auto-radiographie par exemple E/ Le Rf est caractéristique de certaines substances QCM 23 : Electrophorèse : On réalise une électrophorèse à pH 10 d’un mélange de tyrosine, d’acide aspartique et d’arginine. Quelle sera la migration obtenue ? A/ (pole +) Asp, Arg, Tyr (pole -) B/ (pole +) Asp, Tyr, Arg (pole -) C/ (pole +) Arg, Tyr, Asp (pole -) D/ (pole +) Arg, Asp, Tyr (pole -) E/ (pole +) Tyr, Asp, Arg (pole -) © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 35
  • 36. QCM 24 : Calcul de rendement : Après une étape de broyage d’un extrait brut de cerveau de bœuf (à l’aide d’un appareil de Potter) le rendement est de 80%, on effectue une ultracentrifugation à l’issue de laquelle le rendement est de 60%, puis une séparation chromatographique difficile (rendement de 50%). Si dans l’extrait brut on avait au départ 200 mg de protéines nous obtiendrons au final : A/ 96 mg de protéines B/ 160 mg de protéines C/ 48 mg de protéines D/ 25 mg de protéines E/ 0,048 g de protéines QCM 25 : Calcul de rendement : Après le broyage d’un extrait brut de foie de rat à l’aide d’un appareil de Potter dont le rendement est de 90%, on effectue une première centrifugation à l’issue de laquelle la perte est de 10% puis une ultracentrifugation au rendement de 50%, une séparation chromatographique dont le rendement est de 80% est effectuée, puis enfin une dernière technique où la perte de rendement est de 20%. En cours d’expérimentation la température a entraîné, à la suite d’une légère modification de la configuration, une perte de l’activité biologique d’environ 65%. Si dans l’extrait brut il y avait au départ 600 mg de protéines, nous obtiendrons à l’issue de l’ultracentrifugation : A/ 155,52 mg de protéines B/ 486 mg de protéines C/ 150 mg de protéines D/ 390 mg de protéines E/ 243 mg de protéines QCM 26 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. La glycine est le plus petit acide aminé. B. Il n’existe pas d’acide aminé apolaire cyclique. C. Une protéine est un enchaînement d’acides aminés (plus de 100) liés par des liaisons peptidiques. D. Si on a une séquence de 10 acides aminés, il existe 2010 possibilités de protéines, d’où la notion d’immense potentiel informationnel des protéines. E. Les acides aminés polaires comme la Leucine (Leu) sont généralement retrouvés à l’extérieur de la protéine. QCM 27 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. Toutes les protéines n’ont pas une structure quaternaire. B. L’hémoglobine humaine est une structure volumineuse comprenant 4 chaînes associées dont chacune est liée à un hème qui comprend 1 atome de Mg. C. La structure secondaire résulte de la géométrie dans l’espace des liaisons peptidiques et des radicaux. D. Les ponts disulfures entre deux Lysines (Lys) stabilisent la molécule. E. La myoglobine comme l’hémoglobine sont des protéines héminiques. QCM 28 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. Les protéines ont généralement plus de 100 acides aminés dans leur composition donc un poids moléculaire supérieur à 100. B. L’Asparagine (Asn) est un acide aminé polaire acide. C. Un acide aminé a une fonction amine (NH2 ) et acide (COOH) sur le carbone β. D. Les acides aminés apolaires interagissent peu avec l’eau au pH physiologique et sont donc généralement retrouvés à l’extérieur des protéines. E. La Lysine (Lys) est un acide aminé polaire basique. QCM 29 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. Les gènes, dont le nombre est estimé entre 30 000 et 50 000, codent pour autant d’ARNm. B. Le plus petit des acides aminés appartient à la familles des acides aminés apolaires qui ont peu tendance à interagir avec l’eau au pH physiologique. C. Depuis 2001, le programme génome humain a permis d’identifier tous les gènes ainsi que leur fonction. D. Le Fer et le Zinc entrent dans la structure respectivement de l’insuline et de l’hémoglobine. E. La molécule d’ADN est constituée d’une continuité de séquences codantes. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 36
  • 37. QCM 30 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. 7,42 est la valeur de référence du pH physiologique de l’estomac. B. La Proline est un imino-acide qui peut entraîner une coudure des séquences d’acides aminés. C. C’est l’atome de soufre de la Méthionine qui forme des pont disulfures. D. La Sérine, la Glycine et la Thréonine sont des acides aminés polaires neutres. E. La structure quaternaire de la myoglobine correspond à la juxtaposition de plusieurs sous-unités protéiques. QCM 31 : Parmi les acides aminés suivants, le(s)quel(s) est (sont) hydrophobe(s) ? A. Ser B. Trp C. Thr D. Ile E. Lys QCM 32 : A propos de la chromatographie sur résine échangeuse d’ions : A. Elle sépare les produits en fonction du poids moléculaire. B. Les échangeuses de cations retiennent les molécules chargées négativement. C. Sur les échangeuses d’anions, les molécules éluées sont celles qui sont chargées +. D. Elle permet de séparer les molécules en fonction de leur pHi. E. Le support d’une échangeuse d’anion est faite de carboxyméthyl cellulose. QCM 33 : A propos des techniques en général : A. La chromatographie d’affinité joue sur les interactions spécifiques entre 2 molécules comme antigène/anticorps par exemple. B. Les méthodes de chromatographie peuvent avoir un but analytique ou préparatif. C. Le résultat d’une chromatographie d’adsorption peut être visualisé grâce à des produits radioactifs. D. Quelle que soit la technique utilisée les notions de rendement et de dénaturation sont intimement liées. E. La chromatographie hydrophobe joue sur le caractère polaire ou apolaire des produits. QCM 34 : Concernant la chromatographie par élution ou de partage sur papier : A. Les 2 phases en présence sont liquides et miscibles. B. Elle peut être ascendante ou descendante. C. Le rapport frontal (Rf) est caractéristique du produit analysé. D. Elle se fait par transfert d’une substance d’une phase liquide (mobile) vers une phase liquide (fixe). E. Elle sépare les produits en fonction de leur charge. QCM 35 : Concernant la chromatographie d’exclusion-diffusion : A. Elle sépare les produits en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire. B. Les premières molécules sont récupérées dans le volume mort. C. Le volume d’élution est inversement proportionnel à la taille de la molécule. D. Avec un mélange de protéines et de peptides, les protéines sortent en premier. E. Avec un mélange de protéines et de peptides, les peptides sortent en premier. QCM 36 : On réalise une gel-filtration d’un mélange de protéines et de peptides : P1(PM=5 000), P2 (PM=390 000), P3 (PM=24 000), P4 (PM=100 000), P5 (PM=86 000). Quel sera l’ordre d’élution (en commençant par le premier sorti de la colonne) ? A. 1,3,5,4,2 B. 2,4,3,5,1 C. 1,5,3,4,2 D. 2,4,5,3,1 E. 1,2,3,4,5 © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 37
  • 38. QCM 37 : On réalise une électrophorèse à pH 3 d’un mélange d’arginine, d’acide aspartique et d’asparagine. Quelle sera la migration obtenue en partant de l’anode vers la cathode ? A. Arg, Asn, Asp B. Asp, Arg, Asn C. Asp, Asn, Arg D. Asn, Asp, Arg E. Arg, Asp, Asn QCM 38 : Au sujet de la densité optique: A. Les protéines absorbent à une DO de 270 nm. B. Les bases puriques absorbent à 260 nm. C. Les bases pyrimidiques absorbent à 280 nm. D. Une unité de DO à 260 nm d’ARN correspond à 40 μg/mL. E. La recherche de contamination des acides nucléiques par des protéines peut s’effectuer en mesurant le rapport DO à 260 nm sur DO à 280 nm. QCM 39 : Au sujet des techniques d’extraction : A. Le phénol permet l’extraction des acides nucléiques en précipitant les protéines. B. Suite à l’extraction au phénol, les acides nucléiques se retrouvent dans la phase aqueuse c’est-à-dire la phase inférieure. C. Le chloroforme permet l’extraction du bromure d’éthidium. D. L’isopropanol permet la précipitation des acides nucléiques. E. Le phénol est extrait par un mélange de chloroforme-éther à volume équivalent. QCM 40 : Après une étape de broyage de foie de souris à l’aide d’un appareil de Potter dont le rendement est de 80%, on effectue une centrifugation dont la moitié de la préparation est éliminée. Ensuite, on effectue une ultracentrifugation pour laquelle le rendement est de 70%. Enfin, on réalise une électrophorèse dont le rendement est de 50%. Si dans l’extrait final, on obtient 70 mg de protéines, combien avions-nous de protéines en mg dans l’extrait initial ? A. 350 mg de protéines B. 980 mg de protéines C. Environ 10 mg de protéines D. 500 mg de protéines E. 380 mg de protéines QCM 41 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. Les protéines ont des propriétés variées : physiques, chimiques, antigéniques… B. Des anticorps peuvent être dirigés contre certains motifs antigéniques de la protéine que l’on appelle paratopes. C. Deux protéines différentes ne peuvent pas posséder un même motif antigénique. D. Les holoprotéines sont composées de 96% à 100% d’acides amines. E. Les hétéroprotéines sont composées d’une partie protéique appelée apoprotéine qui ne contient que des acides aminés, et d’une partie non protéique appelée groupement prosthétique qui n’est composée que de traces de métaux. QCM 42 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. Les albumines et les globulines sont solubles dans les solutions salines. B. Les protéines globulaires, telles les immunoglobulines, ont leur rapport D/d supérieur à 10. C. La fraction sub-cellulaire contenant les protéines à étudier peut être isolée par des produits comme le Triton X100 ou le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate). D. La dialyse/filtration utilise des membranes semi-perméables. E. La lyophilisation, aussi appelée « déshydratation à froid », permet de concentrer et de conserver les protéines. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 38
  • 39. QCM 43 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. Le phénol entraîne la précipitation des protéines tandis que les acides nucléiques se retrouvent dans la partie supérieure non-soluble. B. Le phénol est ensuite extrait par du chloroforme ou par un mélange chloroforme/éther. C. Le bromure d’éthidium est extrait par l’isopropanol. D. Les acides nucléiques précipitent en présence d’alcool éthylique (à force ionique élevée) ou d’isobutanol. E. Le sel pouvant être néfaste à la suite de l’expérimentation, on utilise plutôt l’isobutanol pour précipiter les acides nucléiques. QCM 44 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ? A. Le collagène est un exemple de protéine fibrillaire. B. Les lipoprotéines peuvent être séparées par ultracentrifugation ou par séparation électrique. C. La purification des protéines ne nécessite pas l’observance de conduites opératoires strictes. D. L’utilisation de solutions salines à différentes concentrations n’ayant aucune utilité pour séparer ou isoler des protéines ou des acides nucléiques, on utilise préférentiellement des solvants sans sel. E. Une unité de densité optique à 260 nm peut correspondre à du DNA double brin ayant une concentration de 50 μg/ml. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 39
  • 40. Correction QCM 1 : D A/ ADN nucléaire + ADN mitochondrial B/ Au moins un rôle dans la régulation C/ Beaucoup plus de protéines que de gènes. En effet un même gène peut donner des ARNm différents et des protéines différentes selon le type cellulaire et le temps [modifications post-transcriptionnelles (ex : épissage alternatif ou phénomène d’édition) et post-traductionnelles]. E/ Le génome est le même dans toutes les cellules nucléées de l’organisme ! Par contre ces gènes ne sont pas exprimés de la même façon selon le type cellulaire ou le temps donc c’est le protéome des cellules qui diffère selon le type cellulaire et le temps. QCM 2 : CDE QCM 3 : D QCM 4 : BCDE A pH 2 Asp est neutre, Val, Leu et Met sont chargés positivement et Arg est chargé très positivement. Val, Leu, Met et Arg sont ici des cations donc seront retenus dans ce type de colonne. Attention parfois le pHi (pH auquel la charge électrique globale est nulle) de chaque acide-aminé est précisé ! Dans ce cas là il faudra être précis : tous les acides aminés dont le pHi sera supérieur au pH de la solution seront chargés positivement et tous les acides aminés dont le pHi sera inférieur seront chargés négativement, pour être neutre l’acide aminé devra avoir son pHi égal au pH de la solution, tout cela pourrait changer certaines réponses… QCM 5 : BD A/ L’acide iminé ou imino-acide est la proline C/ Ce sont les acides aminés polaires qui sont acides, neutres ou basiques. Les apolaires sont tous neutres au pH physiologique. E/ Non car ils peuvent avoir d’autres fonctions amines ou acides dans leur radical. Toutefois ils ont tous au moins une fonction amine et une fonction acide sauf la proline qui est un imino-acide [une fonction imine (NH) et une fonction acide]. QCM 6 : AB Glu est acide, Arg est basique, les autres sont neutres. QCM 7 : ABC QCM 8 : CD QCM 9 : BCDE A pH 10 His est neutre, les autres (Gly, Ser, Cys, Asp) sont chargés négativement. Ces derniers sont donc des anions et ne seront pas retenus dans une chromatographie échangeuse de cations, ils seront élués. Notez que si on nous avait demandé lesquels étaient élués en premiers il aurait fallu répondre Asp seulement car en tant qu’acide aminé normalement acide Asp est ici chargé très négativement comparé à Gly, Ser et Cys. QCM 10 : ABCDE D/ Vrai : 9 apolaires et 6 polaires neutres © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 40
  • 41. QCM 11 : ABCE A/ Oui, il n’y a jamais de ramifications d’acides aminés ! D/ Non, les protéines qui ont une structure quaternaire sont celles composées de plusieurs sous-unités (plusieurs enchaînements polypeptidiques). QCM 12 : BCDE A/ 20 puissance 10 soit 10 240 000 000 000 possibilités différents !!!!! Imaginez alors pour des protéines de plusieurs milliers d’acides aminés…⇒ potentiel informationnel énoooorme ! QCM 13 : C Aucune difficulté dans ce genre d’exercice, les professeurs proposant normalement toujours 1 acide aminé acide, 1 basique et 1 neutre. Du coup la mention du pH dans l’énoncé n’a aucune importance. L’acide aminé acide (anion) va toujours vers le pôle + (anode), l’acide aminé basique (cation) va toujours vers le pôle – (cathode) et l’acide aminé neutre se trouve entre les deux autres. QCM 14 : CE A/ Ce sont les hétéroprotéines B/ « Albumines » et « globulines » sont des termes qui correspondraient à une classification selon la solubilité des protéines ! Selon la forme ⇒ « globulaires » ou « fibrillaires ». Attention à ne pas confondre globulines et globulaires !! D/ Non les protéines globulaires ont plutôt un rôle biologique. Ce sont les protéines fibrillaires (ex : le collagène) qui ont un rôle de protection, de soutien. QCM 15 : BE Pour répondre à ce genre de questions sans problème il serait bienvenue de retenir parfaitement l’expérience de « l’extraction phénolique des acides nucléiques » ! A/ Les acides nucléiques sont solubles dans l’eau pure ou dans les solutions aqueuses salées à faible concentration B/ Le phénol peut aussi être extrait par le chloroforme seul C/ L’isoPRopanol permet la PRécipitation des acides nucléiques (pas besoin de sels contrairement à l’éthanol). C’est l’isoButanol qui permet d’extraire le Bromure d’éthidium. D/ Les acides nucléiques sont précipités par l’isopropanol ou par le mélange éthanol + sels E/ Les protéines sont solubles dans les solvants organiques comme le phénol (+++), le chloroforme ou l’éther et plus ou moins solubles dans l’eau (cf. albumines et globulines). Notez que des protéines sont précipitées par les solutions aqueuses salées à forte concentration (cf. item 8-E du concours blanc de novembre 2005). QCM 16 : ACDE B/ La taille supérieure des protéines fait au contraire migrer celles-ci plus vite car elles sont trop grosses pour être accrochées par les mailles du gel E/ Vrai car la vitesse de descente des protéines dans la colonne est directement liée à leur taille ou poids moléculaire (PM) QCM 17 : ABD C/ Gène ---transcription---> ARNm ---traduction---> protéine E/ Cette définition correspond aux globulines. Les albumines sont solubles dans l’eau et dans les solutions salines. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 41
  • 42. QCM 18 : C A pH 5 seul Glu est chargé négativement (anion), les autres (Asn, Lys, Pro, Phe) sont tous chargés positivement. S’agissant d’une chromatographie échangeuse d’anions, ce sont les anions qui seront retenus par le gel c’est-à-dire Glu. Tous les autres seront élués ! Mais ici on demande le(s) premier(s) à être élué et ce sera l’acide aminé chargé très positivement c’est-à-dire la Lysine qui est un acide aminé basique alors que les autres (Asn, Pro, Phe) sont seulement neutres au pH physiologique. QCM 19 : E QCM 20 : AE B/ Les acides nucléiques absorbent à 260 nm C/ Le rapport DO à 280 nm sur DO à 260 nm correspond au rapport protéines sur acides nucléiques (AN). S’il était de 1,8 - 2 cela signifierait qu’il y a 2 fois plus de protéines que d’AN et donc qu’il y a contamination. Pour être optimal le rapport doit être d’environ 0,5 soit 2 fois plus d’AN que de protéines. S’il est supérieur à 0,5 cela signifie qu’il y a contamination (trop de protéines). Par contre si le rapport est DO à 260 nm sur DO à 280 nm, le résultat optimal est effectivement de 1,8 – 2. Si le rapport est inférieur à 1,8 cela montrerai une contamination de la solution d’AN par les protéines. D/ 270 nm QCM 21 : ABCDE Ici la solution est tellement acide (pH 1) que tous les acides aminés seront chargés positivement. Ce sont des cations et ils seront donc élués dans une chromatographie échangeuse d’anions. Notez que si on nous avait demandé lesquels étaient élués en premiers il aurait fallu répondre His et Arg car ils sont déjà basiques à l’origine donc encore plus chargés positivement (viennent ensuite Ala et Tyr, le dernier à être élué serait Asp car c’est le plus faiblement chargé positivement). QCM 22 : ACDE B/ Les deux phases sont liquides ! Effectivement l’une est fixée et l’autre mobile et elles sont non miscibles. QCM 23 : B QCM 24 : CE Je ne vais pas vous faire l’offense de vous réapprendre les calculs de pourcentages… Sachez seulement que pour vos calculs vous pouvez utilisez les différents pourcentages dans l’ordre que vous voulez, le résultat final restera identique. Toutefois il existe de nombreux pièges : calculer l’extrait final ou l’extrait de départ ? calculer l’extrait final ou l’extrait après la 2ème ou la 3ème étape seulement ? Calculer le poids de protéines ou l’activité biologique ? Faîtes donc bien attention à la dernière phrase notamment ! Attention aussi à l’énoncé : « à l’issue de laquelle le rendement est de 60% » est différent de « à l’issue de laquelle la perte est de 60% » car dans le dernier cas le rendement n’est alors que de 40% !! Pour finir soyez bien vigilants sur les unités des différentes réponses ! QCM 25 : E 600*90% = 540 540-10% = 540-54 = 486 486*50% = 243 QCM 26 : ACD B. La Proline E. La Leucine est apolaire © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 42
  • 43. QCM 27 : AE B. 1 atome de Fer C. Structure tertiaire D. Entre 2 Cystéines QCM 28 : E A. PM supérieur à 10 000 B. Polaire neutre C. Carbone α D. A l’intérieur QCM 29 : B A. Plus d’ARNm C. On ne connaît pas tous les gènes et encore moins la fonction de tous D. L’inverse E. Il y a des séquences poubelles non codantes QCM 30 : B A. pH très acide dans l’estomac B. Vrai car structure cyclique C. Entre 2 Cystéines D. Pas la Glycine (apolaire) E. Pas de structure quaternaire pour la myoglobine QCM 31 : BD QCM 32 : CD A. Sépare les produits en fonction de leur charge B. Echangeuses de cations => résine chargée – donc retient les molécules chargées + E. Support d’une échangeuse d’anions est du DEAE cellulose QCM 33 : ABCDE QCM 34 : BCD A. Les 2 phases sont liquides et non miscibles. E. Sépare les produits en fonction de leur solubilité. QCM 35 : ACD B. On ne récupère rien dans le volume mort. E. Les peptides sortent en dernier. QCM 36 : D Les protéines de plus gros PM sortent en premier et les plus petits peptides sortent en dernier donc : l’ordre d’élution sera P2,P4,P5,P3,P1. QCM 37 : C (pôle +) Asp Asn Arg (pôle -) pHi(Arg) >> pH donc il est le plus positif des 3 donc migrera le plus vers le pôle - c’est-à-dire la cathode. QCM 38 : BDE A. Les protéines absorbent à 280 nm, le phénol absorbe à 270 nm. C. Les acides nucléiques absorbent à 260 nm que ce soient des bases puriques ou pyrimidiques. D. L’ARN est simple brin donc 1 DO à 260 nm correspond à 40 μg/mL. E. Contamination des Acides nucléiques / Protéines  DO [Acides nucléiques] / DO [Protéines] © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 43
  • 44. QCM 39 : ADE B. La phase aqueuse correspond à la phase supérieure. La phase inférieure comprendra le phénol avec les protéines. C. Le bromure d’éthidium est extrait par l’isobutanol. Le chloroforme sert à extraire le phénol. QCM 40 : D Attention à ne pas lire trop vite l’énoncé. Faire attention si la quantité donnée est celle du départ, de l’arrivée ou après une étape. Etre attentif au résultat demandé : quantité de départ, quantité d’arrivée ou quantité après un certain nombre d’étapes. De plus, ne pas confondre 70% de rendement et le fait que 70% de la préparation est éliminé, par exemple. Soit x, la quantité de protéines au départ. Calcul : x = 500 mg de protéines QCM 41 : AD B. Ces motifs antigéniques sont appelés « épitopes ». Les « paratopes » sont les sites des anticorps qui reconnaissent un épitope. C. Deux protéines différentes peuvent avoir le même motif antigénique (épitope), ce qui aboutit à des réactions croisées ; l’anticorps dirigé contre cet épitope reconnaîtra les deux protéines. E. Le groupement prosthétique ne contient pas que des traces de métaux, il peut contenir d’autres molécules comme des lipides ou des glucides par exemple. De plus, on peut trouver des traces de métaux dans les holoprotéines (de l’ordre de 0 à 4%). QCM 42 : ADE B. Leur rapport D/d est inférieur à 10, ce qui explique qu’elles aient une forme plutôt globulaire. C. Le Triton X100 et le SDS sont des détergents que l’on utilise pour solubiliser l’extrait tissulaire qui contient les protéines que l’on désire étudier. La fraction sub-cellulaire est, elle, isolée grâce à des centrifugations différentielles. QCM 43 : B A. Les acides nucléiques se retrouvent dans la phase supérieure soluble tandis que les protéines précipitent dans la phase inférieure contenant du phénol. C. Il est extrait par l’isobutanol. D. En présence d’alcool éthylique (+ sels) ou d’isopropanol. E. On utilise l’isopropanol qui précipite les acides nucléiques sans avoir besoin de sel. QCM 44 : ABE C. Au contraire, c’est indispensable pour une bonne purification. D. L’utilisation de solutions salines à différentes concentrations permet une précipitation/solubilisation différentielle des acides nucléiques par exemple. Elle peut donc être utile. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 44
  • 45. NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES 43 QCM Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants : A/ thymidine B/ adénosine tri-phosphate (ATP) C/ cytosine D/ uridine E/ désoxyguanosine QCM 1 : Le(s)quel(s) est (sont) un (des) nucléoside(s) ? QCM 2 : Le(s)quel(s) contien(nen)t une liaison N-osidique entre le désoxyribose et la base pyrimidique ? QCM 3 : Le(s)quel(s) constitu(en)t une forme chimique de réserve d’énergie ? Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants : A/ désoxyadénosine B/ cytidine C/ uracile D/ hypoxanthine E/ guanosine QCM 4 : Le(s)quel(s) a (ont) un noyau purine ? QCM 5 : Le(s)quel(s) peu(ven)t être métabolisé(s) en acide urique ? QCM 6 : Le(s)quel(s) est (sont) présent(s) dans les tRNA ? Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants : A/ inosine B/ uridine C/ théophylline D/ hypoxanthine E/ méthylcytosine QCM 7 : Le(s)quel(s) est (sont) un (des) nucléoside(s) présent(s) dans les tRNA ? QCM 8 : Le(s)quel(s) inhibe(nt) la cAMP-phosphodiestérase ? QCM 9 : Le(s)quel(s) provien(nen)t de la désamination oxydative d’une adénosine ? QCM 10 : Les antimétabolites : A/ L’allopurinol est un analogue de l’hypoxanthine B/ Le 5-fluoro-uracile est en compétition avec la thymine lors des biosynthèses d’ARN C/ La 6-thiopurine (= 6-mercaptopurine) est un noyau pyrimidique qui a la particularité d’avoir un atome de soufre D/ Les antimétabolites sont tous utilisés pour soigner l’homme car ils dérèglent le fonctionnement des cellules bactériennes (procaryotes) E/ La puromycine mime la structure terminale des tRNA chargés de leur acide-aminé © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 45